JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, nöronal organizasyonun kontrolü için yerel manyetik kuvvetlerin mühendisliğine aşağıdan yukarıya bir yaklaşım sunun. Manyetik nanopartiküllerle (MNP) yüklenen nöron benzeri hücreler, dik manyetizasyonlu mikro desenli bir platform tarafından kaplanır ve kontrol edilir. Ayrıca manyetik karakterizasyon, MNP hücresel alım, hücre canlılığı ve istatistiksel analiz açıklanmaktadır.

Özet

Nöronları organize sinir ağlarına yönlendirme yeteneğinin rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve biyo-interfacing için büyük etkileri vardır. Birçok çalışma, nöronları kimyasal ve topoğrafik ipuçları kullanarak yönlendirmeyi amaçladı. Bununla birlikte, geniş alanlar üzerinde mikron ölçeğinde örgütsel kontrol raporları azdır. Burada, nöronların önceden ayarlanmış bölgelere yerleştirilmesi ve mikro desenli, manyetik elementlerle gömülü manyetik platformlar kullanılarak mikron ölçeğinde çözünürlükle nöronal büyümenin yönlendirilmesinde etkili bir yöntem tanımlanmıştır. Nöronların manyetik nanopartiküllerle (MNPs) yüklenmesinin onları manyetik gradyanlardan etkilenebilecek hassas manyetik birimlere dönüştürdüğü gösterilmiştir. Bu yaklaşımın ardından, yaygın bir nöron benzeri model olan PC12 hücrelerinin kaplandığı ve süperparmagnetik nanopartiküllerle yüklendiği benzersiz bir manyetik platform üretilmiştir. Manyetik desenlere doğru etkili çekim kuvvetleri sağlamak için stabil dik manyetizasyona sahip ferromanyetik (FM) çok katmanlı ince filmler birikti. Manyetik platformların üzerine kaplanmış ve farklılaştırılmış bu MNP yüklü PC12 hücreleri tercihen manyetik desenlere tutturuldu ve neurit büyüme desen şekliyle iyi hizalandı ve yönlendirilmiş ağlar oluşturdu. Manyetik özelliklerin nicel karakterizasyon yöntemleri, hücresel MNP alımı, hücre canlılığı ve sonuçların istatistiksel analizi sunulmaktadır. Bu yaklaşım, sinir ağı oluşumunun kontrolünü sağlar ve ağların in vitro çalışmaları için etkili bir araç olabilen ve yeni terapötik biyointerör yönleri sunabilen manyetik kuvvetlerin manipülasyonu yoluyla nöron-elektrot arayüzünü geliştirir.

Giriş

Nöronların mikropatternasyonu doku yenilenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir1,2,3,4,5 ve nöro-elektronik cihazların geliştirilmesi6,7,8. Bununla birlikte, nöronların biyolojik dokularda olduğu gibi yüksek uzamsal çözünürlükte mikron ölçekli konumlandırılması önemli bir zorluk teşkil eder. Bu ölçekte önceden tasarlanmış yapıların oluşturulması, soma hareketliliğini ve aksonal büyümeyi lokal olarak kontrol ederek sinir hücresi süreçlerinin yönlendirilmesini gerektirir. Önceki çalışmalar, nöronal büyümeyi yönlendirmek için kimyasal ve fiziksel ipuçları9,10,11,12'nin kullanılmasını önermiştir. Burada, yeni bir yaklaşım,13 , 14 , 15,16,17manyetik alangradyanlarıtarafından hücre konumlandırmasını kontrol etmeye odaklanır, MNP'lerle yüklü hücreleri uzaktan manipüle edilebilen manyetik duyarlı birimlere dönüştürür.

