דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

Summary

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

Abstract

הגונד העוברי הזכרי Drosophila melanogaster הוא מודל יתרון לחקר היבטים שונים של ביולוגיה התפתחותית, כולל, אך לא רק, התפתחות תאי נבט, ביולוגיה של פירנ"א והיווצרות נישה. כאן, אנו מציגים טכניקת דיסקציה כדי לצלם בשידור חי את ה- gonad ex vivo בתקופה שבה הדמיה חיה in vivo אינה יעילה מאוד. פרוטוקול זה מתווה כיצד להעביר עוברים לצלחת הדמיה, לבחור עוברים זכריים בשלבים מתאימים ולנתח את הגונד מהרקמה הסובבת אותו תוך שמירה על שלמותו המבנית. לאחר הניתוח, ניתן לצלם את הגונדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להמחיש תהליכים תאיים דינמיים. הליך הנתיחה דורש תזמון ומיומנות מדויקים, אך אנו מספקים תובנה כיצד למנוע טעויות נפוצות וכיצד להתגבר על אתגרים אלה. למיטב ידיעתנו זהו פרוטוקול הנתיחה הראשון של הגונד העוברי דרוזופילה , והוא יאפשר הדמיה חיה בחלון זמן בלתי נגיש אחרת. ניתן לשלב טכניקה זו עם מניפולציות מהונדסות פרמקולוגיות או מסוג תאים ספציפיים כדי לחקור תהליכים דינמיים המתרחשים בתוך או בין התאים בסביבתם הגונדלית הטבעית.

Introduction

אשכי Drosophila melanogaster שימשו פרדיגמה להבנתנו תהליכים תאיים דינמיים רבים. מחקרים על מודל זה שפכו אור על ויסות חלוקת תאי גזע ^1,2,3, התפתחות תאי נבט ^4,5, ביולוגיה של פירנ"א ^6,7,8, ואירועי איתות תאי גזע נישה ^{9,10,11,12,13}. מודל זה הוא יתרון מכיוון שהוא ניתן למתיחה גנטית^{של 14,15} והוא אחד הבודדים שבהם אנו יכולים לדמות תאי גזע חיים בסביבתם הטבעית ^3,16,17,18. עם זאת, הדמיה חיה של מודל זה הוגבלה לרקמות בוגרות ולשלבים עובריים מוקדמים, והותירה פער בידע שלנו על דינמיקה של גונדאל בעובר המאוחר, השלב המדויק שבו הנישה נוצרת לראשונה ומתחילה לתפקד.

הגונד העוברי בשלב מאוחר הוא כדור, המורכב מתאי נישה סומאטיים בחלק הקדמי, ותאי נבט הנספים על ידי תאי גונדל סומטיים באזורים אחוריים יותר¹⁹. ניתן לדמות איבר זה חי ב- vivo עד שלב העוברי המוקדם 17^17,20,21. הדמיה נוספת נמנעת עקב ייזום התכווצויות שרירים בקנה מידה גדול. התכווצויות אלה כה חמורות עד שהן דוחפות את הגונד אל מחוץ למסגרת ההדמיה, ותנועה כזו אינה ניתנת לתיקון באמצעות תוכנת הדמיה. המעבדה שלנו מעוניינת לחשוף את המנגנונים של היווצרות נישה, המתרחשת בתקופה חמקמקה זו להדמיה חיה. לכן, יצרנו גישת ex vivo לדימוי חי של הגונד החל משלב 16 העוברי, מה שמקל על חקר הדינמיקה של התאים בתקופה מכרעת זו של התפתחות הגונד. עבודות קודמות מהמעבדה שלנו מראות כי הדמיית ex vivo זו משחזרת בנאמנות את פיתוח ה-in vivo gonad¹⁷. טכניקה זו היא הראשונה והיחידה מסוגה עבור הגונד העוברי של דרוזופילה.

