後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

要約

ここでは、ショウ ジョウバエ の雄性生殖巣の後期胚をライブイメージングするために必要な解剖プロトコルを提供する。このプロトコールは、通常の条件下で、またはトランスジェニックまたは薬理学的操作後の動的細胞プロセスの観察を可能にする。

要約

ショウジョウバエメラノガスター雄胚性生殖巣は、生殖細胞発生、piRNA生物学、およびニッチ形成を含むがこれらに限定されない発生生物学の様々な側面を研究するのに有利なモデルである。ここでは、生体内ライブイメージングが非常に効果のない期間に、生体外で生殖巣をライブイメージングする解剖技術を提示する。このプロトコルは、胚をイメージング皿に移し、適切に段階的に配列された雄胚を選択し、その構造的完全性を維持しながら周囲の組織から生殖腺を解剖する方法を概説する。解剖に続いて、生殖巣を共焦点顕微鏡を用いて画像化し、動的な細胞プロセスを視覚化することができる。解剖手順には正確なタイミングと器用さが必要ですが、一般的な間違いを防ぐ方法とこれらの課題を克服する方法についての洞察を提供します。我々の知る限り、これはショウジョウバエの胚性生殖腺の最初の解剖プロトコルであり、そうでなければアクセスできない時間枠の間にライブイメージングを可能にするでしょう。この技術は、薬理学的または細胞型特異的トランスジェニック操作と組み合わせて、天然の生殖腺環境において細胞内または細胞間で起こる動的プロセスを研究することができる。

概要

ショウジョウバエのメラノガスター精巣は、多くの動的な細胞プロセスの理解のためのパラダイムとして役立ってきました。このモデルの研究は、幹細胞分裂制御^1,2,3、生殖細胞発生^4,5、piRNA生物学⁶、⁷、⁸、およびニッチ幹細胞シグナル伝達事象⁹、^{10、11、12、13}に光を当てた。このモデルは遺伝的に扱いやすいため有利です14,15,そして自然環境で幹細胞をライブイメージングできる数少ないものの1つです3,16,17,18。しかし、このモデルのライブイメージングは成体組織と初期胚期に限定されており、ニッチが最初に形成され機能し始めている正確な段階である後期胚の生殖腺動態に関する知識にギャップを残しています。

後期胚性生殖巣は球体であり、前部の体細胞ニッチ細胞と、より後方領域¹⁹全体にわたって体性生殖腺細胞によって嚢胞された生殖細胞とからなる。この器官は、初期段階17から17^、20、21の初期胚までインビボで生きて画像化することができる。さらに、大規模な筋肉収縮の開始により画像化が妨げられる。これらの収縮は非常に深刻で、生殖腺を画像フレームから押し出すため、そのような動きは画像化ソフトウェアでは補正できません。私たちの研究室では、ライブイメージングのためのこのとらえどころのない時期に起こるニッチ形成のメカニズムを明らかにすることに興味を持っています。そこで、胚期16から生殖巣を生きた画像化するエクスビボアプローチを生かし、生殖腺発生のこの重要な時期における細胞ダイナミクスの研究を促進しました。私たちの研究室の以前の研究は、このex vivoイメージングがin vivo生殖腺発達を忠実に再現することを示しています¹⁷。この技術は、ショウジョウバエの胚性生殖腺にとってその種の最初で唯一のものです。

ここでは、後期胚期における生殖巣のエクスビボライブイメージングに必要な解剖プロトコルを提示する。このプロトコールは、薬理学的処置、または生殖腺内の特定の細胞系譜のトランスジェニック操作と組み合わせることができる。この技術を用いて、幹細胞ニッチ形成¹⁷のステップを画像化することに成功した。したがって、このイメージングアプローチは、自然環境内でニッチ形成の初期段階をリアルタイムで視覚化できるため、幹細胞生物学の分野にとって有益です^15,17。この方法は幹細胞生物学の分野にとって有益であるが、細胞再配列22、^細胞接着2、¹²、23、および細胞遊走²³を含む、この発生時点の間に生殖腺で起こる任意の動的プロセスを視覚化するためにさらに適用可能である。したがって、この解剖プロトコルは、多くの基本的な細胞生物学的プロセスに関する私たちの理解を深めるでしょう。

