Вскрытие и живая визуализация поздней эмбриональной гонады дрозофилы

Резюме

Здесь мы предоставляем протокол вскрытия, необходимый для живого изображения поздней эмбриональной мужской гонады дрозофилы . Этот протокол позволит наблюдать динамические клеточные процессы в нормальных условиях или после трансгенных или фармакологических манипуляций.

Аннотация

Мужская эмбриональная гонада Drosophila melanogaster является выгодной моделью для изучения различных аспектов биологии развития, включая, но не ограничиваясь, развитием половых клеток, биологией пиРНК и формированием ниш. Здесь мы представляем технику препарирования для живого изображения гонады ex vivo в период, когда живая визуализация in vivo крайне неэффективна. В этом протоколе описывается, как перенести эмбрионы в тарелку для визуализации, выбрать соответствующие мужские эмбрионы и рассечь гонаду от окружающих тканей, сохраняя при этом ее структурную целостность. После вскрытия гонады могут быть изображены с помощью конфокального микроскопа для визуализации динамических клеточных процессов. Процедура вскрытия требует точного времени и ловкости, но мы даем представление о том, как предотвратить распространенные ошибки и как преодолеть эти проблемы. Насколько нам известно, это первый протокол рассечения для эмбриональной гонады Drosophila , и он позволит получать живую визуализацию в течение недоступного периода времени. Этот метод может быть объединен с фармакологическими или специфическими трансгенными манипуляциями клеточного типа для изучения любых динамических процессов, происходящих внутри или между клетками в их естественной гонадной среде.

Введение

Яичко Drosophila melanogaster послужило парадигмой для нашего понимания многих динамических клеточных процессов. Исследования этой модели пролили свет на регуляцию деления стволовых клеток ^1,2,3, развитие половых клеток ^4,5, биологию пиРНК ^6,7,8 и сигнальные события нишевых стволовых клеток ^{9,10,11,12,13}. Эта модель выгодна, потому что она генетически поддается^{лечению 14,15} и является одной из немногих, где мы можем воспроизвести стволовые клетки в их естественной среде ^3,16,17,18. Тем не менее, живая визуализация этой модели была ограничена взрослой тканью и ранними эмбриональными стадиями, оставляя пробел в наших знаниях о динамике гонад у позднего эмбриона, точной стадии, когда ниша впервые формируется и начинает функционировать.

Эмбриональная гонада поздней стадии представляет собой сферу, состоящую из соматических нишевых клеток в передней части и половых клеток, энцистированных соматическими гонадными клетками в более задних областях¹⁹. Этот орган может быть изображен живым in vivo вплоть до ранней эмбриональной стадии 17 17,20,21. Дальнейшая визуализация предотвращается из-за инициирования крупномасштабных мышечных сокращений. Эти сокращения настолько серьезны, что выталкивают гонаду из кадра изображения, и такое движение не может быть исправлено с помощью программного обеспечения для визуализации. Наша лаборатория заинтересована в раскрытии механизмов формирования ниши, которое происходит в этот неуловимый период для живой визуализации. Поэтому мы создали подход ex vivo к живому изображению гонады, начиная с эмбриональной стадии 16, облегчая изучение динамики клеток в этот критический период развития гонад. Предыдущая работа нашей лаборатории показывает, что эта визуализация ex vivo точно повторяет развитие in vivo ^{gonad 17}. Эта методика является первой и единственной в своем роде для эмбриональной гонады дрозофилы.

Здесь мы представляем протокол рассечения, необходимый для визуализации гонады ex vivo в режиме реального времени на поздних эмбриональных стадиях. Этот протокол может сочетаться с фармакологическим лечением или трансгенными манипуляциями с конкретными клеточными линиями в пределах гонады. Используя эту технику, мы успешно изобразили этапы формирования ниши стволовых клеток¹⁷. Таким образом, этот подход к визуализации играет важную роль в области биологии стволовых клеток, поскольку он позволит визуализировать начальные стадии формирования ниши в режиме реального времени в естественной среде^15,17. Хотя этот метод полезен для области биологии стволовых клеток, он дополнительно применим для визуализации любых динамических процессов, происходящих в гонаде в течение этой временной точки развития, включая клеточные перестройки²², клеточную адгезию ^2,12,23 и миграцию клеток²³. Таким образом, этот протокол рассечения улучшит наше понимание многих фундаментальных клеточных биологических процессов.

