晚期胚胎 果蝇 性腺的解剖和活体成像

摘要

在这里，我们提供了对晚期胚胎 果蝇 雄性性腺进行现场成像所需的解剖方案。该协议将允许在正常条件下或在转基因或药理学操作之后观察动态细胞过程。

摘要

黑腹果蝇雄性胚胎性腺是研究发育生物学各个方面的有利模型，包括但不限于生殖细胞发育，piRNA生物学和生态位形成。在这里，我们提出了一种解剖技术，用于在体内实时成像非常无效的时期对性腺进行活体成像。该协议概述了如何将胚胎转移到成像皿中，选择适当分期的雄性胚胎，并在保持其结构完整性的同时从其周围组织中解剖性腺。解剖后，可以使用共聚焦显微镜对性腺进行成像，以可视化动态细胞过程。解剖过程需要精确的时间和灵活性，但我们提供了有关如何防止常见错误以及如何克服这些挑战的见解。据我们所知，这是果蝇胚胎性腺的第一个解剖方案，并且将允许在其他无法进入的时间窗口进行现场成像。该技术可以与药理学或细胞类型的特异性转基因操作相结合，以研究在其自然性腺环境中细胞内或细胞之间发生的任何动态过程。

引言

黑腹果蝇睾丸已成为我们理解许多动态细胞过程的范式。该模型的研究揭示了干细胞分裂调控^1，2，³，生殖细胞发育^4，5，piRNA生物学^6，7，8和利基干细胞信号传导事件^{9，10，11，12，13}。该模型是有利的，因为它在遗传上是可处理的^14，15并且是少数我们可以在其自然环境中实时成像干细胞^3，

研究方案

1. 解剖前一天的准备

1. 电解磨钨针²⁴ ，使得到的直径约为0.03毫米。将供电电压调节至约14 V，并使用3.3 M NaOH。锐化时间不应超过 1 或 2 分钟。
   注意：NaOH具有高度腐蚀性，与皮肤接触会导致灼伤。处理时戴上手套和护目镜，并在通风橱内工作。
   注意：使用后，将NaOH储存在聚丙烯猎鹰管中。
2. 制作准备好的成像介质。在15 mL锥形管中，将4.25 mL施耐德培养基与750μL胎牛血清（FBS，15%终浓度）和27.5μL青霉素-链霉素（0.05 U / μL青霉素，0.05μg/ μL终浓度）混合。将制备的成像培养基储存在4°C。
3. 制作庚烷胶溶液。将约 0.5 mL 庚烷加入装有约 20 cm 双面胶带的 20 mL 可密封小瓶中。在螺母上摇晃约一小时，或用移液器吸头搅拌，直到达到水和甘油之间的稠度。这种溶解胶水的溶液将持续数天，然后庚烷蒸发。为了清新溶液，再加入0.5mL庚烷和岩石。
   注意：可以使用各种比例的庚烷与胶带以及不同的摇摆/搅拌持续时间来制备有效的庚烷胶溶液。上述规格只是准备或清新一种此类适当溶液的建议。

2. 胚胎采集—解剖前15-17小时

1. 将新鲜酵母糊加入苹果汁琼脂盘^25中。通过将成年苍蝇（小于10天大）添加到空食物瓶中来设置胚胎收集笼，并穿....

结果

我们在 图1中说明了成像皿的制备，如“解剖日准备”中所述。这些方法最终应导致水合良好的胚胎粘附在盖滑条上，该衬裙暂时固定在培养皿的底部并浸没在Ringer的溶液中（图1F）。金刚石刀允许将22 x 22 mm的盖玻片干净地切成三到四条较小的条（图1A）。在用镊子处理这些条时，我们使用移液器转移足够的庚烷胶来涂覆这些条带.......

讨论

在性腺发生期间，胚胎性腺，特别是雄性性腺¹⁵内的干细胞位，经历快速的形态变化。这些动态变化背后的发育机制最好通过实时成像技术来理解。然而，在胚胎阶段17，性腺的 体内 成像由于大规模肌肉收缩的发作而变得不可能¹⁷。通过该协议，我们提供了一种成功的替代方案：将性腺直接解剖到成像盘上进行 体外 实时成像。该协议是完成晚期胚.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024