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在这里,我们提供了对晚期胚胎 果蝇 雄性性腺进行现场成像所需的解剖方案。该协议将允许在正常条件下或在转基因或药理学操作之后观察动态细胞过程。
黑腹果蝇雄性胚胎性腺是研究发育生物学各个方面的有利模型,包括但不限于生殖细胞发育,piRNA生物学和生态位形成。在这里,我们提出了一种解剖技术,用于在体内实时成像非常无效的时期对性腺进行活体成像。该协议概述了如何将胚胎转移到成像皿中,选择适当分期的雄性胚胎,并在保持其结构完整性的同时从其周围组织中解剖性腺。解剖后,可以使用共聚焦显微镜对性腺进行成像,以可视化动态细胞过程。解剖过程需要精确的时间和灵活性,但我们提供了有关如何防止常见错误以及如何克服这些挑战的见解。据我们所知,这是果蝇胚胎性腺的第一个解剖方案,并且将允许在其他无法进入的时间窗口进行现场成像。该技术可以与药理学或细胞类型的特异性转基因操作相结合,以研究在其自然性腺环境中细胞内或细胞之间发生的任何动态过程。
黑腹果蝇睾丸已成为我们理解许多动态细胞过程的范式。该模型的研究揭示了干细胞分裂调控1,2,3,生殖细胞发育4,5,piRNA生物学6,7,8和利基干细胞信号传导事件9,10,11,12,13。该模型是有利的,因为它在遗传上是可处理的14,15并且是少数我们可以在其自然环境中实时成像干细胞3,
1. 解剖前一天的准备
2. 胚胎采集—解剖前15-17小时
我们在 图1中说明了成像皿的制备,如“解剖日准备”中所述。这些方法最终应导致水合良好的胚胎粘附在盖滑条上,该衬裙暂时固定在培养皿的底部并浸没在Ringer的溶液中(图1F)。金刚石刀允许将22 x 22 mm的盖玻片干净地切成三到四条较小的条(图1A)。在用镊子处理这些条时,我们使用移液器转移足够的庚烷胶来涂覆这些条带.......
在性腺发生期间,胚胎性腺,特别是雄性性腺15内的干细胞位,经历快速的形态变化。这些动态变化背后的发育机制最好通过实时成像技术来理解。然而,在胚胎阶段17,性腺的 体内 成像由于大规模肌肉收缩的发作而变得不可能17。通过该协议,我们提供了一种成功的替代方案:将性腺直接解剖到成像盘上进行 体外 实时成像。该协议是完成晚期胚.......
作者没有什么可透露的。
我们要感谢Lindsey W. Plasschaert和Justin Sui对该协议的早期开发做出的重大贡献。作者感谢苍蝇界对试剂的慷慨解囊,特别是Ruth Lehmann和Benjamin Lin在出版前赠送的 Nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'系列。本研究使用了从布卢明顿果蝇库存中心(NIH P40OD018537)获得的股票。这项工作得到了NIH RO1 GM060804,R33AG04791503和R35GM136270(S.D)以及培训补助金T32GM007229(B.W.)和F32GM125123(L.A.)的支持。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
Diamond-tipped knife | |||
Double-sided tape | Scotch | 665 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
Nytex basket | |||
Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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