протокол

1. Подготовка за день до вскрытия

1. Электролитически заточите вольфрамовую иглу²⁴ таким образом, чтобы полученный диаметр составлял приблизительно 0,03 мм. Отрегулируйте подаваемое напряжение примерно до 14 В и используйте 3,3 М NaOH. Заточка должна занимать не более 1 или 2 мин.
   ВНИМАНИЕ: NaOH обладает высокой коррозионной активностью и вызывает ожоги при контакте с кожей. Носите перчатки и очки во время управления и работайте внутри вытяжного капюшона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После использования храните NaOH в полипропиленовой трубке Falcon.
2. Сделайте подготовленный носитель изображений. В конической пробирке объемом 15 мл соедините 4,25 мл среды Шнайдера с 750 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS, конечная концентрация 15%) и 27,5 мкл пенициллина-стрептомицина (0,05 ЕД/мкл пенициллина, конечная концентрация 0,05 мкг/мкл). Храните подготовленный носитель изображений при температуре 4 °C.
3. Внесите гептан-клеевой раствор. Добавьте около 0,5 мл гептана в герметичный флакон объемом 20 мл, набитый двусторонней лентой длиной около 20 см. Помешивайте на нутаторе около часа или перемешивайте кончиком пипетки до тех пор, пока не будет достигнута консистенция между консистенцией между водой и глицерином. Этого раствора растворенного клея хватит на несколько дней, прежде чем гептан испарится. Чтобы освежить раствор, добавляют дополнительно 0,5 мл гептана и камень.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективный гептан-клеевой раствор может быть приготовлен с использованием различных соотношений гептана к ленте, а также различной продолжительности раскачивания/перемешивания. Приведенные выше спецификации являются всего лишь предложениями по приготовлению или освежению одного такого адекватного решения.

2. Сбор эмбрионов — за 15–17 ч до рассечения

1. Добавьте свежую дрожжевую пасту в тарелку агара для яблочного сока²⁵. Создайте клетку для сбора эмбрионов, добавив взрослых мух (менее 10 дней) в пустую бутылку с едой, перфорированную небольшими отверстиями²⁶. Закройте клетку для сбора с помощью дрожжевой агаровой пластины, приклеенной к бутылке, и поместите клетку с пластиной вниз в темный инкубатор при температуре 25 °C на 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи должны экспрессировать трансген, который будет флуоресцентно маркировать гонаду, например, six4-eGFP::Moesin²⁰, потому что рассечение эмбрионов будет происходить под стереофлуоресцентным микроскопом. Смотрите Таблицу материалов для списка генотипов, используемых для маркировки гонады.
2. Извлеките клетку из инкубатора и выбросьте этот первый сбор. Замените его на тарелку со свежедрожжевым агаром и поместите клетку обратно в инкубатор на 2 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первая коллекция эмбрионов используется для очистки самок от оплодотворенных, развивающихся эмбрионов, для достижения сжатого времени второго сбора эмбрионов.
3. Снимите агаровую пластину из клетки и поместите ее (дрожжевой стороной вверх) на влажное бумажное полотенце внутри герметичного пластикового контейнера. Поместите эту влажную камеру в инкубатор с температурой 25 °C, чтобы состарить эмбрионы в течение 14,5 ч (последний возраст, 14,5–16,5 ч после откладывания яиц).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно перед началом шага 2.4 выполните шаги 3.1 и 3.2.
4. Выньте агаровую пластину из инкубатора и, используя бутылку для брызг, добавьте достаточно воды в агаровую пластину, чтобы растворить дрожжевую пасту, слегка кистью. Промойте эмбрионы и растворенные дрожжи в небольшой корзине для сетки, сидящей внутри весовой лодки. Промойте корзину бутылкой с брызгами воды до тех пор, пока большая часть дрожжевой пасты не профильтруется через сетку.
5. Извлеките воду из весовой лодки и поместите корзину обратно внутрь. Дехорионируйте эмбрионы, погружая их в 50% раствор отбеливателя, используя флакон для брызг. Отбеливающий раствор должен иметь глубину 3–5 мм. Держите эмбрионы погруженными в отбеливатель в течение ~ 2 мин, со случайным закручиванием.
   ВНИМАНИЕ: Отбеливатель является коррозионным и может раздражать или повреждать глаза и дыхательные пути. Надевайте перчатки и очки при обращении с отбеливателем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: За это время выполните как можно больше шага 3.3. Прогресс дехорионации можно проверить, поместив корзину под стереомикроскоп и проверив отсутствие дорсальных придатков. Погрузите эмбрионы в отбеливающий раствор на дополнительное время, если это необходимо.
6. Отбеливатель, и тщательно промойте эмбрионы внутри корзины водой из бутылочки с брызгами (в течение ~3 с, промокая сетчатую корзину бумажными полотенцами; повторите 2–3 раза).

