後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

要約

ここでは、ショウ ジョウバエ の雄性生殖巣の後期胚をライブイメージングするために必要な解剖プロトコルを提供する。このプロトコールは、通常の条件下で、またはトランスジェニックまたは薬理学的操作後の動的細胞プロセスの観察を可能にする。

要約

ショウジョウバエメラノガスター雄胚性生殖巣は、生殖細胞発生、piRNA生物学、およびニッチ形成を含むがこれらに限定されない発生生物学の様々な側面を研究するのに有利なモデルである。ここでは、生体内ライブイメージングが非常に効果のない期間に、生体外で生殖巣をライブイメージングする解剖技術を提示する。このプロトコルは、胚をイメージング皿に移し、適切に段階的に配列された雄胚を選択し、その構造的完全性を維持しながら周囲の組織から生殖腺を解剖する方法を概説する。解剖に続いて、生殖巣を共焦点顕微鏡を用いて画像化し、動的な細胞プロセスを視覚化することができる。解剖手順には正確なタイミングと器用さが必要ですが、一般的な間違いを防ぐ方法とこれらの課題を克服する方法についての洞察を提供します。我々の知る限り、これはショウジョウバエの胚性生殖腺の最初の解剖プロトコルであり、そうでなければアクセスできない時間枠の間にライブイメージングを可能にするでしょう。この技術は、薬理学的または細胞型特異的トランスジェニック操作と組み合わせて、天然の生殖腺環境において細胞内または細胞間で起こる動的プロセスを研究することができる。

概要

ショウジョウバエのメラノガスター精巣は、多くの動的な細胞プロセスの理解のためのパラダイムとして役立ってきました。このモデルの研究は、幹細胞分裂制御^1,2,3、生殖細胞発生^4,5、piRNA生物学⁶、⁷、⁸、およびニッチ幹細胞シグナル伝達事象⁹、^{10、11、12、13}に光を当てた。このモデルは遺伝的に扱いやすいため有利です14,15,そして自然環境で幹細胞をライブイメージングできる数少ないものの1つです3,16,17,18

プロトコル

1. 解剖前日の準備

1. 得られた直径が約0.03mmとなるようにタングステン針²⁴ を電解的に鋭くする。供給電圧を約14Vに調整し、3.3MのNaOHを使用してください。シャープニングには1〜2分しかかかりません。
   注意:NaOHは非常に腐食性があり、皮膚と接触すると火傷を引き起こします。取り扱い中は手袋とゴーグルを着用し、ヒュームフード内で作業してください。
   注:使用後は、NaOHをポリプロピレン製のファルコンチューブに保管してください。
2. 準備した撮像媒体を作る。15 mL の円錐管で、4.25 mL のシュナイダー培地を 750 μL のウシ胎児血清 (FBS、最終濃度 15%)および 27.5 μL のペニシリン-ストレプトマイシン (0.05 U/μL のペニシリン、0.05 μg/μL の最終濃度) と組み合わせます。この調製した撮像媒体を4°Cで保存する。
3. ヘプタン接着剤溶液を作る。約20 cmの両面テープで詰めた20 mLの密封可能なバイアルに約0.5 mLのヘプタンを加える。ヌテーターを約1時間揺らすか、水とグリセロールの一貫性が達成されるまでピペットチップで攪拌します。溶解した接着剤のこの溶液は、ヘプタンが蒸発する前に数日間持続する。溶液を新鮮にするために、さらに0.5mLのヘプタンを加え、そして岩を加える。
   注:効果的なヘプタン接着剤溶液は、テープに対するヘプタンの様々な比率、ならびに様々....

結果

「解剖準備の日」で説明したように画像化皿の調製を 図1に例示する。これらの方法は、最終的に、十分に水和した胚をカバースリップストリップに接着させ、これを皿の底に一時的に固定し、リンガーの溶液に沈める結果となるはずである(図1F)。ダイヤモンド先端のナイフを使用すると、22 x 22 mmのカバースリップを3~4本の小さなストリップにき.......

ディスカッション

性腺形成の間、胚性生殖巣、特に雄性生殖巣¹⁵内の幹細胞ニッチは、急速な形態学的変化を受ける。これらのダイナミックな変化の根底にある発達メカニズムは、ライブイメージング技術によって最もよく理解されます。しかしながら、胚期ステージ17では、大規模な筋肉収縮¹⁷の発症により生殖巣の生体内イメージングが不可能になる。このプロト?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024