JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا العمل نهجا من أسفل إلى أعلى لهندسة القوى المغناطيسية المحلية للسيطرة على تنظيم الخلايا العصبية. الخلايا العصبية مثل محملة الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNPs) مطلية فوق وتسيطر عليها منصة صغيرة منقوشة مع المغناطيسية عمودي. كما وصفها هي التوصيف المغناطيسي، امتصاص MNP الخلوية، وقابلية الخلية، والتحليل الإحصائي.

Abstract

القدرة على توجيه الخلايا العصبية إلى الشبكات العصبية المنظمة له آثار كبيرة على الطب التجديدي، وهندسة الأنسجة، والربط البيولوجي. وقد استهدفت العديد من الدراسات في توجيه الخلايا العصبية باستخدام الإشارات الكيميائية والتضاروبوغرافية. ومع ذلك، فإن التقارير عن الرقابة التنظيمية على نطاق ميكرون على مساحات واسعة نادرة. هنا، وقد وصفت طريقة فعالة لوضع الخلايا العصبية في مواقع محددة مسبقا وتوجيه نمو الخلايا العصبية مع دقة على نطاق ميكرون، وذلك باستخدام منصات مغناطيسية جزءا لا يتجزأ من العناصر المغناطيسية المنقوشة الدقيقة. وقد ثبت أن تحميل الخلايا العصبية مع الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNPs) يحولها إلى وحدات مغناطيسية حساسة يمكن أن تتأثر بالتدرجات المغناطيسية. بعد هذا النهج، تم تصنيع منصة مغناطيسية فريدة من نوعها على خلايا PC12، نموذج مشترك يشبه الخلايا العصبية، كانت مطلية ومحملة بالجسيمات النانوية المغناطيسية الفائقة. تم إيداع أفلام رقيقة من الطبقات المتعددة المغناطيسية الحديدية (FM) مع مغناطيسية عمودية مستقرة لتوفير قوى جذب فعالة نحو الأنماط المغناطيسية. هذه الخلايا PC12 MNP محملة، مطلية ومتمايزة فوق المنصات المغناطيسية، كانت مرتبطة بشكل تفضيلي إلى الأنماط المغناطيسية، وكان نمو neurite تتماشى بشكل جيد مع شكل نمط، وتشكيل الشبكات الموجهة. يتم عرض طرق التوصيف الكمي للخصائص المغناطيسية ، وامتصاص MNP الخلوي ، وقابلية الخلية ، والتحليل الإحصائي للنتائج. هذا النهج يمكن من السيطرة على تشكيل الشبكة العصبية ويحسن واجهة الخلايا العصبية إلى القطب الكهربائي من خلال التلاعب القوى المغناطيسية، والتي يمكن أن تكون أداة فعالة للدراسات المختبرية للشبكات، ويمكن أن تقدم اتجاهات جديدة العلاجية biointerfacing.

Introduction

Micropatterning من الخلايا العصبية يحمل إمكانات كبيرة لتجديد الأنسجة1،2،3،4،5 وتطوير الأجهزة العصبية الإلكترونية6،7،8. ومع ذلك ، فإن تحديد المواقع على نطاق ميكرون من الخلايا العصبية في قرار المكانية عالية ، كما هو الحال في الأنسجة البيولوجية ، يشكل تحديا كبيرا. يتطلب تشكيل هياكل مصممة مسبقا على هذا النطاق توجيه عمليات الخلايا العصبية من خلال التحكم محليا في حركة سوما و النمو المحوري. وقد اقترحت الدراسات السابقة استخدام الإشارات الكيميائية والفيزيائية9,10,11,12 لتوجيه نمو الخلايا العصبية. هنا، يركز نهج جديد على التحكم في تحديد مواقع الخلايا من خلال تدرجات المجال المغناطيسي13و14و15و16و17،وتحويل الخلايا المحملة بال MNPs إلى وحدات حساسة مغناطيسيا، والتي يمكن التلاعب بها عن بعد.