Manyetik çip ve MNP yüklü hücreler kullanarak hücresel yanıtları teşvik etmek için gereken kuvveti karakterize eden Kunze ve ark., erken aksonal uzamanın hücrelerin içindeki mekanik gerilim tarafından tetiklenebileceğini kanıtladı18. Tay ve ark. gelişmiş manyetik alan gradyanları ile mikro fabrikasyon substratların, kalsiyum gösterge boyaları19kullanılarak MNP'lerle yapılan sinir devrelerinin kablosuz uyarılmasına izin verdiğini doğruladı. Dahası, Tseng ve ark. hücrelerin içindeki nanopartikülleri birleştirdi, bu da hücresel gerilime yaklaşan lokalize nanopartikül aracılı kuvvetlerle sonuçlandı20. Bu, mekanik kuvvetlere hücresel tepkinin incelenmesine yardımcı olan tanımlanmış mikromanyetik substrat desenlerinin imalat edilmesine yol açtı. Lokalize nanopartikül aracılı kuvvetlerin uygulanmasından kaynaklanan hücresel gerilim, nanopartiküllerin hücreler içinde birleştirilmesiyle elde edilmiştir20. Manyetik boncuklarla etiketlenmiş tek tek hücrelerin hareketini kontrol etmek için CMOS çipine bir dizi mikro elektromıknatıs gömen Lee ve ark. tarafından tamamlayıcı bir metal oksit yarı iletken (CMOS)-mikroakışkan hibrid sistem geliştirilmiştir21.

Alon ve ark. hücreleri bulmak için manyetik "sıcak noktalar" olarak mikro ölçekli, önceden programlanmış, manyetik pedler kullandı22. Belirli hücre altı konumlarda nanopartikülleri lokalize etmek için mikro desenli manyetik diziler kullanılarak hücrelerde belirli aktivite uyarılabilir23. Hücresel MNP alımı sülük, sıçan ve fare birincil nöronlarında başarıyla gösterilmiştir24,25,26. Burada, bu daha önce MNPs27'ninyüksek alımını gösterdiği bildirilen bir sıçan PC12 feokromositoma hücre hattında gösterilmiştir. Son yıllarda, kanser tedavilerinde ilaç dağıtımı ve termoterapi de dahil olmak üzere MNP'lerin çeşitli tıbbi uygulamaları olmuştur28,29,30,31. Özellikle, çalışmalar MNP'lerin ve nöron ağlarının uygulanmasıyla ilgilenir32,33,34,35. Bununla birlikte, MNP'leri tek hücreli düzeyde kullanan nöronların manyetik organizasyonu daha fazla araştırmayı hak ediyor.

Bu çalışmada, nöronal düzenlemeyi kontrol etmek için önceden tasarlanmış platformlar aracılığıyla yerel manyetik kuvvetleri tasarlamak için aşağıdan yukarıya bir yaklaşım tanımlanmıştır. FM çok katmanlı mikron ölçekli desenlerin imalatı sunulmuştur. Bu benzersiz, FM çok katmanlı yapı, tüm manyetik desenlere doğru etkili çekim kuvvetleri sağlayan kararlı dik manyetizasyon oluşturur. İnkübasyon yoluyla, MNP'ler PC12 hücrelerine yüklenerek manyetik hassas birimlere dönüştürüldü. Manyetik platformların üzerinde kaplanmış ve farklılaştırılmış MNP yüklü hücreler tercihen manyetik desenlere tutturuldu ve neurit büyüme desen şekliyle iyi hizalandı ve yönlendirilmiş ağlar oluşturdu. FM çok katmanlı ve MNP'lerin manyetik özelliklerini karakterize etmek için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır ve hücresel MNP alımı ve hücre canlılığı tahlilleri için teknikler de sunulmuştur. Ayrıca nöronal büyümenin morfometrik parametreleri ve sonuçların istatistiksel analizi ayrıntılı olarak yer sunulur.