3. Подготовка ко дню вскрытия

1. Добавьте 30 мкл инсулина (10 мг/мл) к 1 500 мкл подготовленной среды для визуализации (см. этап 1.2) в пробирке Эппендорфа объемом 1,5 мл (конечная концентрация 0,2 мг/мл). Хорошо перемешайте и оставьте трубку на столешнице, чтобы уравновесить ее до комнатной температуры.
2. Подготовьте полоски для обшивки, покрытые клеем.
   1. Используйте нож с алмазным наконечником, чтобы разрезать крышку размером 22 мм x 22 мм на четыре полосы одинакового размера (рисунок 1A).
   2. Используйте щипцы, чтобы взять одну полоску и нанести в общей сложности приблизительно 30 мкл гептан-клеевого раствора на обе стороны полосы (рисунок 1B). Чтобы получить равномерный слой остатков клея, наклоняйте полосу под различными углами, пока гептан испаряется.
   3. Храните покрытую клеем полоску в пустой прорези чехлового ящика; чтобы сохранить его липкость, поместите полосу в наклонное, но вертикальное положение, опираясь на края коробки, чтобы свести к минимуму контакт с поверхностями коробки (рисунок 1С). Закройте коробку так, чтобы частицы в воздухе не покрывали клей и уменьшали его липкость.
3. Поместите на столешницу следующие предметы: 6-дюймовую стеклянную пипетку Пастера, слайд микроскопа, пипетку P200 и P1000 с соответствующими наконечниками пипетки, раствор Рингера²⁷ (рН, скорректированный до 7,3 с NaOH) и непокрытую 35-миллиметровую посуду с поли-D-лизином.
4. Перенесите эмбрионы из корзины сетчатого экрана в небольшое часовое стекло, заполненное 500–750 мкл гептана.
   1. Промокните бока и дно корзины насухо салфеткой. Смочите кисть в гептане, прикоснитесь к кистью к эмбрионам (гидрофобная вителлиновая мембрана должна прилипать к щетине) и окуните кисть обратно в гептан в часовом стакане (эмбрионы должны опускаться на дно).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы предотвратить высыхание эмбрионов. Эмбрионы не должны подвергаться воздействию воздуха более 20 с.
5. Перенесите эмбрионы на предметное стекло микроскопа с помощью пипетки Пастера (рисунок 1D). Медленно втягивайте эмбрионы в пипетку и ограничивайте их узкой частью пипетки. Эмбрионы пипетки медленно надеваются на слайд, так что они объединяются только внутри кончика пипетки, прежде чем течь на горку. Поверните угол салфетки в тонкий наконечник и отведите гептан от эмбрионов на слайде. Они будут агрегироваться и покрывать меньшую площадь, что облегчит их захват на покрытой клеем полосе на следующем этапе.
6. Щипцами возьмите покрытую клеем полоску и осторожно прикоснитесь ею к эмбрионам (рисунок 1Е). Поместите полоску в тарелку для визуализации эмбриона вверх и сразу за пределами центра, покрытого поли-D-лизином. Прижмите полоску к блюду с помощью щипцов, чтобы убедиться, что она закреплена на месте. Немедленно залейте блюдо 2–3,5 мл раствора Рингера; Сначала погрузите эмбрионы, чтобы предотвратить их высыхание (рисунок 1F).

4. Рассечение

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги должны выполняться под стереофлуоресцентным микроскопом.

1. Девителлинизировать 10–15 эмбрионов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может варьироваться от двух эмбрионов, для начинающих, до пятнадцати эмбрионов, для экспертов.
   1. Выберите эмбрионы стадии 16 на основе морфологии кишечника (рисунок 2). На этом этапе эмбрионы имеют три сужения кишечника, которые создают четыре сложенных сегмента кишечника (рисунок 2B, B'). Чтобы начать девителлинизацию, прокалывают выбранный эмбрион одним концом, предпочтительно передним, вольфрамовой иглой. Эмбрион может выскочить из своей вителлиновой мембраны, но если нет, снимите мембрану с эмбриона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы, которые слишком молоды для рассечения, имеют нерегирализованные кишки (рисунок 2C). Рассечение эмбрионов стадии 17 возможно, но более сложно, чем рассечение эмбрионов стадии 16, потому что кутикула начинает развиваться на этой стадии. Эмбрионы ранней стадии 17 с четырьмя сегментами кишечника, которые смещены относительно друг друга (рисунок 2D, D').
   2. Зацепите иглу через эмбрион в области, удаленной от гонад. Перенесите крючковатый эмбрион в область блюда, покрытую полилизином (отсюда называется просто «скольжение крышки») и перетащите его на дно, пока оно не прилипнет. Повторите эти шаги и расположите девителлинизированные эмбрионы в ряд вдоль верхней части покрытой полилизином крышки (рисунок 3A), оставляя достаточно места внизу для дальнейшего рассечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гонады выглядят как небольшие сферические агрегаты клеток, которые должны ярко флуоресцировать, в зависимости от конкретного используемого маркера и номера трансгенной копии. На этой стадии гонады расположены латерально в сегменте А5, примерно на 70-80% длины эмбриона от передней. На протяжении всего протокола рассечения ткань может прилипать к игле. Чтобы избавить иглу от мусора, поднимите ее чуть выше поверхности раствора Рингера. Девителлинизация может быть неопрятной до тех пор, пока сама гонада нарушается как можно меньше.
2. Вытяните гонады из эмбриона на блюдо (рисунок 3C,D).
   1. Во-первых, филе эмбриона обнажить его внутреннюю часть (рисунок 3C). Прорежьте эмбрион от его центра, переместив иглу кзади, между гонадами. Выдразните какую-нибудь внутреннюю ткань, так как это будет прилипать к блюду гораздо лучше, чем к внешней кутикуле. Липкость ткани позволит при следующих манипуляциях раскрыть гонаду и позволить ей прилипнуть к покровному скольжению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не прилипает к блюду, попробуйте уговорить ее на незагрязненную область покрытого крышки; внешние области скольжения крышки будут особенно липкими. Как указано на этапе 4.1.2, не имеет значения, приводят ли манипуляции по рассечению к искажению туши эмбриона, если гонады остаются невредимыми.
   2. Используйте иглу, чтобы разрезать вокруг гонады, пока кусок ткани, включая гонаду, не отделится от оставшейся туши. С помощью иглы притяните эту ткань к свежей области покрытого крышкой и угоните ее к дну, пока она не прилипнет к блюду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшая визуализация будет достигнута для тех случаев, когда сама гонада прикрепляется непосредственно к крышке, а не косвенное прикрепление через вышележащую ткань. Поэтому, поскольку ткань удаляется от туши, постарайтесь, чтобы гонада сначала соскользнула с крышкой, а не посторонней тканью.
   3. Удалите как можно больше окружающих тканей из гонады (рисунок 3D), осторожно оттащив адгезивную ткань от гонады с помощью иглы. Избегайте непосредственного прикосновения к гонаде, которое может повредить ее (рисунок 4E). Чтобы убедиться, что гонада достаточно прилипла к блюду, переместите иглу мягким круговым движением вокруг гонады — если она движется, прикоснитесь иглой к оставшейся адгезионной ткани и направьте гонаду к свежей области липкого покрова. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет обнаружено движение гонады.
   4. Вернитесь к туше эмбриона и рассекните вторую гонаду. Повторите этот процесс на как можно большем количестве эмбрионов, но НЕ превышайте 25 минут. Жизнеспособность тканей будет нарушена в растворе Рингера через более чем ~ 40-45 мин.
3. После завершения рассечения используйте несмываемый маркер для добавления регистрационных знаков к внешнему краю тарелки для визуализации, чтобы записать ее ориентацию во время рассечения.
4. Снимите с посуды полоску, покрытую клеем.
   1. Осторожно вставьте нижний зубец пары щипцов под полосу, застегните и медленно наклоните полоску вверх, чтобы освободить ее от тарелки с как можно меньшим выплескиванием раствора Рингера, чтобы свести к минимуму нарушение прилипших гонад.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полоса должна быть наклонена в сторону от рассеченных гонад.
5. Осторожно поднесите блюдо к микроскопу визуализации таким образом, чтобы избежать выплескивания раствора Рингера.