Kunze وآخرون، الذين يتميزون القوة اللازمة للحث على الاستجابات الخلوية باستخدام رقاقة المغناطيسي و MNP الخلايا المحملة، أثبتت أن استطالة أكسنال في وقت مبكر يمكن أن يكون سببها التوتر الميكانيكي داخل الخلايا18. وأكد تاي وآخرون أن الركائز الدقيقة المصنعة مع تدرجات المجال المغناطيسي المحسنة تسمح بالتحفيز اللاسلكي للدوائر العصبية التي يتم غمرها بال MNPs باستخدام أصباغ مؤشر الكالسيوم19. وعلاوة على ذلك، Tseng وآخرون تجمع الجسيمات النانوية داخل الخلايا، مما أدى إلى القوى المترجمة بوساطة الجسيمات النانوية التي اقتربت من التوتر الخلوي20. وأدى ذلك إلى تصنيع أنماط محددة من الركائز المغناطيسية الدقيقة التي ساعدت على دراسة الاستجابة الخلوية للقوى الميكانيكية. تم تحقيق التوتر الخلوي الناشئ عن تطبيق القوات المترجمة بوساطة الجسيمات النانوية عن طريق تجميع الجسيمات النانوية داخل الخلايا20. تم تطوير نظام هجين مكمل لأكسيد المعادن (CMOS) - microfluidic من قبل Lee وآخرون الذين دمجوا مجموعة من المغناطيسات الكهربائية الدقيقة في رقاقة CMOS للتحكم في حركة الخلايا الفردية الموسومة بالخرز المغناطيسي21.

استخدم ألون وآخرون منصات مغناطيسية على نطاق صغير، مبرمجة مسبقا، ك "نقاط ساخنة" مغناطيسية لتحديد موقع الخلايا22. ويمكن أيضا تحفيز نشاط محدد داخل الخلايا باستخدام صفائف مغناطيسية صغيرة النقش لترجمة الجسيمات النانوية في مواقع محددة دون الخلوية23. وقد ثبت امتصاص MNP الخلوية بنجاح في الخلايا العصبية الأولية اللخش, الفئران, والفأر24,25,26. هنا، وقد ثبت هذا على خط الخلية PC12 الفئران pheochromocytoma، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا لإظهار امتصاص عالية من MNPs27. في السنوات الأخيرة ، كانت هناك تطبيقات طبية مختلفة من أعضاء البرلمان ، بما في ذلك تسليم الأدوية والعلاج الحراري في علاجات السرطان28،29،30،31. على وجه التحديد، تتناول الدراسات تطبيق MNPs وشبكات الخلايا العصبية32،33،34،35. ومع ذلك ، فإن التنظيم المغناطيسي للخلايا العصبية باستخدام MNPs على مستوى خلية واحدة يستحق المزيد من التحقيق.

في هذا العمل، تم وصف نهج من أسفل إلى أعلى لهندسة القوى المغناطيسية المحلية عبر منصات مصممة مسبقا للسيطرة على ترتيب الخلايا العصبية. وقد تم تقديم تلفيق أنماط ميكرون على نطاق متعدد FM. هذا فريدة من نوعها, FM هيكل متعدد الطبقات يخلق المغناطيسية عمودي مستقرة أن يؤدي إلى قوى الجذب فعالة نحو جميع الأنماط المغناطيسية. عن طريق الحضانة، تم تحميل MNPs في خلايا PC12، وتحويلها إلى وحدات حساسة مغناطيسية. وكانت الخلايا المحملة بال MNP، المطلية والمتمايزة فوق المنصات المغناطيسية، مرتبطة بشكل تفضيلي بالأنماط المغناطيسية، وكان نمو النيوريت متوافقا بشكل جيد مع شكل النمط، مما شكل شبكات موجهة. وقد وصفت عدة طرق لوصف الخصائص المغناطيسية للمتعددة الطبقات FM وNPs, وقدمت أيضا تقنيات لامتصاص MNP الخلوية و المقايسات صلاحية الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يتم تفصيل المعلمات المورفومترية لنمو الخلايا العصبية والتحليل الإحصائي للنتائج.

Protocol

ملاحظة: إجراء كافة التفاعلات البيولوجية في خزانة السلامة الحيوية.