プロトコル

1. 解剖前日の準備

1. 得られた直径が約0.03mmとなるようにタングステン針²⁴ を電解的に鋭くする。供給電圧を約14Vに調整し、3.3MのNaOHを使用してください。シャープニングには1〜2分しかかかりません。
   注意:NaOHは非常に腐食性があり、皮膚と接触すると火傷を引き起こします。取り扱い中は手袋とゴーグルを着用し、ヒュームフード内で作業してください。
   注:使用後は、NaOHをポリプロピレン製のファルコンチューブに保管してください。
2. 準備した撮像媒体を作る。15 mL の円錐管で、4.25 mL のシュナイダー培地を 750 μL のウシ胎児血清 (FBS、最終濃度 15%)および 27.5 μL のペニシリン-ストレプトマイシン (0.05 U/μL のペニシリン、0.05 μg/μL の最終濃度) と組み合わせます。この調製した撮像媒体を4°Cで保存する。
3. ヘプタン接着剤溶液を作る。約20 cmの両面テープで詰めた20 mLの密封可能なバイアルに約0.5 mLのヘプタンを加える。ヌテーターを約1時間揺らすか、水とグリセロールの一貫性が達成されるまでピペットチップで攪拌します。溶解した接着剤のこの溶液は、ヘプタンが蒸発する前に数日間持続する。溶液を新鮮にするために、さらに0.5mLのヘプタンを加え、そして岩を加える。
   注:効果的なヘプタン接着剤溶液は、テープに対するヘプタンの様々な比率、ならびに様々なロッキング/攪拌の持続時間を使用して調製することができる。上記の仕様は、そのような適切な解決策の1つを調製または新鮮化するための単なる提案である。

2. 胚採取—解剖の15~17時間前

1. りんご果寒天プレート²⁵に新鮮な酵母ペーストを加える。小さな穴²⁶で穿孔された空の食物瓶に成虫のハエ(生後10日未満)を加えて胚採取ケージを設置する。酵母寒天プレートを用いて収集ケージに蓋をし、ボトルにテープを貼り、プレート側を下にしてケージを25°Cの暗所インキュベーター内に1時間置いた。
   注:ハエは、胚の解剖が実体蛍光顕微鏡下で行われるため、生殖巣を蛍光的にマークする導入遺伝子、例えば six4-eGFP::Moesin²⁰を発現しなければならない。生殖腺をマークするために使用される遺伝子型のリストについては、 材料表 を参照してください。
2. インキュベーターからケージを取り出し、この最初のコレクションを捨てます。それを新しく酵母たての寒天プレートと交換し、ケージをインキュベーターに2時間戻します。
   注:最初の胚収集は、受精し、発達中の胚の雌をクリアし、タイトなタイミングの胚の第2の収集を達成するために使用される。
3. 寒天プレートをケージから取り出し、密封可能なプラスチック容器内の湿ったペーパータオルの上に(酵母の側を上に向けて)置きます。この湿ったチャンバーを25°Cのインキュベーターに入れ、胚を14.5時間熟成させます(最終年齢、産卵後14.5〜16.5時間)。
   メモ: 手順 2.4 を開始する直前に、手順 3.1 および 3.2 を完了します。
4. 寒天プレートをインキュベーターから取り出し、ホヤボトルを使用して、寒天プレートに十分な水を加え、ペイントブラシで軽くブラッシングして酵母ペーストを溶解させる。胚をすすぎ、酵母を計量ボートの中に置かれた小さなメッシュスクリーンバスケットに溶かします。ほとんどの酵母ペーストがメッシュを通してろ過されるまで、水ホヤボトルでバスケットをすすいでください。
5. 計量ボートから水を取り除き、バスケットを中に入れ直します。胚を50%漂白剤溶液に浸すことによって胚を脱絨毛し、ホヤ瓶を使用する。漂白剤溶液の深さは3〜5mmでなければなりません。胚を漂白剤に沈めて約2分間保ち、時折渦巻く。
   警告: 漂白剤は腐食性があり、目や気道を刺激したり損傷させたりする可能性があります。漂白剤を取り扱うときは、手袋とゴーグルを着用してください。
   メモ: この間、ステップ 3.3 のできるだけ多くを完了して下さい。脱絨毛の進行は、バスケットを実体顕微鏡下に置き、背側付属器がないかどうかを確認することによって確認することができる。必要に応じて、胚を漂白剤溶液にさらに時間沈める。
6. 漂白剤を捨て、バスケット内の胚をホヤ瓶の水で徹底的にすすいでください(約3秒間、メッシュバスケットをペーパータオルで吸い取り、2〜3回繰り返します)。

3. 解剖日の準備

1. 1.5 mL エッペンドルフチューブ (最終濃度 0.2 mg/mL) で 1,500 μL 調製したイメージング培地 (ステップ 1.2 を参照) に 30 μL インスリン (10 mg/mL) を追加します。よく混ぜ合わせ、チューブをベンチトップに残して室温まで平衡化します。
2. 接着剤でコーティングされたカバースリップストリップを準備します。
   1. ダイヤモンドの先端を持つナイフを使用して、22 mm x 22 mmのカバースリップを4つの同じサイズのストリップに切ります(図1A)。
   2. 鉗子を使用してストリップを1つ拾い上げ、合計約30μLのヘプタン接着剤溶液をストリップの両側に広げます(図1B)。接着剤残渣の均一な層を達成するには、ヘプタンが蒸発している間にストリップを様々な角度で傾ける。
   3. 接着剤で覆われたストリップをカバースリップボックスの空のスロットに保管してください。粘着性を維持するには、ストリップを斜めに、しかし直立した位置に置き、箱の端にもたれかかって箱の表面との接触を最小限に抑えます(図1C)。空気中の微粒子が接着剤をコーティングし、その粘着性を軽減しないように箱を閉じます。
3. ベンチトップに次のアイテムを置きます:6インチガラスパスツールピペット、顕微鏡スライド、適切なピペットチップを備えたP200およびP1000ピペットマン、リンゲル溶液²⁷ (NaOHでpHを7.3に調整)、および覆われていないPoly-D-リジンコーティングされた35mmイメージングディッシュ。
4. メッシュスクリーンバスケットから、500~750μLのヘプタンで満たされた小さな時計皿に胚を移す。
   1. バスケットの側面と底をティッシュワイプで乾かします。絵筆をヘプタンで湿らせ、絵筆を胚に触れ(疎水性ビテリン膜が剛毛に付着するはずです)、絵筆を時計皿のヘプタンに戻します(胚は下に沈むはずです)。
      注:胚が乾燥するのを防ぐために、次のステップをできるだけ早く実行する必要があります。胚は20秒以上空気に曝されるべきではありません。
5. パスツールピペットを用いて胚を顕微鏡スライド上に移す(図1D)。胚をゆっくりとピペットに引き込み、ピペットの狭い部分に制限します。ピペットの胚はゆっくりとスライド上に形成され、スライドに流れる前にピペットの先端のすぐ内側に凝集します。ティッシュワイプの角を細かい先端にねじり、スライド上の胚からヘプタンを吸い取ります。それらは集約され、より小さな領域をカバーするため、次のステップで接着剤で覆われたストリップにそれらをキャプチャすることが容易になります。
6. 鉗子で、接着剤で覆われたストリップを拾い上げ、それを胚にそっと触れます(図1E)。ストリップを画像化皿に置き、胚をサイドアップし、Poly-D-リジンコーティングされた中心のすぐ外側に置きます。鉗子を使用してストリップを皿に押し付け、所定の位置に固定されていることを確認します。直ちに2〜3.5mLのリンゲル溶液で皿を浸す。胚が乾燥するのを防ぐために、最初に胚を沈めます(図1F)。

4. 解剖

メモ:これらの手順は、実体蛍光顕微鏡下で実行する必要があります。

1. 10〜15個の胚をデビテリン化する。
   注:これは、初心者のための2つの胚から、専門家のための15個の胚まで及ぶかもしれません。
   1. 腸の形態に基づいてステージ16の胚を選択します(図2)。この段階では、胚には3つの腸狭窄があり、4つの積み重ねられた腸セグメントを作り出します(図2 B、B ')。デビテル化を開始するには、選択した胚をタングステン針で一端、好ましくは前部に突き刺す。胚はそのビテリン膜から飛び出すことがありますが、そうでない場合は、胚から膜を剥がします。
      注:解剖するには若すぎる胚は、非局所化された腸を有する(図2C)。ステージ17胚の解剖は可能であるが、キューティクルがこの段階で発達し始めているため、ステージ16胚の解剖よりも困難である。初期段階17胚は、互いに相対的にシフトした4つの腸管セグメントを有する(図2D,D ́)。
   2. 生殖腺から遠く離れた領域の胚に針を引っ掛ける。引っ掛けられた胚を皿のポリリジンコーティング領域(ここ以降は単に「カバースリップ」と呼ばれる)に移し、それが付着するまで底にドラッグする。これらのステップを繰り返し、ポリリジンコーティングされたカバースリップの上部に沿って一列にデビテリン化胚を配置し(図3A)、さらなる解剖のために下に十分なスペースを残します。
      注:生殖巣は、使用される特定のマーカーおよび導入遺伝子のコピー数に応じて、明るく蛍光を発するはずの細胞の小さな球状の凝集体として現れる。この段階では、生殖腺はセグメントA5において横方向に位置し、前部からの胚長の約70%〜80%に位置する。解剖プロトコル全体を通して、組織は針にくっつくことがあります。針から破片を取り除くには、リンガーの溶液の表面のすぐ上に持ち上げます。デビテリン化は、生殖腺の適切なものができるだけ乱されない限り、乱れにくいことがあります。
2. 生殖腺を胚から取り出して皿にフィネスします(図3C、D)。
   1. まず、胚をファイリングしてその内部を露出させます(図3C)。胚をその中心からスライスし、針を後方に、生殖腺の間で移動させる。これは外部のキューティクルよりもはるかによく皿にくっつくので、いくつかの内部組織をからかいます。組織の粘着性は、生殖腺を明らかにし、それがカバースリップに付着することを可能にする次の操作を可能にする。
      注:組織が皿に付着していない場合は、コーティングされたカバースリップの汚染されていない領域に同軸にしてみてください。カバースリップの外側の領域は特に粘着性があります。ステップ4.1.2で述べたように、生殖腺が無傷のままである限り、解剖操作によって胚の死体が壊れたかどうかは問題ではない。
   2. 針を使用して生殖腺の周りをスライスし、生殖腺を含む組織の一部が残りの死体から分離されるまで切ります。針で、この組織をコーティングされたカバースリップの新鮮な領域に引き込み、それが皿に付着するまで底に同軸にします。
      注:最良のイメージングは、生殖腺自体がカバースリップに直接付着する場合に達成されます, オーバーリーティッシュを介して間接的に付着するのではなく、.したがって、組織が死体から遠ざかるように、生殖腺が無関係な組織ではなく、まずカバースリップに触れるように試みる。
   3. 接着組織を針で生殖腺からそっと引き離すことによって、できるだけ多くの周囲の組織を生殖腺から取り除く(図3D)。生殖腺に直接触れると生殖腺が損傷することは避けてください(図4E)。生殖腺が皿に十分に接着されるようにするには、生殖腺の周りを緩やかな円運動で針を動かし、移動する場合は、残りの付着組織に針を触れ、粘着性のカバースリップの新鮮な領域に生殖腺を向けます。生殖腺の検出可能な動きがなくなるまでこのプロセスを繰り返します。
   4. 胚の死骸に戻り、第2生殖巣を解剖する。このプロセスをできるだけ多くの胚で繰り返すが、25分を超えないようにしてください。組織生存率は、約40〜45分以上後にリンゲルの溶液中で損なわれます。
3. 解剖が完了したら、消えないマーカーを使用してイメージング皿の外縁にレジストレーションマークを追加し、解剖中の向きを記録します。
4. 接着剤でコーティングされたストリップを皿から取り出します。
   1. ストリップの下に一対の鉗子の底のプロングを静かに挿入し、ストリップを留めてゆっくりと上に傾けて、付着した生殖腺の乱れを最小限に抑えるために、リンガーの溶液のスロッシングをできるだけ少なくして皿から解放します。
      注:ストリップは、解剖された生殖腺から離れて傾ける必要があります。
5. リンゲル溶液のスロッシングを避けるように、皿をイメージング顕微鏡にそっと運びます。

5. イメージング

1. ステージホルダー内に撮像皿を置き、レジストレーションマークを用いて、解剖時と同様におおよその向きで皿を配置する。明視野顕微鏡と低消費電力(約10倍)の対物レンズを使用して、カバースリップに付着している組織片を特定し、焦点を合わせます。接眼レンズの設定を切り替えて蛍光を明らかにし、両眼接眼レンズを使用して皿を体系的にスキャンし、イメージングソフトウェア内の各生殖腺の位置をマークします( 材料表を参照)。
   注: 位置をマークする前に、生殖腺が視野の中央に配置されていることを確認してください。
2. イメージング皿をホルダーに入れた状態でステージホルダーアセンブリ全体を慎重に取り外し、アセンブリをワークベンチに置きます。
3. リンゲル溶液をインスリンを含む調製したイメージング媒体と交換する(ステップ1.2および3.1を参照)。
   1. P1000を使用して、イメージングディッシュの内側上部棚からすべてのリンゲル溶液を除去します(中央カバースリップ領域からリンゲル液をピペットで拭かないでください)。次に、P200に切り替えて、その先端を中央領域の残りのリンガーの表面のすぐ下に置きます。50~100 μLのリンゲルを慎重に除去する。ソリューション全体を削除しないでください。
   2. 約200μLのイメージングメディアを引き出し、残りのリンゲルの表面のすぐ下にP200チップを再び配置して、このイメージングメディアをゆっくりと追加します。次に、残りのイメージングメディア(約1,300μL)をディッシュに加え、上棚の最外縁から開始します。ピペッティング中は、流体の中央ドームに向かって移動し、最終的にピペットチップを両方にブラッシングして2つをマージします。皿に蓋をします。
      メモ:イメージングメディアは、蒸発を防ぐために、ディッシュの内径全体を深さ約2mmで覆う必要があります(図4D)。
4. 顕微鏡を高出力対物レンズ(63x、1.2 NA)に切り替え、使用する対物レンズ(対物レンズに必要な液浸流体の種類と屈折率)に基づいて適切な浸漬流体を適用し、ステージホルダーアセンブリを交換します。明視野顕微鏡を使用して、イメージング皿の底に付着した組織に焦点を合わせます。
   注: ステージが移動されなかった場合、目標がフォーカスされると、最後の生殖腺が視界に入ります。
5. マークされた各生殖腺の位置をステップ実行し、必要に応じてその位置を調整します。画像の明瞭さ、生殖腺の性別などに基づいて、画像化する生殖腺を選択します。イメージング設定(マルチチャンネル、露光時間、レーザー強度、Zシリーズ増分、適切な間隔でのタイムラプスなど)をカスタマイズします。イメージングを開始します。
   注:雄性生殖腺は、ニッチと生殖腺の反対側の端、男性特異的体性生殖腺前駆体(msSGP)と呼ばれる小さくて円形の体細胞のクラスターの両方の存在によって識別することができる。 64-eGFP::moesin蛍光マーカーを使用する場合、ニッチ細胞は生殖腺内で2番目に明るい細胞であり、最も明るいのはmsSGPである。この段階では、女性の生殖腺はニッチもmsSGPも持っていません。

結果

「解剖準備の日」で説明したように画像化皿の調製を 図1に例示する。これらの方法は、最終的に、十分に水和した胚をカバースリップストリップに接着させ、これを皿の底に一時的に固定し、リンガーの溶液に沈める結果となるはずである(図1F)。ダイヤモンド先端のナイフを使用すると、22 x 22 mmのカバースリップを3~4本の小さなストリップにき...

ディスカッション

性腺形成の間、胚性生殖巣、特に雄性生殖巣¹⁵内の幹細胞ニッチは、急速な形態学的変化を受ける。これらのダイナミックな変化の根底にある発達メカニズムは、ライブイメージング技術によって最もよく理解されます。しかしながら、胚期ステージ17では、大規模な筋肉収縮¹⁷の発症により生殖巣の生体内イメージングが不可能になる。このプロト?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024