Dissection et imagerie en direct de la drosophile embryonnaire tardive Gonad

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.

Résumé

La gonade embryonnaire mâle Drosophila melanogaster est un modèle avantageux pour étudier divers aspects de la biologie du développement, y compris, mais sans s’y limiter, le développement des cellules germinales, la biologie des piARN et la formation de niches. Ici, nous présentons une technique de dissection pour imager en direct la gonade ex vivo pendant une période où l’imagerie en direct in vivo est très inefficace. Ce protocole décrit comment transférer des embryons dans une boîte d’imagerie, choisir des embryons mâles mis en scène de manière appropriée et disséquer la gonade de ses tissus environnants tout en maintenant son intégrité structurelle. Après dissection, les gonades peuvent être imagées à l’aide d’un microscope confocal pour visualiser les processus cellulaires dynamiques. La procédure de dissection nécessite un timing et une dextérité précis, mais nous fournissons un aperçu de la façon de prévenir les erreurs courantes et de surmonter ces défis. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole de dissection pour la gonade embryonnaire de la drosophile et permettra l’imagerie en direct pendant une fenêtre de temps autrement inaccessible. Cette technique peut être combinée avec des manipulations transgéniques pharmacologiques ou spécifiques au type cellulaire pour étudier tout processus dynamique se produisant à l’intérieur ou entre les cellules dans leur environnement gonadique naturel.

Introduction

Le testicule drosophila melanogaster a servi de paradigme pour notre compréhension de nombreux processus cellulaires dynamiques. Les études de ce modèle ont mis en lumière la régulation^de la division des cellules ^{souches 1,2,3}, le développement des cellules germinales ^4,5, la biologie des arnos ^6,7,8 et les événements de signalisation des cellules souches de niche ^{9,10,11,12,13}. Ce modèle est avantageux car il est génétiquement traitable^14,15 et est l’un des rares où l’on peut imager en direct des cellules souches dans leur environnement naturel ^3,16,17,18. Cependant, l’imagerie en direct de ce modèle a été limitée aux tissus adultes et aux premiers stades embryonnaires, laissant une lacune dans notre connaissance de la dynamique gonadique chez l’embryon tardif, le stade précis où la niche se forme et commence à fonctionner.

La gonade embryonnaire à un stade avancé est une sphère, composée de cellules de niche somatiques à l’antérieure et de cellules germinales enkystées par des cellules gonadiques somatiques dans des régions plus postérieures¹⁹. Cet organe peut être imagé en direct in vivo jusqu’au stade embryonnaire précoce 17 17,20,21. Une imagerie supplémentaire est empêchée en raison de l’initiation de contractions musculaires à grande échelle. Ces contractions sont si graves qu’elles poussent la gonade hors du cadre d’imagerie, et un tel mouvement ne peut pas être corrigé avec un logiciel d’imagerie. Notre laboratoire s’intéresse au dévoilement des mécanismes de formation de niches, qui se produit pendant cette période insaisissable pour l’imagerie en direct. Par conséquent, nous avons généré une approche ex vivo pour imager en direct la gonade à partir du stade embryonnaire 16, facilitant l’étude de la dynamique cellulaire pendant cette période cruciale du développement des gonades. Des travaux antérieurs de notre laboratoire montrent que cette imagerie ex vivo récapitule fidèlement le développement in vivo des gonades¹⁷. Cette technique est la première et la seule du genre pour la gonade embryonnaire de la drosophile.

Nous présentons ici le protocole de dissection requis pour l’imagerie en direct ex vivo de la gonade à la fin du stade embryonnaire. Ce protocole peut être combiné avec des traitements pharmacologiques ou une manipulation transgénique de lignées cellulaires spécifiques dans les gonades. En utilisant cette technique, nous avons photographié avec succès les étapes de la formation de niche de cellules souches¹⁷. Cette approche d’imagerie est donc déterminante pour le domaine de la biologie des cellules souches, car elle permettra de visualiser les premières étapes de la formation de niches en temps réel dans son environnement naturel^15,17. Bien que cette méthode soit bénéfique pour le domaine de la biologie des cellules souches, elle est également applicable pour visualiser tous les processus dynamiques se produisant dans les gonades au cours de ce point temporel de développement, y compris les réarrangements cellulaires²², l’adhésion cellulaire ^2,12,23 et la migration cellulaire²³. Ce protocole de dissection améliorera ainsi notre compréhension de nombreux processus biologiques cellulaires fondamentaux.