1. تصنيع منصة مغناطيسية

  1. الطباعة الحجرية
    1. قطع الشرائح الزجاجية إلى 2 × 2 سم2 باستخدام قلم الكتبة. تنظيف الشرائح الزجاجية في الأسيتون ثم isopropanol لمدة 5 دقائق لكل منهما في حمام سونيكيشن فائقة. جاف مع النقاء العالي جدا (UHP) النيتروجين.
    2. معطف الزجاج مع فوتوريستر باستخدام تدور طلاء في 6000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية، لتحقيق سمك 1.5 ميكرومتر، وخبز في 100 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. يعرض العينة لمصدر ضوء، باستخدام طول موجي مناسب لأخصائي التصوير الضوئي، مع النمط المطلوب، باستخدام قناع ضوئي أو رسم مطبوع أقل قناعا.
    3. تطوير لمدة 40 ق في المطور، المخفف في الماء المقطر (DW) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة؛ يغسل في DW لمدة 45 ثانية، وجافة مع غاز النيتروجين UHP. فحص النمط تحت المجهر البصري.
  2. ترسب سبوتر
    1. أدخل العينة في الغرفة الرئيسية لنظام الترسب وانتظر الضغط الأساسي (~ 5 × 10-8 تور). فتح تدفق الغاز؛ تعيين تدفق الأرجون لsputtering القياسية (28 sccm [سم مكعب قياسي لكل دقيقة) هنا. إشعال أهداف البصق، ثم تعيين ضغط البصق إلى 3 mTorr.
    2. زيادة القوة على كل هدف حتى يتم تحقيق المعدل المطلوب.
      ملاحظة: معدل Pd: 0.62 A/s = 1.0 نانومتر في 16 ثانية؛ Co80Fe20 Rate: 0.32 A/s, 0.2 نانومتر في 6.25 ثانية.
    3. تشغيل التدوير. إيداع متعدد الطبقات FM, بالتناوب بين أهداف Co80Fe20 و Pd, عن طريق فتح وإغلاق مصاريع الهدف, على التوالي. إيداع 14 طبقة ثنائية من Co80Fe20 (0.2 نانومتر) / Pd (1.0 نانومتر) ، وتنتهي بطبقة إضافية 2 نانومتر Pd.
    4. الإقلاع: نقع العينة في الأسيتون لمدة 30 دقيقة، وشطف مع ايزوبروبانول. ثم، الجافة مع النيتروجين UHP، والحفاظ على العينة في بيئة نظيفة وجافة حتى الاستخدام.

2. توصيف الجهاز المغناطيسي عن طريق قياسات النقل

  1. استخدم شريحة ركيزة أو زجاج Si مع شريط مغناطيسي على شكل صليب بعرض 100 ميكرومتر، يتم إيداعه مع طبقات FM متعددة الطبقات (انظر الشكل 1C inset). إرفاق العينة إلى حامل باستخدام الشريط على الوجهين.
  2. باستخدام سلك المستعبدين، السندات 4 أسلاك للعينة، واحد على كل ساق من القطب الصليب. تعيين حامل العينة والعينة داخل نظام قياس النقل مع مجال مغناطيسي بحيث يكون المجال المغناطيسي عموديا على العينة. إجراء القياسات في درجة حرارة الغرفة.
  3. أداء الجهد العرضي (VT)قياس الجهاز. اتبع العلامات في الشكل 1C (inset): تطبيق تيار من 1 mA بين جهات الاتصال 1 و 3; قياس VT بين الاتصالات 2 و 4؛ ثم، تطبيق التيار بين 2 و 4، وقياس الجهد بين 1 و 3. وأخيرا، حساب الفرق بين الفولتية من كل من القياسات وتقسيمها على 2 للحصول على VT. استخدم نظام تبديل للتغيير تلقائيا بين تكويني القياس.
  4. تمشيط المجال المغناطيسي بين 0.4 T إلى -0.4 T في خطوات من 5 mT وقياسV T كدالة للحقل. رسم المقاومة العرضية (VT/ I) مقابل المجال المغناطيسي لتحديد إشارة القاعة الشاذة ، والتي تتناسب مع المغناطيسية المتعامدة في الفيلم.