5. Визуализация

1. Поместите тарелку для визуализации в держатель сцены, используя регистрационные знаки, чтобы поместить блюдо в приблизительную ориентацию, как во время рассечения. Используя микроскопию с ярким полем и маломощную (~ 10x) цель, определите и сфокусируйте любой кусок ткани, который прилип к крышке. Переключите настройки окуляра, чтобы выявить флуоресценцию, и с помощью бинокулярных окуляров систематически сканируйте тарелку, отмечая положение каждой гонады в программном обеспечении для визуализации (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что гонады центрированы в поле зрения, прежде чем отмечать позиции.
2. Аккуратно снимите весь узел держателя сцены с тарелкой для визуализации в держателе и поместите сборку на рабочий стол.
3. Замените раствор Рингера подготовленной средой визуализации, содержащей инсулин (см. шаги 1.2 и 3.1).
   1. Используйте P1000, чтобы удалить весь раствор Рингера с внутреннего верхнего выступа тарелки для визуализации (не пипетку Рингера из центральной области скольжения крышки). Затем переключитесь на P200 и поместите его наконечник прямо под поверхность оставшегося Ringer's в центральной области. Осторожно удалить 50–100 мкл Рингера; НЕ удаляйте весь раствор.
   2. Вытяните ~ 200 мкл носителя изображения и, снова поместив наконечник P200 прямо под поверхность оставшегося носителя Рингера, медленно добавьте этот носитель изображений. Затем добавьте оставшиеся носители изображения (~1 300 мкл) в тарелку, начиная с самого внешнего края верхнего выступа. Во время пипетки переместитесь к центральному куполу жидкости и в конечном итоге объедините их, проведя кончик пипетки по ним обоим. Поставьте крышку на блюдо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носители изображений должны покрывать весь внутренний диаметр тарелки с глубиной около 2 мм, чтобы предотвратить испарение (рисунок 4D).
4. Переключите микроскоп на объектив более высокой мощности (63x, 1.2 NA), примените правильную иммерсионную жидкость в зависимости от используемого объектива (тип погружной жидкости и показатель преломления, требуемый объективом), а затем замените держатель ступени в сборе. Используйте микроскопию Яркого поля, чтобы сосредоточиться на ткани, прикрепленной к нижней части тарелки для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если этап не был перемещен, последняя гонада должна появиться после того, как цель будет сфокусирована.
5. Пройдитесь по каждому отмеченному положению гонады и отрегулируйте это положение по мере необходимости. Выберите, какие гонады для изображения, основываясь на четкости изображения, сексе гонад и т. Д. Настройка параметров изображения (многоканальность, время экспозиции, интенсивность лазера, приращения Z-серии, замедленная съемка с соответствующими интервалами и т. д.). Начните визуализацию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мужские гонады могут быть идентифицированы по наличию как ниши, так и на противоположном конце гонады, кластера небольших, очень круглых соматических клеток, называемых мужскими соматическими предшественниками гонад (msSGP). Если используется флуоресцентный маркер six4-eGFP::moesin, нишевые клетки являются вторыми по яркости клетками в гонаде, самыми яркими из которых являются msSGP. На этом этапе женские гонады не имеют ниши, ни msSGP.

Результаты

Мы иллюстрируем приготовление блюда для визуализации на рисунке 1, как описано в разделе «Подготовка ко дню вскрытия». Эти методы должны в конечном итоге привести к тому, что хорошо гидратированные эмбрионы будут прилипать к покровной скользящей полосе, которая временн...

Обсуждение

Во время гонадогенеза эмбриональная гонада, и особенно ниша стволовых клеток в мужской гонаде¹⁵, претерпевает быстрые морфологические изменения. Механизмы развития, лежащие в основе этих динамических изменений, лучше всего понимаются с помощью методов визуализации в реал...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024