Protocole

1. Préparation du jour avant la dissection

1. Affûter électrolytiquement une aiguille en tungstène²⁴ de sorte que le diamètre résultant soit d’environ 0,03 mm. Réglez la tension fournie à environ 14 V et utilisez 3,3 M NaOH. L’affûtage ne devrait pas prendre plus de 1 ou 2 min.
   ATTENTION: Le NaOH est très corrosif et causera des brûlures au contact de la peau. Portez des gants et des lunettes lors de la manipulation et travaillez à l’intérieur d’une hotte aspirante.
   REMARQUE: Après utilisation, stocker NaOH dans un tube Falcon en polypropylène.
2. Fabriquez le support d’imagerie préparé. Dans un tube conique de 15 mL, combiner 4,25 mL de milieu de Schneider avec 750 μL de sérum fœtal bovin (FBS, concentration finale de 15 %) et 27,5 μL de pénicilline-streptomycine (0,05 U/μL de pénicilline, concentration finale de 0,05 μg/μL). Conservez ce support d’imagerie préparé à 4 °C.
3. Faire une solution de colle heptane. Ajouter environ 0,5 mL d’heptane à un flacon scellable de 20 mL bourré de ruban adhésif double face d’environ 20 cm. Balancer sur un nutateur pendant environ une heure, ou remuer avec une pointe de pipette jusqu’à ce qu’une consistance entre celle de l’eau et du glycérol soit atteinte. Cette solution de colle dissoute durera plusieurs jours avant que l’heptane ne s’évapore. Pour rafraîchir la solution, ajoutez 0,5 mL d’heptane supplémentaire et de la roche.
   REMARQUE: Une solution efficace de colle heptane peut être préparée en utilisant différents rapports d’heptane à ruban adhésif, ainsi que des durées variables de bascule / agitation. Les spécifications ci-dessus ne sont que des suggestions pour préparer ou rafraîchir une telle solution adéquate.

2. Collecte d’embryons – 15–17 h avant la dissection

1. Ajouter la pâte de levure fraîche à une assiette de gélose au jus de pomme²⁵. Installez une cage de collecte d’embryons en ajoutant des mouches adultes (âgées de moins de 10 jours) à une bouteille de nourriture vide, perforée de petits trous²⁶. Boucher la cage de collecte à l’aide de la plaque de gélose à levure, scotchée à la bouteille, et placer la cage avec la plaque côté vers le bas dans un incubateur sombre à 25 ° C pendant 1 h.
   REMARQUE: Les mouches doivent exprimer un transgène qui marquera la gonade par fluorescence, par exemple, six4-eGFP::Moesin²⁰, car la dissection des embryons aura lieu sous un microscope stéréo-fluorescent. Voir tableau des matériaux pour une liste des génotypes utilisés pour marquer la gonade.
2. Retirez la cage de l’incubateur et jetez cette première collection. Remplacez-le par une plaque de gélose fraîchement levurenée et replacez la cage dans l’incubateur pendant 2 h.
   REMARQUE: La première collection d’embryons est utilisée pour débarrasser les femelles des embryons fécondés et en développement, afin d’obtenir une deuxième collecte d’embryons étroitement chronométrée.
3. Retirez la plaque de gélose de la cage et placez-la (avec le côté levure tourné vers le haut) sur une serviette en papier humide à l’intérieur d’un récipient en plastique scellable. Placez cette chambre humide dans un incubateur à 25 °C pour vieillir les embryons pendant 14,5 h (âges finaux, 14,5 à 16,5 h après la ponte).
   REMARQUE : Immédiatement avant de commencer l’étape 2.4, terminez les étapes 3.1 et 3.2.
4. Retirez la plaque de gélose de l’incubateur et, à l’aide d’une bouteille de gicleurs, ajoutez suffisamment d’eau à la plaque de gélose pour dissoudre la pâte de levure en brossant légèrement avec un pinceau. Rincez les embryons et la levure dissoute dans un petit panier en maille assis à l’intérieur d’un bateau de pesée. Rincez le panier avec la bouteille d’eau jusqu’à ce que la plupart de la pâte de levure ait filtré à travers la maille.
5. Retirez l’eau du bateau de pesée et replacez le panier à l’intérieur. Déchorionate les embryons en les immergeant dans une solution d’eau de Javel à 50%, à l’aide d’un flacon de gicleurs. La solution d’eau de Javel doit avoir une profondeur de 3 à 5 mm. Gardez les embryons immergés dans de l’eau de Javel pendant environ 2 minutes, avec des tourbillons occasionnels.
   ATTENTION : L’eau de Javel est corrosive et peut irriter ou endommager les yeux et les voies respiratoires. Portez des gants et des lunettes lorsque vous manipulez de l’eau de Javel.
   REMARQUE: Pendant ce temps, complétez autant que possible l’étape 3.3. La progression de la décchorionation peut être vérifiée en plaçant le panier sous un stéréomicroscope et en vérifiant l’absence des appendices dorsaux. Immergez les embryons dans la solution d’eau de Javel pendant plus de temps, si nécessaire.
6. Jetez l’eau de Javel et rincez soigneusement les embryons à l’intérieur du panier avec de l’eau d’un flacon à gicler (pendant environ 3 s, en épongeant le panier en filet avec des serviettes en papier; répétez 2 à 3 fois).

3. Préparation du jour de la dissection

1. Ajouter 30 μL d’insuline (10 mg/mL) à 1 500 μL de milieux d’imagerie préparés (voir étape 1.2) dans un tube d’Eppendorf de 1,5 mL (concentration finale de 0,2 mg/mL). Bien mélanger et laisser le tube sur la paillasse pour l’équilibrer à la température ambiante.
2. Préparez des bandes de couverture recouvertes de colle.
   1. Utilisez un couteau à pointe de diamant pour couper un couvercle de 22 mm x 22 mm en quatre bandes de taille égale (Figure 1A).
   2. Utilisez des pinces pour ramasser une bande et étaler un total d’environ 30 μL de solution de colle heptane sur les deux côtés de la bande (figure 1B). Pour obtenir une couche uniforme de résidus de colle, inclinez la bande à différents angles pendant que l’heptane s’évapore.
   3. Rangez la bande recouverte de colle dans une fente vide d’une boîte à couvercles; pour maintenir son adhérence, placez la bande en position inclinée, mais verticale, en vous appuyant contre les bords de la boîte pour minimiser le contact avec les surfaces de la boîte (Figure 1C). Fermez la boîte de manière à ce que les particules à l’air ne recouvrent pas la colle et diminuent son adhérence.
3. Placez les éléments suivants sur la paillasse : une pipette Pasteur en verre de 6 pouces, une lame de microscope, un pipetteur P200 et P1000 avec les embouts de pipette appropriés, la solution²⁷ de Ringer (pH ajusté à 7,3 avec NaOH) et un plat d’imagerie de 35 mm recouvert de poly-D-lysine.
4. Transférez les embryons du panier d’écran en maille vers un petit verre de montre rempli d’heptane de 500 à 750 μL.
   1. Épongez les côtés et le fond du panier à sec avec une lingette en papier. Humidifiez un pinceau dans l’heptane, touchez le pinceau aux embryons (la membrane hydrophobe de vitelline doit adhérer aux poils) et replongez le pinceau dans l’heptane dans le verre de la montre (les embryons doivent couler au fond).
      REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées le plus rapidement possible pour éviter que les embryons ne se dessèchent. Les embryons ne doivent pas être exposés à l’air pendant plus de 20 s.
5. Transférer les embryons sur la lame du microscope à l’aide d’une pipette Pasteur (Figure 1D). Aspirez lentement les embryons dans la pipette et limitez-les à la partie étroite de la pipette. Pipettez lentement les embryons sur la glissière, de sorte qu’ils s’agrègent juste à l’intérieur de l’extrémité de la pipette avant de s’écouler sur la glissière. Tournez le coin d’une lingette de tissu en une pointe fine et évacuez l’heptane des embryons sur la lame. Ils s’agrègeront et couvriront une plus petite surface, ce qui facilitera leur capture sur une bande recouverte de colle à l’étape suivante.
6. À l’aide d’une pince, ramassez une bande recouverte de colle et touchez-la doucement aux embryons (Figure 1E). Placez la bandelette dans la boîte d’imagerie, côté embryon vers le haut et juste à l’extérieur du centre revêtu de poly-D-lysine. Appuyez sur la bande sur le plat à l’aide d’une pince pour vous assurer qu’elle est fixée en place. Inonder immédiatement le plat avec 2–3,5 mL de solution de Ringer; immerger d’abord les embryons pour les empêcher de se dessécher (Figure 1F).

4. Dissection

REMARQUE: Ces étapes doivent être effectuées sous un microscope stéréo-fluorescent.

1. Dévitiniser 10 à 15 embryons.
   REMARQUE: Cela peut aller de deux embryons, pour les débutants, à quinze embryons, pour les experts.
   1. Sélectionnez les embryons de stade 16 en fonction de la morphologie intestinale (Figure 2). À ce stade, les embryons ont trois constrictions intestinales qui créent quatre segments intestinaux empilés (Figure 2B,B'). Pour commencer la dévittellinisation, percez l’embryon sélectionné à une extrémité, de préférence antérieure, avec l’aiguille de tungstène. L’embryon peut sortir de sa membrane vitelline, mais sinon, décoller la membrane de l’embryon.
      REMARQUE : Les embryons trop jeunes pour être disséqués ont des intestins non régionalisés (Figure 2C). La dissection d’embryons de stade 17 est possible, mais plus difficile que la dissection d’embryons de stade 16 car la cuticule commence à se développer à ce stade. Les embryons de stade précoce 17 présentent quatre segments intestinaux qui sont décalés les uns par rapport aux autres (Figure 2D,D').
   2. Accrochez l’aiguille à travers l’embryon dans une région éloignée des gonades. Transférez l’embryon crochu dans la région enrobée de polylysine du plat (à partir de là, appelée simplement « glissement de couverture ») et faites-le glisser contre le fond jusqu’à ce qu’il adhère. Répétez ces étapes et disposez les embryons dévitiinisés en rangée le long du haut du couvercle recouvert de polylysine (Figure 3A), en laissant beaucoup d’espace en dessous pour une dissection plus poussée.
      REMARQUE: Les gonades apparaissent comme de petits agrégats sphériques de cellules qui devraient fluorescence brillamment, en fonction du marqueur spécifique utilisé et du nombre de copies transgéniques. À ce stade, les gonades sont situées latéralement dans le segment A5, à environ 70% à 80% de la longueur de l’embryon de l’avant. Tout au long du protocole de dissection, le tissu peut coller à l’aiguille. Pour débarrasser l’aiguille des débris, soulevez-la juste au-dessus de la surface de la solution de Ringer. La dévitinisation peut être désordonnée tant que la gonade proprement dite est perturbée le moins possible.
2. Affiner les gonades hors de l’embryon et sur le plat (Figure 3C,D).
   1. Tout d’abord, filez l’embryon pour exposer son intérieur (Figure 3C). Trancher l’embryon à partir de son centre, en déplaçant l’aiguille postérieurement, entre les gonades. Taquinez un peu de tissu interne, car cela collera au plat beaucoup mieux que la cuticule externe. L’adhérence du tissu permettra aux manipulations suivantes de révéler la gonade et de lui permettre d’adhérer au glissement de couverture.
      REMARQUE: Si le tissu ne colle pas au plat, essayez de l’amadouer dans une région non contaminée du couvercle enduit; les parties extérieures du couvercle seront particulièrement collantes. Comme indiqué à l’étape 4.1.2, peu importe si les manipulations de dissection entraînent une carcasse d’embryon mutilée, tant que les gonades restent indemnes.
   2. Utilisez l’aiguille pour trancher autour d’une gonade jusqu’à ce qu’un morceau de tissu, y compris la gonade, soit séparé de la carcasse restante. Avec l’aiguille, aspirez ce tissu dans une région fraîche de couvercle enduit et amadouez-le contre le fond jusqu’à ce qu’il adhère au plat.
      REMARQUE: La meilleure imagerie sera obtenue pour les cas où la gonade elle-même se fixe directement au glissement de couverture, plutôt que la fixation indirecte via un tissu sus-jacent. Par conséquent, lorsque le tissu est guidé loin de la carcasse, essayez de faire glisser la gonade avec la couverture en premier, plutôt que des tissus étrangers.
   3. Retirez autant de tissus environnants de la gonade que possible (figure 3D) en faisant glisser doucement le tissu adhérent loin de la gonade avec l’aiguille. Évitez de toucher directement la gonade, ce qui l’endommagerait (Figure 4E). Pour vous assurer que la gonade adhère suffisamment au plat, déplacez l’aiguille dans un mouvement circulaire doux autour de la gonade – si elle bouge, touchez l’aiguille sur le tissu adhérent restant et dirigez la gonade vers une région fraîche de glissement de couverture collante. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de mouvement détectable de la gonade.
   4. Retournez à la carcasse de l’embryon et disséquez la deuxième gonade. Répétez ce processus sur autant d’embryons que possible, mais ne dépassez PAS 25 min. La viabilité des tissus sera compromise dans la solution de Ringer après plus de ~ 40-45 min.
3. Une fois les dissections terminées, utilisez un marqueur indélébile pour ajouter des marques d’enregistrement sur le bord extérieur de la antenne parabolique afin d’enregistrer son orientation pendant la dissection.
4. Retirez la bande enduite de colle du plat.
   1. Insérez doucement la pince inférieure d’une paire de pinces sous la bande, fermoir et inclinez lentement la bande vers le haut pour la libérer du plat avec le moins de glissement possible de la solution de Ringer pour minimiser la perturbation des gonades adhérentes.
      REMARQUE: La bande doit être inclinée loin des gonades disséquées.
5. Portez doucement la parabole au microscope d’imagerie de manière à éviter le glissement de la solution de Ringer.

5. Imagerie

1. Placez la parabole d’imagerie dans le porte-scène, en utilisant les marques d’enregistrement pour placer la parabole dans l’orientation approximative comme lors de la dissection. À l’aide de la microscopie à fond clair et d’un objectif de faible puissance (~ 10x), identifiez et mettez au point tout morceau de tissu qui adhère au bordereau de couverture. Changez les réglages de l’oculaire pour révéler la fluorescence et, à l’aide des oculaires binoculaires, scannez systématiquement la parabole, en marquant la position de chaque gonade dans le logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE: Assurez-vous que les gonades sont centrées dans le champ de vision avant de marquer les positions.
2. Retirez délicatement l’ensemble du porte-scène, avec la parabole d’imagerie dans son support, et placez l’ensemble sur l’établi.
3. Remplacez la solution de Ringer par le milieu d’imagerie préparé contenant de l’insuline (voir les étapes 1.2 et 3.1).
   1. Utilisez un P1000 pour retirer toute la solution de Ringer du rebord supérieur intérieur de la parabole d’imagerie (ne pipettez pas Ringer’s de la zone de glissement du couvercle central). Ensuite, passez à un P200 et placez sa pointe juste sous la surface des sonneurs restants dans la région centrale. Retirer délicatement 50–100 μL de Ringer' s; ne supprimez PAS toute la solution.
   2. Dessinez environ 200 μL de supports d’imagerie et, en plaçant à nouveau la pointe P200 juste sous la surface des sonneurs restants, ajoutez lentement ce support d’imagerie. Ensuite, ajoutez le support d’imagerie restant (~1 300 μL) à la parabole, en commençant par le bord le plus externe du rebord supérieur. Pendant le pipetage, dirigez-vous vers le dôme central du fluide et fusionnez éventuellement les deux en brossant la pointe de la pipette sur les deux. Placez le couvercle sur le plat.
      REMARQUE : Le support d’imagerie doit couvrir tout le diamètre intérieur de la parabole, avec une profondeur d’environ 2 mm, pour éviter l’évaporation (Figure 4D).
4. Passez le microscope à un objectif de puissance plus élevée (63x, 1,2 NA), appliquez le fluide d’immersion approprié en fonction de l’objectif utilisé (type de fluide d’immersion et indice de réfraction requis par l’objectif), puis remplacez l’ensemble du porte-scène. Utilisez la microscopie à fond clair pour vous concentrer sur les tissus collés au fond de la boîte d’imagerie.
   REMARQUE: Si la scène n’a pas été déplacée, la dernière gonade devrait apparaître une fois que l’objectif est concentré.
5. Parcourez chaque position de gonade marquée et ajustez cette position, si nécessaire. Sélectionnez les gonades à imager en fonction de la clarté de l’image, du sexe des gonades, etc. Personnalisez les paramètres d’imagerie (multicanal, temps d’exposition, intensités laser, incréments de la série Z, time-lapse avec des intervalles appropriés, etc.). Commencez l’imagerie.
   REMARQUE: Les gonades mâles peuvent être identifiées par la présence à la fois d’une niche et, à l’extrémité opposée de la gonade, d’un groupe de petites cellules somatiques très circulaires appelées précurseurs gonadiques somatiques spécifiques aux mâles (msSPG). Si le marqueur fluorescent six4-eGFP::moesin est utilisé, les cellules de niche sont les deuxièmes cellules les plus brillantes de la gonade, la plus brillante étant les msSPG. À ce stade, les gonades femelles n’ont ni niche ni msSPG.

Résultats

Nous illustrons la préparation de la boîte d’imagerie à la figure 1, comme décrit dans « Préparation du jour de la dissection ». Ces méthodes devraient finalement aboutir à des embryons bien hydratés collés à une bande de couverture, qui est temporairement fixée au fond du plat et immergée dans la solution de Ringer (Figure 1F). Un couteau à pointe de diamant permet de trancher proprement un couvercle de 22 x 22 mm glissé en trois à quatre ban...

Discussion

Au cours de la gonadogenèse, la gonade embryonnaire, et en particulier la niche de cellules souches dans la gonade^{mâle 15}, subit des changements morphologiques rapides. Les mécanismes de développement qui sous-tendent ces changements dynamiques sont mieux compris par des techniques d’imagerie en direct. Cependant, au stade embryonnaire 17, l’imagerie in vivo de la gonade est rendue impossible par l’apparition de contractions musculaires à grande échelle¹⁷

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024