3. توصيف MNPs والمغناطيسية متعدد الطبقات عن طريق قياس المغناطيسي

  1. قياس المغناطيسي لتعدد الطبقات FM
    1. إيداع متعدد الطبقات FM على الركيزة Si (انظر القسم 1.2). قطع العينة إلى 6 مربعات من 4 × 4 مم2 حجم. كومة عينات واحدة على رأس الآخر وترتيبها في كبسولة عمودي على اتجاه المجال المغناطيسي (انظر الشكل 1D inset).
    2. أدخل الكبسولة في مقياس المغنطيسية و قم بقياس المغنطة في درجة حرارة الغرفة. تمشيط المجال المغناطيسي بين -0.4 T و 0.4 T.
    3. حساب الحجم الإجمالي للمادة المغناطيسية، مع الأخذ بعين الاعتبار سمك الطبقة المغناطيسية، وحجم العينات، وعدد الركائز. تقسيم المغنطة من حيث الحجم الإجمالي للمادة المغناطيسية.
    4. رسم المغناطيسية (لكل وحدة حجم) مقابل المجال المغناطيسي. طرح الخلفية ثنائية المغناطيسية للركيزة من استجابة المجال المغناطيسي عالية واستقراء مغنطة التشبع من FM من الرسم البياني.
  2. قياس المغنطيسية ل MNPs
    1. إدراج كتلة معينة من MNPs في كبسولة البوليمر الاصطناعية. النظر في حجم أكبر إذا قياس قيم تشبع مغنطة صغيرة.
    2. إذا تم تعليق أعضاء البرلمان في المذيبات، وتجفيف أعضاء البرلمان عن طريق ترك الكبسولة مفتوحة بين عشية وضحاها. أدخل الكبسولة في مقياس المغنطيسية و قم بقياس المغنطة في درجة حرارة الغرفة. تمشيط المجال المغناطيسي بين -0.2 T و 0.2 T.
    3. حساب الكتلة الإجمالية لل MNPs بضرب الحجم المعين بتركيز الجسيمات. تطبيع النتائج إلى 1 غرام.
    4. رسم المغناطيسية تطبيع (لكل غرام) مقابل المجال المغناطيسي. استقراء تشبع المغنطة من MNPs من الرسم البياني.

4. بروتوكول طلاء الكولاجين

  1. طلاء الأطباق البلاستيكية
    1. إعداد 0.01 M HCl بإضافة 490 ميكرولتر من HCl إلى 500 مل من الماء المقطر المزدوج (DDW).
      ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة فقط في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    2. تمييع الكولاجين نوع 1 (الحل من ذيل الفئران) 1:60-1:80 في 0.01 M HCl للحصول على تركيز العمل النهائي من 50 ميكروغرام / مل. ضع 1.5 مل من المحلول المخفف في طبق ثقافة 35 مم. اترك الطبق في غطاء محرك السيارة لمدة ساعة واحدة، مغطى.
    3. إزالة المحلول، وغسل 3x في المحلول الملحي المعقم 1x الفوسفات المخزنة (PBS). الطبق جاهز لزرع الخلايا.
  2. طلاء الشرائح الزجاجية
    1. تمييع الكولاجين نوع 1 (الحل من ذيل الفئران) 1:50 في 30٪ v/v الإيثانول. لطلاء طبق 35 ملم، أضف 20 ميكرولتر من الكولاجين إلى 1 مل من الإيثانول بنسبة 30٪.
    2. غطي الطبق بالمحلول، وانتظري حتى يتبخر كل المحلول، تاركا الطبق مكشوفا لبضع ساعات. غسل 3x في برنامج تلفزيوني 1x عقيمة; الشريحة الزجاجية جاهزة للبذر الخلية.

5. امتصاص MNP الخلوية وقابليتها للاستمرار

  1. امتصاص MNP الخلوي
    1. إعداد متوسط النمو الأساسي زراعة الخلايا PC12 بإضافة مصل الحصان 10٪ (HS)، 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / العقدية، و 0.2٪ أمفوتريسين إلى معهد روزويل بارك الطبي (RPMI) المتوسطة، ومرشح باستخدام مرشح النايلون 0.22 ميكرومتر.
    2. إضافة 1٪ مصل الحصان (HS)، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / العقدية، و 0.2٪ أمفوتريسين إلى RPMI المتوسطة لإعداد PC12 وسيط التمايز، ومرشح باستخدام مرشح النايلون 0.22 ميكرومتر.
    3. زراعة الخلايا في قارورة ثقافة غير المعالجة مع 10 مل من متوسط النمو الأساسي; إضافة 10 مل من متوسط النمو الأساسي إلى القارورة كل 2-3 أيام، والثقافة الفرعية الخلايا بعد 8 أيام.
    4. لامتصاص الخلوية، الطرد المركزي تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 200 × ز ودرجة حرارة الغرفة، والتخلص من supernatant.
    5. Resuspend الخلايا في 3 مل من متوسط النمو الأساسي الطازج. مرة أخرى، الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 200 × ز ودرجة حرارة الغرفة، والتخلص من supernatant. Resuspend الخلايا في 3 مل من وسط التمايز الطازجة.
    6. يستنشق الخلايا 10x باستخدام حقنة وإبرة لتفريق مجموعات الخلايا. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم، والبذور 106 خلايا في طبق 35 ملم غير المصقول العادية.
    7. أضف إلى الطبق الحجم المحسوب لتعليق MNP وحجم التمايز المتوسط لتحقيق تركيز MNP المطلوب والحجم الإجمالي. خلط الخلايا، MNPs، والتمايز المتوسطة؛ احتضان الطبق في حاضنة 5٪ CO2 مرطب في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    8. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 200 × ز في درجة حرارة الغرفة، والتخلص من supernatant. Resuspend الخلايا في 1 مل من وسط التمايز الطازجة، وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
  2. تمايز الخلايا المحملة ب MNP
    1. تنفيذ بروتوكول الامتصاص (القسم 5.1). البذور 8 × 104 MNP محملة الخلايا على 35 ملم، طبق الكولاجين نوع L المغلفة في وجود وسيطة التمايز (انظر بروتوكول طلاء الكولاجين في القسم 4.1). بعد 24 ساعة، إضافة 1:100 جديد مورين بيتا الأعصاب عامل النمو (β-NGF) (التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل).
    2. تجديد وسيط التمايز وإضافة مورين الطازجة β-NGF كل 2 أيام. صورة الخلايا كل يومين باستخدام المجهر البصري. بعد تشكيل الشبكة (6-8 أيام لخلايا PC12) ، صورة الخلايا باستخدام المجهر confocal ، ومراقبة مضان الجسيمات.
  3. اختبار قابلية البقاء للخلايا المحملة MNP: 2،3-bis-(2-methoxy-4-نيترو-5-سلفوفينيل)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) اختبار صلاحية الخلية.
    1. إعداد متوسط النمو الأساسي وفقا للخطوة 5.1.1. زراعة خلايا PC12 مع MNPs بتركيزات مختلفة (0.1 ملغم / مل، 0.25 ملغم / مل، و 0.5 ملغم / مل في متوسط النمو الأساسي) وأيضا بدون MNPs للسيطرة في ثلاثية في لوحة مسطحة 96 جيدا (الحجم الإجمالي 100 ميكرولتر / بئر). احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 5٪ CO2،حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية.
    2. إعداد آبار فارغة تحتوي على متوسطة بدون خلايا لتصحيح الخلفية. إذابة محلول كاشف XTT، ومحلول التفاعل الذي يحتوي على كبريتات الميثيل N-methyldibenzopyrazine) في حمام 37 درجة مئوية قبل الاستخدام مباشرة. دوامة بلطف حتى يتم الحصول على حلول واضحة.
    3. للحصول على لوحة واحدة من 96 بئرا، امزج 0.1 مل من محلول التنشيط مع 5 مل من كاشف XTT. إضافة 50 ميكرولتر من محلول رد الفعل على كل بئر، يهز قليلا لوحة لتوزيع حتى من الصبغة في الآبار، ومن ثم احتضان لوحة في حاضنة لمدة 5 ساعة.
    4. قياس امتصاص العينة ضد الآبار الفارغة باستخدام جهاز فحص مناعي مرتبط بالإنزيم (ELISA) القارئ على طول موجي يبلغ 450 نانومتر. قياس امتصاص المرجع باستخدام الطول الموجي من 630 نانومتر وطرحه من قياس 450 نانومتر.
    5. كما يحدث امتصاص عفوي طفيف في المتوسط ثقافة المحتضنة مع كاشف XTT في 450 نانومتر، طرح متوسط امتصاص الآبار الفارغة من أن من الآبار الأخرى. طرح قيم الإشارة من عينات متوازية من MNPs في نفس التركيزات المختبرة مثل عينات الخلية.
  4. اختبار الجدوى للخلايا المحملة MNP: اختبار صلاحية الخلية القائم على ريسازورين
    1. إعداد متوسط النمو الأساسي وفقا للخطوة 5.1.1. زراعة خلايا PC12 مع MNPs بتركيزات مختلفة (0.1 ملغ / مل، 0.25 ملغ / مل، و 0.5 ملغ / مل في متوسط النمو الأساسي) ودون MNPs كسيطرة في ثلاثية في لوحة مسطحة 96 جيدا لمدة 24 ساعة. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ عند 37 درجة مئوية. إعداد آبار فارغة تحتوي على متوسطة بدون خلايا.
    2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x. أضف الكاشف القائم على الريسازورين (10٪ ث/v) إلى الوسط واحتضنه لمدة 2 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية.
    3. ضع 150 ميكرولتر من الاقتباسات من العينات في قارئ ELISA ، وقياس الامتصاص عند طول موجي مثير قدره 560 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 590 نانومتر. طرح قيم الإشارة من العينات المتوازية من MNPs في نفس التركيزات المختبرة مثل عينات الخلية.