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול הנתיחה הנדרש להדמיה חיה ex vivo של הגונד בשלבים העובריים המאוחרים. פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם טיפולים פרמקולוגיים, או מניפולציה מהונדסת של שושלות תאים ספציפיות בתוך הגונד. באמצעות טכניקה זו, צילמנו בהצלחה את השלבים של היווצרות נישה של תאי גזע¹⁷. גישת הדמיה זו היא אפוא חיונית לתחום הביולוגיה של תאי הגזע, שכן היא תאפשר הדמיה של השלבים הראשונים של היווצרות נישה בזמן אמת בסביבתה הטבעית^15,17. בעוד ששיטה זו מועילה לתחום הביולוגיה של תאי גזע, היא גם ישימה להדמיה של תהליכים דינמיים המתרחשים בגונד במהלך נקודת זמן התפתחותית זו, כולל סידור מחדש של תאים²², הידבקות תאים ^2,12,23 ונדידת תאים²³. פרוטוקול דיסקציה זה ישפר אפוא את הבנתנו לגבי תהליכים ביולוגיים בסיסיים רבים של התאים.

Protocol

1. הכנה ליום לפני הנתיחה

1. באופן אלקטרוליטי מחדדים מחט טונגסטן²⁴ כך שהקוטר המתקבל הוא כ-0.03 מ"מ. התאם את המתח המסופק לכ- 14 וולט, והשתמש ב- 3.3 M NaOH. חידוד צריך לקחת לא יותר מ 1 או 2 דקות.
   אזהרה: NaOH הוא מאוד קורוזיבי ויגרום לכוויות במגע עם העור. הרכיבו כפפות ומשקפי מגן בזמן הטיפול, ועבדו בתוך מכסה אדים.
   הערה: לאחר השימוש, אחסן את NaOH בצינור פלקון פוליפרופילן.
2. הפוך את מדיית ההדמיה המוכנה. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, שלבו 4.25 מ"ל של המדיה של שניידר עם 750 μL של סרום בקר עוברי (FBS, 15% ריכוז סופי) ו-27.5 μL של פניצילין-סטרפטומיצין (0.05 U/μL של פניצילין, 0.05 מיקרוגרם/מיקרול ריכוז סופי). אחסן את מדיית ההדמיה המוכנה הזו בטמפרטורה של 4 °C (75 °F).
3. הכינו תמיסת דבק הפטן. הוסיפו כ-0.5 מ"ל הפטאן לבקבוקון אטום בגודל 20 מ"ל ממולא בנייר דבק דו-צדדי בקוטר 20 ס"מ. מתנדנדים על אגוז במשך כשעה, או מערבבים עם קצה פיפטה עד שמתקבלת עקביות בין זו של מים לגליצרול. פתרון זה של דבק מומס יימשך מספר ימים לפני שהפטן יתאדה. כדי לרענן את הפתרון, הוסיפו עוד 0.5 מ"ל הפטאן, וסלע.
   הערה: ניתן להכין תמיסת דבק הפטאן יעילה באמצעות יחסים שונים של הפטאן לטייפ, כמו גם משכי זמן משתנים של נדנדה/ערבוב. המפרטים הנ"ל הם רק הצעות להכנה או לרענון של פתרון הולם כזה.

2. איסוף עוברים – 15–17 שעות לפני הכריתה

1. מוסיפים ממרח שמרים טרי לצלחת אגר מיץ תפוחים²⁵. הקימו כלוב איסוף עוברים על ידי הוספת זבובים בוגרים (בני פחות מ-10 ימים) לבקבוק מזון ריק, מחורר בחורים קטנים²⁶. מכסים את כלוב האיסוף באמצעות צלחת האגר השמרים, מודבקים לבקבוק, ומניחים את הכלוב עם צד הצלחת למטה באינקובטור כהה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
   הערה: הזבובים חייבים לבטא טרנסגן שיסמן באופן פלואורסצנטי את הגונד, לדוגמה, six4-eGFP::Moesin²⁰, מכיוון שניתוח העוברים יתבצע תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי. ראה טבלת חומרים לקבלת רשימה של גנוטיפים המשמשים לסימון הגונד.
2. מוציאים את הכלוב מהחממה ומשליכים את האוסף הראשון הזה. החליפו אותו בצלחת אגר טרייה עם שמרים והחזירו את הכלוב לאינקובטור למשך שעתיים.
   הערה: איסוף העוברים הראשון משמש לניקוי נקבות מעוברים מופרים ומתפתחים, כדי להשיג אוסף שני מתוזמן היטב של עוברים.
3. מוציאים את צלחת האגר מהכלוב ומניחים אותה (כשצד השמרים פונה כלפי מעלה) על מגבת נייר לחה בתוך מיכל פלסטיק אטום. מניחים את החדר הלח הזה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס כדי להזדקן העוברים במשך 14.5 שעות (גילאים סופיים, 14.5-16.5 שעות לאחר הטלת הביצה).
   הערה: מיד לפני תחילת שלב 2.4, השלם את שלבים 3.1 ו- 3.2.
4. מוציאים את צלחת האגר מהאינקובטור, ובעזרת בקבוק שפריץ מוסיפים מספיק מים לצלחת האגר כדי להמיס את משחת השמרים על ידי הברשה קלה עם מברשת צבע. שוטפים את העוברים ומומסים את השמרים בסלסלת רשת קטנה היושבת בתוך סירת שקילה. יש לשטוף את הסל עם בקבוק התזת המים עד שרוב משחת השמרים מסוננת דרך הרשת.
5. מוציאים את המים מסירת השקילה ומחזירים את הסל פנימה. הפחיתו את העוברים על ידי טבילתם בתמיסת אקונומיקה של 50%, באמצעות בקבוק שפריץ. תמיסת האקונומיקה צריכה להיות בעלת עומק של 3-5 מ"מ. יש לשמור את העוברים שקועים באקונומיקה למשך כ-2 דקות, עם מערבולות מזדמנות.
   אזהרה: אקונומיקה היא קורוזיבית ועלולה לגרות או לפגוע בעיניים ובדרכי הנשימה. לבשו כפפות ומשקפי מגן בזמן הטיפול באקונומיקה.
   הערה: במהלך תקופה זו, השלם ככל האפשר של שלב 3.3. ניתן לבדוק את התקדמות ההפחתה על ידי הנחת הסל מתחת למיקרוסקופ סטריאו ובדיקת היעדר התוספות הגביות. טבלו את העוברים בתמיסת האקונומיקה למשך זמן נוסף, במידת הצורך.
6. משליכים את האקונומיקה, ושוטפים היטב את העוברים בתוך הסל במים מבקבוק השפריץ (במשך כ-3 שניות, מכתימים את סלסלת הרשת במגבות נייר; חוזרים על הפעולה 2-3 פעמים).

3. הכנת יום של דיסקציה

1. הוסיפו 30 μL אינסולין (10 מ"ג/מ"ל) ל-1,500 μL אמצעי הדמיה מוכנים (ראו שלב 1.2) בצינור אפנדורף של 1.5 מ"ל (ריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל). מערבבים היטב ומשאירים את הצינור על הספסל כדי להתאימם לטמפרטורת החדר.
2. מכינים רצועות כיסוי מצופות בדבק.
   1. השתמשו בסכין עם קצה יהלום כדי לחתוך כיסוי בגודל 22 מ"מ על 22 מ"מ לארבע רצועות בגודל שווה (איור 1A).
   2. השתמשו במלקחיים כדי להרים רצועה אחת ולפזר סך של כ-30 μL של תמיסת דבק הפטאן על שני צידי הרצועה (איור 1B). כדי להשיג שכבה אחידה של שאריות דבק, הטו את הרצועה בזוויות שונות בזמן שההפטן מתאדה.
   3. אחסן את הרצועה המכוסה בדבק בחריץ ריק של קופסת כיסויים; כדי לשמור על דביקותה, הניחו את הרצועה במצב משופע אך זקוף, תוך הישענות על קצות הקופסה כדי למזער את המגע עם משטחי הקופסה (איור 1C). סגור את הקופסה כך שחלקיקים באוויר לא יצפו את הדבק ויפחיתו את דביקותו.
3. הניחו את הפריטים הבאים על הספסל: פיפטת פסטר זכוכית בגודל 6 אינץ', מגלשת מיקרוסקופ, P200 ופיפטמן P1000 עם קצות הפיפטה המתאימים, הפתרון של רינגר²⁷ (pH מותאם ל-7.3 עם NaOH), וצלחת הדמיה חשופה, מצופה פולי-D-ליזין 35 מ"מ.
4. מעבירים עוברים מסל המסך של הרשת לכוס שעון קטנה מלאה בהפטן 500–750 מיקרול'.
   1. מדביקים את הצדדים והחלק התחתון של הסל יבשים עם מגבון טישו. להרטיב מכחול בהפטן, לגעת במברשת לעוברים (קרום הוויטלין ההידרופובי צריך להיצמד לזיפים), ולטבול את המכחול בחזרה לתוך ההפטאן שבזכוכית השעון (העוברים צריכים לשקוע לתחתית).
      הערה: יש לבצע את הצעדים הבאים במהירות האפשרית כדי למנוע מהעוברים להתייבש. אין לחשוף עוברים לאוויר במשך יותר מ -20 שניות.
5. מעבירים את העוברים לשקופית המיקרוסקופ באמצעות פיפטה של פסטר (איור 1D). משכו עוברים לתוך הפיפטה באיטיות והגבילו אותם לחלק הצר של הפיפטה. פיפטה עוברת על המגלשה באיטיות, כך שהם מצטברים ממש בתוך קצה הפיפטה לפני שהם זורמים אל המגלשה. סובבו את הפינה של מגבון טישו לקצה דק, וזרקו את ההפטאן מהעוברים על המגלשה. הם יצברו ויכסו שטח קטן יותר, מה שיקל על לכידתם על רצועה מכוסה דבק בשלב הבא.
6. בעזרת מלקחיים, הרימו רצועה מכוסה דבק ונגעו בה בעדינות בעוברים (איור 1E). מניחים את הרצועה בצלחת ההדמיה, את העובר בצד, וממש מחוץ למרכז המצופה פולי-D-ליזין. לוחצים את הרצועה על התבשיל באמצעות מלקחיים, כדי לוודא שהיא קבועה במקומה. מיד להציף את המנה עם 2-3.5 מ"ל תמיסה של רינגר; הטביעו תחילה את העוברים כדי למנוע מהם להתייבש (איור 1F).

4. דיסקציה

הערה: שלבים אלה חייבים להתבצע תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי.

1. דוויטלין 10-15 עוברים.
   הערה: זה עשוי לנוע בין שני עוברים, למתחילים, לחמישה עשר עוברים, למומחים.
   1. בחר עוברים שלב 16 בהתבסס על מורפולוגיה של המעיים (איור 2). בשלב זה, לעוברים יש שלוש התכווצויות מעיים שיוצרות ארבעה מקטעי מעיים מוערמים (איור 2B,B' ). כדי להתחיל devitellinization, לחדור את העובר שנבחר בקצה אחד, רצוי הקדמי, עם מחט טונגסטן. העובר עשוי לבלוט מתוך קרום הוויטלין שלו, אך אם לא, לקלף את הקרום מהעובר.
      הערה: לעוברים צעירים מכדי לנתח יש מעיים לא אזוריים (איור 2C). כריתה של עוברים שלב 17 אפשרית, אך מאתגרת יותר מאשר כריתה של עוברים שלב 16 מכיוון שהציפורן מתחילה להתפתח בשלב זה. עוברים בשלב מוקדם 17 נמצאים עם ארבעה מקטעי מעיים שמוזזים יחסית זה לזה (איור 2D,D').
   2. חברו את המחט דרך העובר באזור רחוק מהגונדות. מעבירים את העובר המחובר לאזור המצופה פולי-ליזין של התבשיל (מכאן והלאה מכונה פשוט "החלקת כיסוי") וגוררים אותו על הקרקעית עד שהוא נדבק. חזרו על השלבים האלה, וסדרו עוברים שעברו דה-ויטלין בשורה לאורך החלק העליון של החלקת הכיסוי המצופה פולי-ליזין (איור 3A), והשאירו הרבה מקום למטה להמשך ניתוח.
      הערה: הגונדות מופיעות כאגרגטים כדוריים קטנים של תאים שאמורים להיות זוהרים בבהירות, בהתאם לסמן הספציפי שבו נעשה שימוש ומספר ההעתקה הטרנסגני. בשלב זה, הגונדות ממוקמות לרוחב בקטע A5, בערך 70%-80% מאורך העובר מלפני. לאורך פרוטוקול הנתיחה, הרקמה עשויה להידבק למחט. כדי להיפטר מהמחט של הפסולת, הרם אותה ממש מעל פני השטח של תמיסת הרינגר. דה-ויטליניזציה יכולה להיות לא מסודרת כל עוד הגונד תקין מופרע כמה שפחות.
2. עדינו את הגונדות מתוך העובר אל המנה (איור 3C,D).
   1. ראשית, פילה את העובר כדי לחשוף את פנים העובר (איור 3C). פורסים את העובר ממרכזו, מזיזים את המחט לאחור, בין הגונדות. להקניט החוצה רקמה פנימית כלשהי, שכן זה יידבק למנה הרבה יותר טוב מאשר הציפורן החיצונית. הדביקות של הרקמה תאפשר למניפולציות הבאות לחשוף את הגונד ולאפשר לו להיצמד להחליק הכיסוי.
      הערה: אם הרקמה אינה נדבקת לתבשיל, נסו לשדל אותו לאזור לא מזוהם של החלקת הכיסוי המצופה; האזורים החיצוניים של החלקת הכיסוי יהיו דביקים במיוחד. כאמור בשלב 4.1.2, אין זה משנה אם מניפולציות הנתיחה גורמות לפגר עוברי מגולען, כל עוד הגונדות נותרות ללא פגע.
   2. השתמשו במחט כדי לחתוך סביב גונד עד שפיסת טישו, כולל הגונד, מופרדת מהפגר שנותר. בעזרת המחט, משכו את הרקמה לאזור רענן של החלקת כיסוי מצופה, והצמידו אותה לתחתית עד שהיא נצמדת לתבשיל.
      הערה: ההדמיה הטובה ביותר תושג עבור אותם מקרים שבהם הגונד עצמו מתחבר ישירות לתלוש הכיסוי, ולא חיבור עקיף באמצעות רקמה מעל. לכן, כאשר הרקמה מונחית הרחק מהפגר, נסו לגרום לגונד לגעת תחילה בהחלקת הכיסוי, ולא ברקמה זרה.
   3. הסר כמה שיותר רקמות מסביב מהגונד (איור 3D) על-ידי גרירת רקמה דביקה בעדינות הרחק מהגונד עם המחט. הימנעו מלגעת ישירות בגונד, מה שיפגע בו (איור 4E). כדי לוודא שהגונאד נדבק מספיק לתבשיל, הזיזו את המחט בתנועה מעגלית עדינה סביב הגונד – אם הוא זז, אם הוא זז, גע במחט ברקמה הדבקה הנותרת, והפנה את הגונד לאזור רענן של החלקת כיסוי דביקה. חזור על תהליך זה עד שלא תהיה תנועה ניתנת לזיהוי של הגונד.
   4. חוזרים לפגר העוברים ומנתחים את הגונד השני. חזור על תהליך זה על עוברים רבים ככל האפשר, אך אל תעלה על 25 דקות. כדאיות הרקמות תיפגע בתמיסה של רינגר לאחר יותר מ-40-45 דקות.
3. לאחר השלמת הניתוחים, השתמש בסמן בל יימחה כדי להוסיף סימני רישום לשפה החיצונית של צלחת ההדמיה כדי לרשום את הכיוון שלה במהלך הנתיחה.
4. מוציאים את הרצועה המצופה בדבק מהתבשיל.
   1. מכניסים בעדינות את המוט התחתון של זוג מלקחיים מתחת לרצועה, אוחזים ומטים באיטיות את הרצועה כלפי מעלה כדי לשחרר אותה מהצלחת עם כמה שפחות רפש של תמיסת הרינגר כדי למזער את ההפרעה של הגונדות הנדבקות.
      הערה: יש להטות את הרצועה הרחק מהגונדות המנותחות.
5. נשאו בעדינות את המנה למיקרוסקופ ההדמיה באופן שימנע טשטוש של תמיסת הרינגר.

5. הדמיה

1. הניחו את צלחת ההדמיה במחזיק הבמה, תוך שימוש בסימני הרישום כדי למקם את המנה בכיוון המשוער כמו במהלך הנתיחה. באמצעות שימוש במיקרוסקופיית שדה בהיר ובמטרה בהספק נמוך (~פי 10), זהה והביא לפוקוס כל פיסת רקמה המודבקת לתלוש הכיסוי. החלף את הגדרות העינית כדי לחשוף פלואורסצנטיות, ובאמצעות עיניות המשקפת, סרוק באופן שיטתי את המנה, וסימנו את המיקום של כל גונד בתוך תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים).
   הערה: ודא שהגונאדים ממורכזים בשדה הראייה לפני סימון מיקומים.
2. הסר בעדינות את כל מכלול מחזיקי הבמה, עם צלחת ההדמיה במחזיק שלה, והנח את ההרכבה על ספסל העבודה.
3. החלף את תמיסת הצלצול במדיית ההדמיה המוכנה המכילה אינסולין (ראה שלבים 1.2 ו-3.1).
   1. השתמשו ב-P1000 כדי להסיר את כל תמיסת ה-Ringer מהמדף העליון הפנימי של צלחת ההדמיה (אין למקם את ה-pipette Ringer's מאזור החלקת הכיסוי המרכזית). לאחר מכן, עברו ל-P200, והניחו את קצהו ממש מתחת לפני השטח של הרינגר הנותרים באזור המרכז. הסר בזהירות 50-100 μL של רינגר; אל תסיר את הפתרון כולו.
   2. ציירו כ-200 μL של מדיית הדמיה, ושוב הניחו את קצה ה-P200 ממש מתחת לפני השטח של הרינג'רים הנותרים, הוסיפו לאט לאט את מדיית ההדמיה הזו. לאחר מכן, הוסיפו את מדיית ההדמיה הנותרת (כ-1,300 μL) למנה, החל מהשוליים החיצוניים ביותר של המדף העליון. תוך כדי צנרת, התקדמו לעבר הכיפה המרכזית של הנוזל, ובסופו של דבר מזגו את השניים על ידי הברשה של קצה הפיפטה על פני שניהם. מניחים את המכסה על התבשיל.
      הערה: מדיית ההדמיה צריכה לכסות את כל הקוטר הפנימי של המנה, בעומק של כ-2 מ"מ, כדי למנוע אידוי (איור 4D).
4. החלף את המיקרוסקופ למטרה בהספק גבוה יותר (63x, 1.2 NA), החל את נוזל הטבילה המתאים בהתבסס על המטרה שבה נעשה שימוש (סוג נוזל טבילה ומקדם שבירה הנדרש על ידי המטרה), ולאחר מכן החלף את מכלול מחזיקי הבמה. השתמשו במיקרוסקופיה של ברייטפילד כדי להתמקד ברקמות שנצמדות לתחתית צלחת ההדמיה.
   הערה: אם הבמה לא הוזזה, הגונד האחרון צריך לבוא לידי ביטוי ברגע שהמטרה ממוקדת.
5. צעדו דרך כל תנוחת גונד מסומנת והתאימו את התנוחה הזו, לפי הצורך. בחר אילו גונדות לצלם על סמך בהירות התמונה, סקס גונד וכו '. התאם אישית את הגדרות ההדמיה (רב ערוצי, זמני חשיפה, עוצמות לייזר, דרגות מסדרת Z, קיטועי זמן עם מרווחים מתאימים וכו '). התחילו בהדמיה.
   הערה: ניתן לזהות גונדות זכריות על ידי נוכחות של נישה, ובקצה הנגדי של הגונד, מקבץ של תאים סומאטיים קטנים, מעגליים מאוד, הנקראים מבשרי גונדל סומטיים ספציפיים לזכר (msSGPs). אם נעשה שימוש בסמן הפלואורסצנטי six4-eGFP::moesin, תאי הנישה הם התאים השניים בבהירותם בגונד, כאשר הבהירים ביותר הם ה-msSGPs. בשלב זה, לגונדות נשיות אין נישה ולא msSGPs.

תוצאות

אנו ממחישים את ההכנה של צלחת ההדמיה באיור 1, כפי שמתואר ב"הכנת יום הנתיחה". שיטות אלה אמורות לגרום בסופו של דבר לכך שעוברים בעלי לחות טובה יידבקו לרצועת החלקה, המקובעת באופן זמני לתחתית המנה ושקועה בתמיסה של רינגר (איור 1F). סכין עם קצה יהלום מאפשרת לפרוס בצורה ...

Discussion

במהלך הגונדוגנזה, הגונד העוברי, ובמיוחד גומחת תאי הגזע בתוך הגונד^{הזכרי 15}, עוברים שינויים מורפולוגיים מהירים. מנגנונים התפתחותיים העומדים בבסיס השינויים הדינמיים הללו מובנים בצורה הטובה ביותר באמצעות טכניקות הדמיה חיה. עם זאת, בשלב העוברי 17, הדמיית in vivo של הגונד הופכת לב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024