Protokol

NOT: Tüm biyolojik reaksiyonları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

1. Manyetik platform imalatı

  1. taş baskı
    1. Cam slaytları bir katip kalemi kullanarak 2 x 2 cm2'ye kesin. Cam slaytları asetonda temizleyin ve ardından ultra sonikasyon banyosunda her biri 5 dakika boyunca izopropanol. Ultra yüksek saflıkta (UHP) azot ile kurutun.
    2. Camı 1,5 μm kalınlık elde etmek için 60 s için 6.000 rpm'de spin-kaplama kullanarak fotoresistle kaplayın ve 60 s için 100 °C'de pişirin. Fotoresist için uygun bir dalga boyu kullanarak, istenen bir desenle, foto maskesiz veya maskesiz litografi kullanarak örneği bir ışık kaynağına maruz bırakmayın.
    3. Üreticinin talimatlarına göre damıtılmış suda (DW) seyreltilmiş bir geliştiricide 40 s için geliştirin; DW'de 45 sn yıkayın ve UHP azot gazı ile kurutun. Deseni optik mikroskop altında inceleyin.
  2. Sputter biriktirme
    1. Numuneyi biriktirme sisteminin ana odasına yerleştirin ve baz basıncını bekleyin (~5 × 10-8 Torr). Gaz akışını açın; standart püskürtme için argon akışını ayarlayın (28 sccm [standart kübik cm/ dakika başına) burada. Sputter hedeflerini ateşle, sonra sputter basıncını 3 mTorr'a ayarlayın.
    2. İstenilen oran elde edilene kadar her hedefteki gücü artırın.
      NOT: Pd Oranı: 0,62 A/s = 16 sn'de 1,0 nm; Co80Fe20 Oran: 0.32 A/sn, 0.2 nm içinde 6.25 s.
    3. Dönüşü açın. Sırasıyla hedef panjurları açıp kapatarak Co80Fe20 ve Pd hedefleri arasında değişen FM çok katmanlısını yatırın. Co80 Fe 20 (0.2nm)/Pd (1.0 nm) 14 bilayer yatırın ve ek bir 2 nm Pd kapak katmanı ile bitirin.
    4. Kaldırma: Numuneyi asetonda 30 dakika bekletin ve izopropanol ile durulayın. Daha sonra UHP azot ile kurutun ve numuneyi kullanıma kadar temiz ve kuru bir ortamda saklayın.

2. Manyetik cihazın taşıma ölçümleri ile karakterizasyonu

  1. FM çok katmanlı ile birleştirilmiş 100 μm genişliğinde çapraz şekilli manyetik çubuklu bir Si substratı veya cam slayt kullanın (bkz. Şekil 1C içe). Örneği çift taraflı bant kullanarak tutucuya takın.
  2. Bir tel yapıştırıcı kullanarak, çapraz elektrodun her bacağında bir tane olmak üzere numuneye 4 tel bağlayın. Numune tutucuyu ve numuneyi manyetik alanla taşıma ölçüm sisteminin içine yerleştirin, böylece manyetik alan örneğe dik olacak şekilde ayarlayın. Oda sıcaklığında ölçümler gerçekleştirin.
  3. Cihazın enine voltaj (VT)ölçümünü yapın; Şekil 1C'deki (inset) işaretleri takip edin: kontak 1 ve 3 arasında 1 mA'lık bir akım uygulayın; VT'yi 2 ve 4 arasındaki kişiler arasında ölçmek; ardından, 2 ile 4 arasında bir akım uygulayın ve voltajı 1 ile 3 arasında ölçün. Son olarak, her iki ölçümün voltajları arasındaki farkı hesaplayın ve VTelde etmek için 2'ye bölün. İki ölçüm konfigürasyonu arasında otomatik olarak geçiş yapmak için bir anahtarlama sistemi kullanın.
  4. Manyetik alanı 5 mT'lik adımlarla 0,4 T ile -0,4 T arasında süpürün ve alanın bir işlevi olarak VT'yi ölçün. Filmdeki dik manyetizasyonla orantılı anormal Hall sinyalini belirlemek için enine direnci (VT/ I) ve manyetik alanı çizin.

3. MNP'lerin ve manyetik çok katmanlıların manyetometri ölçümleri ile karakterizasyonu

  1. FM çok katmanlılar için manyetometrik ölçüm
    1. FM çok katmanlıyı Si alt tabakasına yatırın (bkz. bölüm 1.2). Numuneyi 4 x 4 mm2 boyutunda 6 kare halinde kesin. Örnekleri üst üste yığın ve manyetik alanın yönüne dik kapsülde düzenleyin (bkz. Şekil 1D iç).
    2. Kapsülü manyetometreye yerleştirin ve oda sıcaklığında manyetizasyonu ölçün. Manyetik alanı -0,4 T ile 0,4 T arasında süpürün.
    3. Manyetik katmanın kalınlığını, örneklerin boyutunu ve substrat sayısını göz önünde bulundurarak manyetik malzemenin toplam hacmini hesaplayın. Manyetizasyonu manyetik malzemenin toplam hacmine bölün.
    4. Manyetik alana karşı manyetizasyonu (birim hacim başına) çizin. Substratın diamanyetik arka planını yüksek manyetik alan tepkisinden çıkarın ve FM'in doygunluk mıknatıslanmasını grafikten tahmin edin.
  2. MNP'ler için manyetometrik ölçüm
    1. Sentetik bir polimer kapsülün içine belirlenmiş bir MNP kütlesi yerleştirin. Küçük manyetizasyon doygunluk değerlerini ölçüyorsanız daha büyük bir hacim düşünün.
    2. MNP'ler bir çözücüde askıya alınırsa, kapsülü gece boyunca açık bırakarak MNP'leri kurutun. Kapsülü manyetometreye yerleştirin ve oda sıcaklığında manyetizasyonu ölçün. Manyetik alanı -0.2 T ile 0.2 T arasında süpürün.
    3. Belirlenen hacmi parçacık konsantrasyonu ile çarparak MNP'lerin toplam kütlesini hesaplayın. Sonuçları 1 g'a normalleştirin.
    4. Normalleştirilmiş manyetizasyonu (gram başına) ve manyetik alanı çizin. MNP'lerin manyetizasyon doygunluğunu grafikten tahmin edin.

4. Kollajen kaplama protokolü

  1. Kaplama plastik tabaklar
    1. 500 mL otomatik kapatılmış çift damıtılmış suya (DDW) 490 μL HCl ekleyerek 0,01 M HCl hazırlayın.
      NOT: Bu adımı yalnızca kimyasal başlıkta gerçekleştirin.
    2. 50 μg / mL'lik son çalışma konsantrasyonu elde etmek için kollajen tip 1'i (sıçan kuyruğundan çözelti) 0,01 M HCl'de 1:60-1:80 seyreltin. Seyreltilmiş çözeltinin 1,5 mL'lik kısmını 35 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin. Tabağı kaputta 1 saat kapalı bırakın.
    3. Çözeltiyi çıkarın ve steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3x yıkayın. Yemek hücre tohumlama için hazırdır.
  2. Kaplama camı slaytları
    1. Seyreltik kollajen tip 1 (sıçan kuyruğundan çözelti) 1:50 içinde 30% v / v etanol. 35 mm'lik bir kabı kaplamak için, %30 etanolden 1 mL'ye 20 μL kolajen ekleyin.
    2. Yemeği çözelti ile örtün ve tüm çözelti buharlaşana kadar bekleyin ve yemeği birkaç saat açıkta bırakın. Steril 1x PBS'de 3x yıkayın; cam slayt hücre tohumlama için hazırdır.

5. Hücresel MNP alımı ve uygulanabilirliği

  1. Hücresel MNP alımı
    1. Roswell Park Tıp Enstitüsü (RPMI) ortamına %10 at serumu (HS), %5 fetal sığır serumu (FBS), %1 L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin ve %0,2 amfoterisilin ekleyerek PC12 hücre kültürü için temel büyüme ortamını hazırlayın ve 0,22 μm naylon filtre kullanarak filtreleyin.
    2. PC12 farklılaşma ortamını hazırlamak için RPMI ortamına %1 at serumu (HS), %1 L-glutamin, %1 penisilin/streptomisiin ve %0,2 amfoterisilin ekleyin ve 0,22 μm naylon filtre kullanarak filtreleyin.
    3. 10 mL temel büyüme ortamı ile tedavi edilmemiş bir kültür şişesinde hücreleri büyütün; her 2-3 günde bir şişeye 10 mL temel büyüme ortamı ekleyin ve 8 gün sonra hücreleri alt kültüre edin.
    4. Hücresel alım için, hücre süspansiyonu bir santrifüj tüpünde 200 × g ve oda sıcaklığında 8 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın.
    5. Hücreleri 3 mL taze temel büyüme ortamında yeniden biriktirin. Yine, hücre süspansiyonu 200 × g ve oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın. Hücreleri 3 mL taze farklılaşma ortamında yeniden biriktirin.
    6. Hücre kümelerini parçalamak için bir şırınga ve bir iğne kullanarak hücreleri 10x epire edin. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve normal kaplamasız 35 mm'lik bir tabakta 106 hücreyi tohumlayın.
    7. İstenilen MNP konsantrasyonunu ve toplam hacmi elde etmek için ölçülen MNP süspansiyon hacmini ve farklılaşma ortamının hacmini yemeğe ekleyin. Hücreleri, MNP'leri ve farklılaşma ortamını karıştırın; kabı 24 saat boyunca 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde kuluçkalayın.
    8. Hücre süspansiyonu oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın. Hücreleri 1 mL taze farklılaşma ortamında yeniden biriktirin ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
  2. MNP yüklü hücre farklılaşması
    1. Alım iletişim kuralını gerçekleştirin (bölüm 5.1). Tohum 8 × 35 mm üzerinde10 4 MNP yüklü hücre, farklılaşma ortamı varlığında kollajen tipi l kaplı tabak (bkz. bölüm 4.1'deki kollajen kaplama protokolü). 24 saat sonra, 1:100 taze murine beta-sinir büyüme faktörü (β-NGF) ekleyin (son konsantrasyon 50 ng/mL).
    2. Farklılaşma ortamını yenileyin ve her 2 günde bir taze murine β-NGF ekleyin. Optik mikroskopi kullanarak hücreleri her 2 günde bir görüntüleyin. Ağ oluşumundan sonra (PC12 hücreleri için 6-8 gün), konfokal mikroskopi kullanarak hücreleri görüntüleyin ve parçacıkların floresanını gözlemleyin.
  3. MNP yüklü hücreler için canlılık testi: 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-süloffenil)-2H-tetrazolium-5-karboksinalid (XTT) hücre canlılık testi.
    1. Temel büyüme ortamını adım 5.1.1'e göre hazırlayın. PC12 hücrelerini farklı konsantrasyonlarda (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ve temel büyüme ortamında 0,5 mg/mL) ve ayrıca düz 96 kuyulu bir plakada (toplam hacim 100 μL/kuyu) üç taraflı kontrol için MNP'ler olmadan geliştirin. Hücreleri % 5 CO 2'de 24 saat kuluçkaya yatırın,37°C'de nemlendirilmiş inkübatör.
    2. Arka plan düzeltmesi için hücresiz ortam içeren boş kuyular hazırlayın. XTT reaktif çözeltisini ve N-metil dibenzopyrazine metil sülfat içeren reaksiyon çözeltisini) kullanımdan hemen önce 37 °C'lik bir banyoda çözün. Net çözeltiler elde edilene kadar hafifçe döndürün.
    3. Bir adet 96 kuyu plakası için, 0,1 mL aktivasyon çözeltisini 5 mL XTT reaktif ile karıştırın. Her kuyuya 50 μL reaksiyon çözeltisi ekleyin, kuyularda boyanın eşit bir dağılımı için plakayı hafifçe sallayın ve ardından plakayı 5 saat boyunca bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
    4. 450 nm dalga boyunda enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) okuyucu kullanarak numunenin boş kuyulara karşı emilimini ölçün. Referans absorbansını 630 nm dalga boyu kullanarak ölçün ve 450 nm ölçümden çıkarın.
    5. 450 nm'de XTT reaktifi ile inkübe edilen kültür ortamında hafif spontan absorbans meydana geldiğinden, boş kuyuların ortalama emiciliğini diğer kuyulardan çıkarın. Hücre örnekleriyle aynı test edilmiş konsantrasyonlarda paralel MNP örneklerinden sinyal değerlerini çıkarın.
  4. MNP yüklü hücreler için canlılık testi: resazurin bazlı hücre canlılık testi
    1. 5.1.1 adımına göre temel büyüme ortamını hazırlayın. PC12 hücrelerini farklı konsantrasyonlarda (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ve temel büyüme ortamında 0,5 mg/mL) ve 24 saat boyunca düz 96 kuyulu bir plakada üç taraflı kontrol olarak MNP'ler olmadan geliştirin. Hücreleri 37 °C'de %5 CO 2 inkübatörde24 saat kuluçkaya yatırın. Hücresiz ortam içeren boş kuyular hazırlayın.
    2. Hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Resazurin bazlı reaktifi (%10 w/v) ortama ekleyin ve 37 °C'lik bir inkübatörde 2 saat kuluçkaya yatırın.
    3. Örneklerin 150 μL aliquot'larını ELISA okuyucuya yerleştirin ve absorbansı 560 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyunda ve 590 nm emisyon dalga boyunda ölçün. Hücre örnekleriyle aynı test edilmiş konsantrasyonlarda MNP'lerin paralel örneklerinden sinyal değerlerini çıkarın.

6. Endüktif olarak bağlı plazma (ICP) kullanılarak hücrelerin içindeki MNP konsantrasyonunun karakterizasyonu

  1. 5.1.1 adımına göre temel büyüme ortamını hazırlayın. PC12 hücrelerini farklı konsantrasyonlarda (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ve temel büyüme ortamında 0,5 mg/mL) ve MNP'ler olmadan düz 96 kuyulu bir plakada (toplam hacim 100 μL/kuyu) üç taraflı olarak geliştirin. %5 CO2,37°C'de nemlendirilmiş inkübatörde 24 saat kuluçkaya yatırın.
  2. Süspansiyonu bir santrifüj tüpüne (her kuyudan ayrı ayrı), oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj hücrelerine aktarın ve üstnatantı atın. Hücreleri 1 mL taze farklılaşma ortamında yeniden biriktirin ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
  3. Hücreleri en az 15 dakika boyunca her kuyuya ayrı ayrı 100 μL% 70 nitrik asit ile tedavi ederek lyse. Lislenmiş hücrelere 5 mL DDW ekleyin ve çözeltileri filtreleyin.
  4. ICP kullanarak demir konsantrasyonu ölçün ve hücre başına Fe konsantrasyonu kaydetmek için hücre sayısını kullanın.

7. Manyetik platformda hücre farklılaşması ve büyümesi

  1. Desenli substratı % 70 v/v/ etanol ile temizleyin ve alt tabakayı kaputtaki 35 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin. Desenli substratın altına 1 dakika boyunca büyük bir mıknatıs (~1500 Oe) yerleştirin ve önce kabı mıknatıstan yukarı ve uzağa hareket ettirerek mıknatısı çıkarın ve ardından mıknatısı kaputtan çıkarın. Ultraviyole ışığını 15 dakika açın.
  2. Alt tabakayı bölüm 4.2'ye göre kollajen tip 1 ile kapla. Hücresel MNP alımından sonra hücreleri askıya alın (bölüm 5.1), tohum 105 hücreleri 35 mm'lik bir kültür kabında ve 2 mL farklılaşma ortamı ekleyin. Kültürü% 5 CO2, 37° C'de nemlendirilmiş inkübatörde kuluçkaya yatırın.
  3. 24 saat sonra, 1:100 taze murine β-NGF ekleyin (50 ng /mL'lik son konsantrasyon). Farklılaşma ortamını yenileyin ve her 2 günde bir taze murine β-NGF ekleyin. Hücreleri ışık mikroskopisi kullanarak her 2 günde bir görüntüleyin ve ağ oluşumundan sonra hücreler üzerinde immünostainleme gerçekleştirin (bölüm 8.1).

8. MNP yüklü hücre boyama

  1. Tubulin immünostaining
    1. %16 w/v PFA çözeltisinin 10 mL'sini, 4 mL'sini 10x PBS'nin ve 26 mL'lik DDW'yi karıştırarak %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın. 50 mL 1x PBS'ye 500 μL iyonik olmayan yüzey aktif madde ekleyerek % 1 PBT'nin 50 mL'sini hazırlayın. %1 PBT'nin 25 mL'sini 25 mL ile 1x PBS'nin 25 mL'sini karıştırarak %0,5 PBT'nin 50 mL'sini hazırlayın. %0,25 PBT'de %1 sığır serumu albümin ve %1 normal eşek serumu karıştırarak blokaj çözeltisi hazırlayın.
      NOT: PFA'yı yalnızca kimyasal kaputun içinde kullanın.
    2. Üstteki ortamı hücrelerden çıkarın. MNP yüklü hücreleri kimyasal bir kaputun içindeki oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 PFA'da sabitlayın. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika kimyasal bir kaputun içinde yıkayın.
    3. MNP yüklü hücreleri 10 dakika boyunca %0,5 PBT ile permeabilize edin. MNP yüklü hücreleri önce oda sıcaklığında 45 dakika boyunca bloke çözeltisinde kuluçkaya yatırın ve daha sonra 4 °C'de bir gecede tıkama çözeltisinde tavşan anti-α-tübulin antikor ile kuluçkaya yatırın. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika yıkayın.
    4. MNP yüklü hücreleri Cy2 konjuge eşek anti-tavşan ikincil antikor ile karanlıkta ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya yatırın. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika yıkayın.
    5. Konfokal görüntüleme gerçekleştirin. Tubulin için 492 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 510 nm emisyon dalga boyu kullanın. MNP'ler (rhodamin) için 578 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 613 nm emisyon dalga boyu kullanın.
  2. 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) ile nükleer boyama
    1. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika yıkayın. Numunenin etrafındaki fazla sıvıyı çıkarın, 22 mm x 22 mm'lik bir alanı kaplayacak şekilde DAPI içeren 1 damla (~50 μL) montaj ortamı ekleyin ve karanlıkta ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika yıkayın. Konfokal görüntüleme gerçekleştirin. DAPI için 358 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 461 nm emisyon dalga boyu kullanın. MNP'ler (rhodamin) için 578 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 613 nm emisyon dalga boyu kullanın.

9. Ölçümler ve istatistiksel analizler

  1. MNP yüklü hücre farklılaşması için morfometrik analiz
    1. Hücre gövdesinden çeşitli mesafelerdeki kesişim sayısını ölçmek için, NGF ile tedaviden 3 gün sonrasına kadar kültürlü hücrelerin faz görüntülerini elde edin.
      NOT: Daha sonra yapılırsa, hücreler tek hücreli çözünürlük ölçümlerini önleyerek ağlar geliştirebilir.
      1. Görüntüleri imageJ görüntü işleme programında açın ve yarı otomatik neurite izleme ve uzunluk ölçümü sağlayan NeuronJ eklentisini kullanın36. Neurite tracer eklentisini kullanarak, neurites'i takip edin ve verileri ikili görüntülere dönüştürün. Soma'nın merkezini tanımlayın.
      2. NeuronJ eklentisinde bulunan Sholl analizini gerçekleştirin. Maksimum yarıçapı tanımlayın. Deneyi üç kez tekrarlayın. Her deneyde 100'den fazla hücreyi analiz edin.
  2. Hücre yerelleştirme çözümlemesi
    1. 3 günlük inkübasyondan sonra manyetik alanda lokalize olan hücrelerin yüzdesini belirlemek için, MNP alımı olan ve olmayan hücrelerin konfokal mikroskobik görüntülerini elde edin. DAPI boyama kullanın (bölüm 8.2).
    2. Desenin üstündeki veya kısmen üstündeki hücreleri (hücrelere dokunarak) ve olmayan hücreleri el ile sayın. Üç deney için tekrarlayın. MNP ile ve alım yapmadan 400'den fazla hücreyi analiz edin.
    3. MNP'li ve MNP'siz toplam hücre sayısı dışında manyetik desenlerin üzerinde olan hücrelerin göreli oranını hesaplayın. Ayrıca, hücrelerin manyetik bir desene inme olasılığını belirlemek için hücre gövdesi çapını desen genişliğine ekleyerek manyetik desenin etkili alanının yüzdesini hesaplayın.
    4. Hücre dağılımının izotropik hücre inişinin bir sonucu olup olmadığını veya manyetik desene tercih edilen bir önyargı olup olmadığını analiz etmek için tek bir örnek Ztesti gerçekleştirin.
  3. Büyüme yönlülük analizi
    1. Neurit büyüme yönlülüğü üzerindeki etkiyi ölçmek için, 8 günlük inkübasyondan sonra MNP tedavisi olan ve olmayan hücrelerin konfokal mikroskobik görüntülerini elde edin. İmmün boyama gerçekleştirin (bölüm 8.1).
    2. ImageJ yazılımını kullanarak, her iki durumda da hücre neuriti ile manyetik şeritler arasındaki açıyı ölçün.
      NOT: Yalnızca manyetik çizgilerde bulunan somalardan kaynaklanan nötralleri analiz edin.
    3. Neurites'in açılarının çizgilerin yönüne (Δφ) göre dağılımını çizin. Dağılımın normal veya tekdüze olmadığını göstermek için Δφ dağılımının Kikare testi gerçekleştirin.

Sonuçlar

Farklı geometrik şekillere sahip manyetik platformlar imal edilmiştir (Şekil 1A). Manyetik desenler sputtering ile birikti: Sırasıyla 14 co80Fe20 ve Pd, 0.2 nm ve 1 nm çok katmanlı. Elektron mikroskopisi manyetik desenlerin toplam yüksekliğini ~18 nm(Şekil 1B)olarak ortaya koydu. Bu benzersiz FM çok katmanlı biriktirme, MNP yüklü hücrelerin sadecekenarlaradeğil,<...

Tartışmalar

Temsili sonuçlar, mikron ölçeğinde nöronal ağ oluşumunu kontrol etmek ve düzenlemek için sunulan metodolojinin etkinliğini göstermektedir. MNP yüklü PC12 hücreleri canlı kaldı ve FM elektrotlardan belirli bölgelere manyetik kuvvetler tarafından çekilen manyetik hassas birimlere dönüştürüldü. Bu en iyi şekilde gösterilmiştir Şekil 5CHücrelerin tercihen ince çizgilere değil, altıgenlerin daha büyük köşelerine yapıştığı yer. Ayrıca, hücrelerin dallanm...

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu araştırma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, İsrail ve İsrail Bilim Vakfı (569/16) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
6-well cell culture plateFALCON353846
96-well cell culture plateSPL life sciences30096
Amphotericin B solutionBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H photoresistMicroChemicals GmbH
AZ 351 B developerMicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA)Biological Industries03-010-1B
Cell and Tissue cultur flaskBiofilTCF00225075.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dishGreiner Bio-One627-16035 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based)Biological Industries20-300-1000
Centrifuge tubeBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% sputter targetACI Alloys99.95%
Collagen type ICorning Inc.354236Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscopeLeicaTCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Disposable needleKDL23 G
Disposable  syringeMedispo116022764010 mL
Donor horse serumBiological Industries04-124-1A
ELISA readerMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated)Biolab-chemicals52505
Fetal bovine serum (FBS)Biological Industries04-127-1A
Fresh murine β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame electromagnet .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measureKeithley2400
Keithley switching systemKeithley3700
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Light microscopeLeicaDMIL LED
Maskless photolithographyHeidelberg Inst.MLA150
Microscope SlidesBAR-NAORBN1042000C
Nitric acid 70%Sigma-Aldrich438073
Normal donkey serum (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 cell lineATCCCRL-1721
Pd sputter targetACI Alloys99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solutionBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagentMolecular probesA-13261resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulinSanta Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering systemOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamineBiological Industries01-100-1A
Sonication bathKUDOSSK3210HPFrequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometerQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

Referanslar

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 173manyetik nanopartik llerdik manyetizasyon anizotropisi PMAmanyetik hedefli ila teslimatmanyetik h cre manip lasyonusinir k lt rsinir m hendisli ibiyo interfacingfotolithografimanyetik ok katmanl

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır