Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

Resumen

Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.

Resumen

La gónada embrionaria masculina de Drosophila melanogaster es un modelo ventajoso para estudiar varios aspectos de la biología del desarrollo, incluidos, entre otros, el desarrollo de células germinales, la biología de piRNA y la formación de nichos. Aquí, presentamos una técnica de disección para obtener imágenes en vivo de la gónada ex vivo durante un período en el que las imágenes en vivo in vivo son altamente ineficaces. Este protocolo describe cómo transferir embriones a un plato de imágenes, elegir embriones masculinos en etapas adecuadas y diseccionar la gónada de su tejido circundante mientras se mantiene su integridad estructural. Después de la disección, las gónadas se pueden obtener imágenes utilizando un microscopio confocal para visualizar los procesos celulares dinámicos. El procedimiento de disección requiere un tiempo y una destreza precisos, pero proporcionamos información sobre cómo prevenir errores comunes y cómo superar estos desafíos. Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo de disección para la gónada embrionaria de Drosophila , y permitirá la obtención de imágenes en vivo durante una ventana de tiempo que de otro modo sería inaccesible. Esta técnica se puede combinar con manipulaciones transgénicas farmacológicas o específicas de tipo celular para estudiar cualquier proceso dinámico que ocurra dentro o entre las células en su entorno gonadal natural.

Introducción

El Drosophila melanogaster testis ha servido como paradigma para nuestra comprensión de muchos procesos celulares dinámicos. Los estudios de este modelo han arrojado luz sobre la regulación^de la división de células madre ^1,2,3, el desarrollo de células germinales ^4,5, la biología de piRNA ^6,7,8 y los eventos de señalización de células madre de nicho ^{9,10,11,12,13}. Este modelo es ventajoso porque es genéticamente tratable^14,15 y es uno de los pocos en los que podemos vivir células madre en su entorno natural ^3,16,17,18. Sin embargo, la imagen en vivo de este modelo se ha limitado al tejido adulto y a las etapas embrionarias tempranas, dejando un vacío en nuestro conocimiento de la dinámica gonadal en el embrión tardío, la etapa precisa en la que el nicho se está formando por primera vez y comienza a funcionar.

La gónada embrionaria en etapa tardía es una esfera, que consiste en células de nicho somáticas en la parte anterior, y células germinales enquistadas por células gonadales somáticas en las regiones más posteriores¹⁹. Este órgano puede ser fotografiado en vivo in vivo hasta la etapa embrionaria temprana 17 17,20,21. Se previenen más imágenes debido al inicio de contracciones musculares a gran escala. Estas contracciones son tan severas que empujan la gónada fuera del marco de la imagen, y tal movimiento no se puede corregir con el software de imágenes. Nuestro laboratorio está interesado en revelar los mecanismos de formación de nichos, que ocurre durante este período difícil de alcanzar para las imágenes en vivo. Por lo tanto, generamos un enfoque ex vivo para obtener imágenes en vivo de la gónada a partir de la etapa embrionaria 16, facilitando el estudio de la dinámica celular durante este período crucial de desarrollo de la gónada. Trabajos previos de nuestro laboratorio muestran que esta imagen ex vivo recapitula fielmente el desarrollo de gónadas in vivo ¹⁷. Esta técnica es la primera y única de su tipo para la gónada embrionaria de Drosophila.

Aquí, presentamos el protocolo de disección requerido para la obtención de imágenes en vivo ex vivo de la gónada durante las etapas embrionarias tardías. Este protocolo se puede combinar con tratamientos farmacológicos o manipulación transgénica de linajes celulares específicos dentro de la gónada. Usando esta técnica, hemos fotografiado con éxito los pasos de la formación de nichos de células madre¹⁷. Este enfoque de imagen es, por lo tanto, instrumental para el campo de la biología de células madre, ya que permitirá la visualización de las etapas iniciales de la formación de nichos en tiempo real dentro de su entorno natural^15,17. Si bien este método es beneficioso para el campo de la biología de células madre, también es aplicable para visualizar cualquier proceso dinámico que ocurra en la gónada durante este punto de tiempo de desarrollo, incluidos los reordenamientos celulares²², la adhesión celular ^2,12,23 y la migración celular²³. Este protocolo de disección mejorará así nuestra comprensión de muchos procesos biológicos celulares fundamentales.

Protocolo

1. Preparación del día antes de la disección

1. Afila electrolíticamente una aguja de tungsteno²⁴ para que el diámetro resultante sea de aproximadamente 0,03 mm. Ajuste el voltaje suministrado a aproximadamente 14 V y use 3.3 M NaOH. El afilado no debe tomar más de 1 o 2 minutos.
   PRECAUCIÓN: El NaOH es altamente corrosivo y causará quemaduras al contacto con la piel. Use guantes y gafas mientras manipula, y trabaje dentro de una campana extractora.
   NOTA: Después de su uso, guarde NaOH en un tubo Falcon de polipropileno.
2. Haga los medios de imagen preparados. En un tubo cónico de 15 ml, combinar 4,25 ml de medios de Schneider con 750 μL de suero fetal bovino (FBS, concentración final del 15%) y 27,5 μL de penicilina-estreptomicina (0,05 U/μL de penicilina, concentración final de 0,05 μg/μL). Guarde este medio de imagen preparado a 4 °C.
3. Haga una solución de heptano-pegamento. Agregue aproximadamente 0,5 ml de heptano a un vial sellable de 20 ml relleno con cinta adhesiva de doble cara de unos 20 cm. Mece en un nutator durante aproximadamente una hora, o revuelva con una punta de pipeta hasta que se logre una consistencia entre la del agua y el glicerol. Esta solución de pegamento disuelto durará varios días antes de que el heptano se evapore. Para refrescar la solución, agregue 0.5 ml de heptano adicional y roca.
   NOTA: Se puede preparar una solución efectiva de heptano-pegamento utilizando varias proporciones de heptano a cinta, así como diferentes duraciones de balanceo / agitación. Las especificaciones anteriores son simplemente sugerencias para preparar o refrescar una de esas soluciones adecuadas.

2. Recolección de embriones: 15–17 h antes de la disección

1. Agregue pasta de levadura fresca a un plato de agar de jugo de manzana²⁵. Instale una jaula de recolección de embriones agregando moscas adultas (de menos de 10 días de edad) a una botella de alimento vacía, perforada con pequeños orificios²⁶. Tapa la jaula de recolección con la placa de agar con levadura, pegada a la botella, y coloca la jaula con el lado de la placa hacia abajo en una incubadora oscura de 25 °C durante 1 h.
   NOTA: Las moscas deben expresar un transgén que marcará fluorescentemente la gónada, por ejemplo, six4-eGFP::Moesin²⁰, porque la disección de embriones se llevará a cabo bajo un microscopio estereofresor. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de los genotipos utilizados para marcar la gónada.
2. Retire la jaula de la incubadora y deseche esta primera colección. Reemplácelo con una placa de agar recién levadura y vuelva a colocar la jaula en la incubadora durante 2 h.
   NOTA: La primera colección de embriones se utiliza para limpiar a las hembras de embriones fertilizados en desarrollo, para lograr una segunda colección de embriones estrechamente programada.
3. Retire la placa de agar de la jaula y colóquela (con el lado de levadura hacia arriba) sobre una toalla de papel húmeda dentro de un recipiente de plástico sellable. Coloque esta cámara húmeda en una incubadora de 25 °C para envejecer los embriones durante 14,5 h (edades finales, 14,5-16,5 h después de la puesta del huevo).
   NOTA: Inmediatamente antes de comenzar el paso 2.4, complete los pasos 3.1 y 3.2.
4. Retire la placa de agar de la incubadora y, con una botella de chorro, agregue suficiente agua a la placa de agar para disolver la pasta de levadura cepillando ligeramente con un pincel. Enjuague los embriones y la levadura disuelta en una pequeña cesta de malla de malla que se encuentra dentro de un bote de pesaje. Enjuague la cesta con la botella de chorro de agua hasta que la mayor parte de la pasta de levadura se haya filtrado a través de la malla.
5. Retire el agua del bote de pesaje y vuelva a colocar la cesta dentro. Descoronar los embriones sumergiéndolos en una solución de lejía al 50%, utilizando un frasco de chorro. La solución de lejía debe tener una profundidad de 3–5 mm. Mantenga los embriones sumergidos en lejía durante ~ 2 minutos, con remolinos ocasionales.
   PRECAUCIÓN: La lejía es corrosiva y puede irritar o dañar los ojos y el tracto respiratorio. Use guantes y gafas mientras manipula la lejía.
   NOTA: Durante este tiempo, complete tanto como sea posible el paso 3.3. El progreso de la descororonación se puede verificar colocando la canasta bajo un microscopio estereoscópico y verificando la ausencia de los apéndices dorsales. Sumerja los embriones en la solución de lejía durante más tiempo, si es necesario.
6. Deseche la lejía y enjuague bien los embriones dentro de la canasta con agua de una botella de chorro (durante ~ 3 s, seque la canasta de malla con toallas de papel; repita 2-3 veces).

3. Preparación del día de la disección

1. Añadir 30 μL de insulina (10 mg/ml) a 1.500 μL de soporte de imagen preparado (ver paso 1.2) en un tubo de Eppendorf de 1,5 ml (concentración final de 0,2 mg/ml). Mezcle bien y deje el tubo en la mesa de trabajo para equilibrar a temperatura ambiente.
2. Prepare tiras de funda recubiertas con pegamento.
   1. Use un cuchillo con punta de diamante para cortar un trozo de cubierta de 22 mm x 22 mm en cuatro tiras de igual tamaño (Figura 1A).
   2. Use fórceps para recoger una tira y extienda un total de aproximadamente 30 μL de solución de pegamento de heptano a ambos lados de la tira (Figura 1B). Para lograr una capa uniforme de residuos de pegamento, incline la tira en varios ángulos mientras el heptano se evapora.
   3. Guarde la tira cubierta de pegamento en una ranura vacía de una caja de cubierta; para mantener su pegajosidad, coloque la tira en una posición inclinada, pero vertical, apoyada contra los bordes de la caja para minimizar el contacto con las superficies de la caja (Figura 1C). Cierre la caja para que las partículas en el aire no cubran el pegamento y disminuyan su pegajosidad.
3. Coloque los siguientes elementos en la mesa de trabajo: una pipeta Pasteur de vidrio de 6 pulgadas, un portaobjetos de microscopio, un pipetador P200 y un P1000 con las puntas de pipeta apropiadas, la solución de Ringer²⁷ (pH ajustado a 7.3 con NaOH) y un plato de imágenes de 35 mm cubierto con recubrimiento de poli-D-lisina.
4. Transfiera embriones de la cesta de malla a un pequeño vaso de reloj lleno de heptano de 500 a 750 μL.
   1. Seque los lados y la parte inferior de la cesta con una toallita de pañuelos. Humedezca un pincel en el heptano, toque el pincel en los embriones (la membrana vitelline hidrofóbica debe adherirse a las cerdas) y sumerja el pincel de nuevo en el heptano en el vidrio del reloj (los embriones deben hundirse hasta el fondo).
      NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse lo más rápido posible para evitar que los embriones se sequen. Los embriones no deben exponerse al aire durante más de 20 s.
5. Transfiera los embriones al portaobjetos del microscopio utilizando una pipeta Pasteur (Figura 1D). Extraiga los embriones en la pipeta lentamente y limítelos a la porción estrecha de la pipeta. Los embriones de pipeta en la diapositiva lentamente, de modo que se agregan justo dentro de la punta de la pipeta antes de fluir hacia la diapositiva. Gire la esquina de una toallita de tejido en una punta fina y elimine el heptano de los embriones en el portaobjetos. Se agregarán y cubrirán un área más pequeña, lo que facilitará su captura en una tira cubierta de pegamento en el siguiente paso.
6. Con fórceps, tome una tira cubierta de pegamento y tóquela suavemente con los embriones (Figura 1E). Coloque la tira en el plato de imágenes, de lado del embrión hacia arriba y justo afuera del centro recubierto de poli-D-lisina. Presione la tira sobre el plato con fórceps, para asegurarse de que esté fija en su lugar. Inmediatamente inunde el plato con la solución de Ringer de 2 a 3.5 ml; sumergir primero los embriones para evitar que se sequen (Figura 1F).

4. Disección

NOTA: Estos pasos deben llevarse a cabo bajo un microscopio estereofresor.

1. Desvitellinizar 10-15 embriones.
   NOTA: Esto puede variar desde dos embriones, para principiantes, hasta quince embriones, para expertos.
   1. Seleccione embriones en etapa 16 según la morfología intestinal (Figura 2). En esta etapa, los embriones tienen tres constricciones intestinales que crean cuatro segmentos intestinales apilados (Figura 2B, B'). Para comenzar la desvitellinización, perfore el embrión seleccionado en un extremo, preferiblemente el anterior, con la aguja de tungsteno. El embrión puede salir de su membrana vitelina, pero si no, pelar la membrana del embrión.
      NOTA: Los embriones que son demasiado jóvenes para diseccionar tienen intestinos no regionalizados (Figura 2C). La disección de embriones en etapa 17 es posible, pero más desafiante que la disección de embriones en etapa 16 porque la cutícula está comenzando a desarrollarse en esta etapa. Los embriones de la etapa temprana 17 presentan cuatro segmentos intestinales que se desplazan entre sí (Figura 2D, D').
   2. Engancha la aguja a través del embrión en una región alejada de las gónadas. Transfiera el embrión enganchado a la región recubierta de polilisina del plato (de aquí en adelante, simplemente "deslizamiento de cubierta") y arrástrelo contra el fondo hasta que se adhiera. Repita estos pasos y organice los embriones desvitellinizados en una fila a lo largo de la parte superior de la hoja de cubierta recubierta de polilisina (Figura 3A), dejando mucho espacio debajo para una mayor disección.
      NOTA: Las gónadas aparecen como pequeños agregados esféricos de células que deben fluorescenciar intensamente, dependiendo del marcador específico utilizado y el número de copias transgénicas. En esta etapa, las gónadas se encuentran lateralmente en el segmento A5, aproximadamente en el 70% -80% de la longitud del embrión desde la parte anterior. A lo largo del protocolo de disección, el tejido puede adherirse a la aguja. Para eliminar la aguja de los escombros, levántela justo por encima de la superficie de la solución de Ringer. La desvitellinización puede ser desordenada siempre y cuando la gónada propiamente dicha se altere lo menos posible.
2. Afinar las gónadas fuera del embrión y en el plato (Figura 3C, D).
   1. Primero, filetear el embrión para exponer su interior (Figura 3C). Cortar a través del embrión desde su centro, moviendo la aguja hacia atrás, entre las gónadas. Desentraña un poco de tejido interno, ya que esto se pegará al plato mucho mejor que la cutícula externa. La pegajosidad del tejido permitirá que las siguientes manipulaciones revelen la gónada y le permitan adherirse al deslizamiento de la cubierta.
      NOTA: Si el tejido no se adhiere al plato, intente persuadirlo a una región no contaminada del resbalón de la cubierta recubierta; las regiones exteriores del deslizamiento de la cubierta serán particularmente pegajosas. Como se indica en el paso 4.1.2, no importa si las manipulaciones de disección dan como resultado un cadáver embrionario destrozado, siempre y cuando las gónadas permanezcan ilesas.
   2. Use la aguja para cortar alrededor de una gónada hasta que un pedazo de tejido, incluida la gónada, se separe de la carcasa restante. Con la aguja, dibuje este tejido a una región fresca de deslizamiento de cubierta recubierta y engatúelo contra la parte inferior hasta que se adhiera al plato.
      NOTA: La mejor imagen se logrará para aquellos casos en los que la gónada se adhiere directamente al deslizamiento de la cubierta, en lugar de la unión indirecta a través del tejido suprayacente. Por lo tanto, a medida que el tejido se aleja de la carcasa, intente que la gónada toque primero el deslizamiento de la cubierta, en lugar de tejido extraño.
   3. Retire la mayor cantidad posible de tejido circundante de la gónada (Figura 3D) arrastrando suavemente el tejido adherente lejos de la gónada con la aguja. Evite tocar la gónada directamente, lo que la dañaría (Figura 4E). Para asegurarse de que la gónada esté lo suficientemente adherida al plato, mueva la aguja en un movimiento circular suave alrededor de la gónada; si se mueve, toque la aguja con el tejido adherente restante y dirija la gónada hacia una región fresca de deslizamiento de cubierta pegajosa. Repita este proceso hasta que no haya un movimiento detectable de la gónada.
   4. Regrese al cadáver embrionario y diseccione la segunda gónada. Repita este proceso en tantos embriones como sea posible, pero NO exceda los 25 minutos. La viabilidad del tejido se verá comprometida en la solución de Ringer después de más de ~ 40-45 min.
3. Una vez completadas las disecciones, use un marcador indeleble para agregar marcas de registro al borde exterior de la placa de imágenes para registrar su orientación durante la disección.
4. Retire la tira recubierta de pegamento del plato.
   1. Inserte suavemente la punta inferior de un par de pinzas debajo de la tira, cierre e incline lentamente la tira hacia arriba para liberarla del plato con el menor chapoteo posible de la solución de Ringer para minimizar la perturbación de las gónadas adheridas.
      NOTA: La tira debe inclinarse lejos de las gónadas disecadas.
5. Lleve suavemente el plato al microscopio de imágenes de una manera que evite el chapoteo de la solución de Ringer.

5. Imágenes

1. Coloque el plato de imágenes en el soporte del escenario, utilizando las marcas de registro para colocar el plato en la orientación aproximada como durante la disección. Usando microscopía de campo brillante y un objetivo de baja potencia (~ 10x), identifique y enfoque cualquier pieza de tejido que esté adherida al deslizamiento de la cubierta. Cambie la configuración del ocular para revelar la fluorescencia y, utilizando los oculares binoculares, escanee sistemáticamente el plato, marcando la posición de cada gónada dentro del software de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Asegúrese de que las gónadas estén centradas en el campo de visión antes de marcar posiciones.
2. Retire suavemente todo el conjunto del soporte del escenario, con el plato de imágenes en su soporte, y coloque el conjunto en el banco de trabajo.
3. Reemplace la solución de Ringer por el soporte de imagen preparado que contenga insulina (ver pasos 1.2 y 3.1).
   1. Use un P1000 para quitar toda la solución de Ringer de la repisa superior interior del plato de imágenes (no pipetee Ringer de la región de deslizamiento de la cubierta central). A continuación, cambie a un P200 y coloque su punta justo debajo de la superficie del Ringer restante en la región central. Retire cuidadosamente 50–100 μL de Ringer; NO quite toda la solución.
   2. Dibuje ~ 200 μL de medios de imagen y, nuevamente colocando la punta P200 justo debajo de la superficie del Ringer restante, agregue lentamente este medio de imagen. A continuación, agregue los medios de imagen restantes (~ 1,300 μL) al plato, comenzando en el borde más externo de la repisa superior. Mientras pipetea, muévase hacia la cúpula central del fluido y, finalmente, fusione los dos cepillando la punta de la pipeta a través de ambos. Coloque la tapa en el plato.
      NOTA: Los soportes de imagen deben cubrir todo el diámetro interior del plato, con una profundidad de aproximadamente 2 mm, para evitar la evaporación (Figura 4D).
4. Cambie el microscopio a un objetivo de mayor potencia (63x, 1.2 NA), aplique el fluido de inmersión adecuado según el objetivo utilizado (tipo de fluido de inmersión e índice de refracción requerido por el objetivo) y luego reemplace el conjunto del soporte de la etapa. Use microscopía de campo brillante para enfocar el tejido adherido a la parte inferior de la placa de imágenes.
   NOTA: Si la etapa no se movió, la última gónada debe aparecer a la vista una vez que el objetivo está enfocado.
5. Pase por cada posición marcada de la gónada y ajuste esa posición, según sea necesario. Seleccione qué gónadas desea obtener una imagen en función de la claridad de la imagen, el sexo de las gónadas, etc. Personalice la configuración de imagen (multicanal, tiempos de exposición, intensidades láser, incrementos de la serie Z, lapso de tiempo con intervalos apropiados, etc.). Comience a tomar imágenes.
   NOTA: Las gónadas masculinas se pueden identificar por la presencia de un nicho y, en el extremo opuesto de la gónada, un grupo de células somáticas pequeñas y altamente circulares llamadas precursores gonadales somáticos específicos del hombre (msSGP). Si se utiliza el marcador fluorescente six4-eGFP::moesin, las células de nicho son las segundas células más brillantes de la gónada, siendo las más brillantes las msSGP. En esta etapa, las gónadas femeninas no tienen ni un nicho ni msSGPs.

Resultados

Ilustramos la preparación del plato de imágenes en la Figura 1, como se describe en "Preparación del día de la disección". En última instancia, estos métodos deberían dar como resultado embriones bien hidratados adheridos a una tira deslizante de cubierta, que se fija temporalmente al fondo del plato y se sumerge en la solución de Ringer (Figura 1F). Un cuchillo con punta de diamante permite cortar limpiamente un deslizamiento de cubierta de 22 x 22 mm ...

Discusión

Durante la gonadogénesis, la gónada embrionaria, y particularmente el nicho de células madre dentro de la gónada masculina¹⁵, sufre cambios morfológicos rápidos. Los mecanismos de desarrollo que subyacen a estos cambios dinámicos se entienden mejor a través de técnicas de imágenes en vivo. Sin embargo, en la etapa embrionaria 17, las imágenes in vivo de la gónada se vuelven imposibles por el inicio de contracciones musculares a gran escala¹⁷. Con este p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024