6. توصيف تركيز MNP داخل الخلايا باستخدام البلازما المقترنة بشكل استقرائي (ICP)

  1. إعداد متوسط النمو الأساسي وفقا للخطوة 5.1.1. زراعة خلايا PC12 مع MNPs بتركيزات مختلفة (0.1 ملغم / مل، 0.25 ملغم / مل، و 0.5 ملغم / مل في متوسط النمو الأساسي) وبدون MNPs كتحكم في ثلاثية البلورات في لوحة مسطحة 96 جيدا (الحجم الإجمالي 100 ميكرولتر / بئر). احتضان في 5٪ CO2،حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي (من كل بئر على حدة)، وخلايا الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant. Resuspend الخلايا في 1 مل من وسط التمايز الطازجة، وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
  3. Lyse الخلايا عن طريق العلاج مع 100 ميكرولتر من حمض النيتريك 70٪ لكل بئر على حدة لمدة 15 دقيقة على الأقل. إضافة 5 مل من DDW إلى الخلايا lysed وتصفية الحلول.
  4. قياس تركيز الحديد باستخدام برنامج المقارنات الدولية واستخدام عدد الخلايا لتسجيل تركيز Fe لكل خلية.

7. تمايز الخلايا والنمو على منصة مغناطيسية

  1. تنظيف الركيزة منقوشة مع 70٪ v/v/ الإيثانول ووضع الركيزة في طبق ثقافة 35 ملم في غطاء محرك السيارة. ضع مغناطيسا كبيرا (~1500 Oe) أسفل الركيزة المنقوشة لمدة دقيقة واحدة وأزل المغناطيس عن طريق تحريك الطبق أولا صعودا وبعيدا عن المغناطيس ، ثم أخرج المغناطيس من غطاء محرك السيارة. تشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
  2. معطف الركيزة مع نوع الكولاجين 1 وفقا للقسم 4.2. تعليق الخلايا بعد امتصاص MNP الخلوية (القسم 5.1)، البذور 105 خلايا في طبق ثقافة 35 ملم، وإضافة 2 مل من وسيط التمايز. احتضان الثقافة في 5٪ CO2،حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية.
  3. بعد 24 ساعة، إضافة 1:100 مورين الطازجة β-NGF (تركيز النهائي من 50 نانوغرام / مل). تجديد وسيط التمايز وإضافة مورين الطازجة β-NGF كل 2 أيام. تصوير الخلايا كل يومين باستخدام المجهر الخفيف، وبعد تكوين الشبكة، إجراء التلطخ المناعي على الخلايا (القسم 8.1).

8. MNP محملة تلطيخ الخلية

  1. توبولين مناعة
    1. إعداد 4٪ حل paraformaldehyde (PFA) عن طريق خلط 10 مل من محلول PFA 16٪ ث / v، 4 مل من برنامج تلفزيوني 10x، و 26 مل من DDW. إعداد 50 مل من 1٪ PBT بإضافة 500 ميكرولتر من السطحي غير الأيونية إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني 1x. إعداد 50 مل من 0.5٪ PBT عن طريق خلط 25 مل من 1٪ PBT مع 25 مل من برنامج تلفزيوني 1x. إعداد حل حجب عن طريق خلط 1٪ الزلال مصل البقر و 1٪ مصل حمار طبيعي في 0.25٪ PBT.
      ملاحظة: استخدام PFA فقط داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    2. إزالة المتوسطة الفائقة من الخلايا. إصلاح الخلايا المحملة MNP في 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل، داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    3. Permeabilize الخلايا المحملة MNP مع 0.5٪ PBT لمدة 10 دقيقة. احتضان الخلايا المحملة MNP أولا في حل حجب لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومن ثم مع أرنب المضادة α توبولين الأجسام المضادة في حل حجب بين عشية وضحاها في 4 °C. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل.
    4. احتضان الخلايا المحملة MNP مع Cy2-المقترنة حمار المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية لمدة 45 دقيقة في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل.
    5. إجراء التصوير البؤري. لتوبولين, استخدام الطول الموجي من الإثارة 492 نانومتر وطول موجي انبعاث 510 نانومتر. بالنسبة ل MNPs (رودامين)، استخدم طول موجي مثير قدره 578 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 613 نانومتر.
  2. تلطيخ النووية مع 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI)
    1. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل. إزالة السائل الزائد حول العينة، إضافة 1 قطرة (~ 50 ميكرولتر) من المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي على DAPI لتغطية مساحة 22 ملم × 22 ملم، واحتضان لمدة 5 دقائق في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة.
    2. غسل الخلايا المحملة MNP 3x في برنامج تلفزيوني 1x، 5 دقائق كل غسل. إجراء التصوير البؤري. بالنسبة ل DAPI ، استخدم طول موجي مثير قدره 358 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 461 نانومتر. بالنسبة ل MNPs (رودامين)، استخدم طول موجي مثير قدره 578 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 613 نانومتر.

9. القياسات والتحليل الإحصائي

  1. التحليل المورفومتري لتمايز الخلايا المحملة ب MNP
    1. لقياس عدد التقاطعات على مسافات مختلفة من جسم الخلية، والحصول على صور المرحلة من الخلايا المستزرعة تصل إلى 3 أيام بعد العلاج مع NGF.
      ملاحظة: إذا تم ذلك لاحقا، قد تقوم الخلايا بتطوير شبكات اتصال، مما يمنع قياسات دقة الخلية الواحدة.
      1. فتح الصور في برنامج معالجة الصور، ImageJ، واستخدام NeuronJ المكونات في، والتي تمكن من تتبع neurite شبه التلقائي وقياس طول36. باستخدام النيوريت التتبع المكونات في، تتبع neurites وتحويل البيانات إلى صور ثنائية. حدد مركز سوما.
      2. إجراء تحليل شول، المتاحة في NeuronJ المكونات في. حدد نصف القطر الأقصى. كرر التجربة ثلاث مرات. تحليل أكثر من 100 خلية في كل تجربة.
  2. تحليل توطين الخلايا
    1. لتحديد النسبة المئوية للخلايا المترجمة على المنطقة المغناطيسية بعد 3 أيام من الحضانة ، والحصول على الصور المجهرية confocal من الخلايا مع وبدون امتصاص MNP. استخدام تلطيخ DAPI (القسم 8.2).
    2. عد يدويا الخلايا فوق أو جزئيا فوق نمط (لمس الخلايا) والخلايا التي ليست كذلك. كرر لثلاث تجارب. تحليل أكثر من 400 خلية مع MNP ودون امتصاص.
    3. حساب النسبة النسبية للخلايا التي هي فوق الأنماط المغناطيسية من العدد الإجمالي للخلايا، مع وبدون MNPs. بالإضافة إلى ذلك، حساب النسبة المئوية للمنطقة الفعالة للنمط المغناطيسي عن طريق إضافة قطر جسم الخلية إلى عرض النمط لتحديد الاحتمال العشوائي للخلايا الهبوط على نمط مغناطيسي.
    4. إجراء عينة واحدة Z-اختبارلتحليل ما إذا كان توزيع الخلية نتيجة لهبوط الخلية متساوية الخواص, أو إذا كان هناك تحيز المفضل للنمط المغناطيسي.
  3. تحليل اتجاه النمو
    1. لقياس التأثير على اتجاه نمو نيوريت ، احصل على صور مجهرية كونفوجكال للخلايا مع وبدون علاج MNP بعد 8 أيام من الحضانة. إجراء تلطيخ المناعة (القسم 8.1).
    2. باستخدام برنامج ImageJ، قم بقياس الزاوية بين خلية neurite والمشارب المغناطيسية في كلا الشرطين.
      ملاحظة: تحليل neurites فقط التي تنشأ من سوماس تقع على المشارب المغناطيسية.
    3. رسم توزيع زوايا neurites 'نسبة إلى اتجاه المشارب (Δο). إجراء اختبار Chi-التربيعية لتوزيع Δο لإثبات أن التوزيع غير عادي أو موحد.

النتائج

تم تصنيع منصات مغناطيسية بأشكال هندسية مختلفة(الشكل 1A). تم إيداع الأنماط المغناطيسية عن طريق التخبط: 14 طبقة متعددة من Co80Fe20 و Pd ، 0.2 نانومتر و 1 نانومتر ، على التوالي. كشف المجهر الإلكتروني الارتفاع الكلي للأنماط المغناطيسية ليكون ~ 18 نانومتر (

Discussion

تظهر النتائج التمثيلية فعالية المنهجية المقدمة للتحكم في تكوين شبكة الخلايا العصبية وتنظيمها على نطاق ميكرون. وظلت خلايا PC12 المحملة من MNP قابلة للحياة وتحولت إلى وحدات حساسة مغناطيسية جذبتها القوى المغناطيسية من أقطاب FM إلى مواقع محددة. ويتجلى هذا أفضل في الشكل 5C، حيث انض...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا البحث من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا، إسرائيل، ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (569/16).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
6-well cell culture plateFALCON353846
96-well cell culture plateSPL life sciences30096
Amphotericin B solutionBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H photoresistMicroChemicals GmbH
AZ 351 B developerMicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA)Biological Industries03-010-1B
Cell and Tissue cultur flaskBiofilTCF00225075.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dishGreiner Bio-One627-16035 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based)Biological Industries20-300-1000
Centrifuge tubeBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% sputter targetACI Alloys99.95%
Collagen type ICorning Inc.354236Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscopeLeicaTCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Disposable needleKDL23 G
Disposable  syringeMedispo116022764010 mL
Donor horse serumBiological Industries04-124-1A
ELISA readerMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated)Biolab-chemicals52505
Fetal bovine serum (FBS)Biological Industries04-127-1A
Fresh murine β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame electromagnet .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measureKeithley2400
Keithley switching systemKeithley3700
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Light microscopeLeicaDMIL LED
Maskless photolithographyHeidelberg Inst.MLA150
Microscope SlidesBAR-NAORBN1042000C
Nitric acid 70%Sigma-Aldrich438073
Normal donkey serum (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 cell lineATCCCRL-1721
Pd sputter targetACI Alloys99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solutionBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagentMolecular probesA-13261resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulinSanta Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering systemOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamineBiological Industries01-100-1A
Sonication bathKUDOSSK3210HPFrequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometerQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173 PMA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved