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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce travail présente une approche ascendante de l’ingénierie des forces magnétiques locales pour le contrôle de l’organisation neuronale. Les cellules de type neurone chargées de nanoparticules magnétiques (MNF) sont plaquées au sommet et contrôlées par une plate-forme micro-modelée avec une aimantation perpendiculaire. Sont également décrits la caractérisation magnétique, l’absorption cellulaire MNP, la viabilité cellulaire et l’analyse statistique.

Résumé

La capacité de diriger les neurones dans des réseaux neuronaux organisés a de grandes implications pour la médecine régénérative, l’ingénierie tissulaire et la bio-interfaçage. De nombreuses études ont visé à diriger les neurones à l’aide de repères chimiques et topographiques. Cependant, les rapports de contrôle organisationnel à l’échelle du micron sur de grandes surfaces sont rares. Ici, une méthode efficace a été décrite pour placer les neurones dans des sites prédéfinis et guider l’excroissance neuronale avec une résolution à l’échelle du micron, en utilisant des plates-formes magnétiques intégrées avec des éléments magnétiques micro-modelés. Il a été démontré que le chargement des neurones avec des nanoparticules magnétiques (MNF) les convertit en unités magnétiques sensibles qui peuvent être influencées par des gradients magnétiques. Suite à cette approche, une plate-forme magnétique unique a été fabriquée sur laquelle les cellules PC12, un modèle commun de type neurone, ont été plaquées et chargées de nanoparticules superparamagnétiques. Des films minces de multicouches ferromagnétiques (FM) avec l’aimantation perpendiculaire stable ont été déposés pour fournir des forces d’attraction efficaces vers les modèles magnétiques. Ces cellules PC12 chargées de MNP, plaquées et différenciées au sommet des plates-formes magnétiques, ont été préférentiellement attachées aux modèles magnétiques, et l’excroissance de la neurite était bien alignée avec la forme du motif, formant des réseaux orientés. Des méthodes quantitatives de caractérisation des propriétés magnétiques, de la prise cellulaire de MNP, de la viabilité de cellules, et de l’analyse statistique des résultats sont présentées. Cette approche permet le contrôle de la formation de réseaux neuronaux et améliore l’interface neurone-électrode grâce à la manipulation des forces magnétiques, qui peut être un outil efficace pour les études in vitro des réseaux et peut offrir de nouvelles directions thérapeutiques de biointerfaçage.

Introduction

Le micropatterning des neurones présente un grandpotentiel de régénération tissulaire1,2,3,4,5 et le développement de dispositifs neuro-électroniques6,7,8. Cependant, le positionnement à l’échelle du micron des neurones à haute résolution spatiale, comme dans les tissus biologiques, pose un défi important. La formation de structures préconçues à cette échelle nécessite le guidage des processus des cellules nerveuses en contrôlant localement la motilité du soma et l’excroissance axonale. Des études antérieures ont suggéré l’utilisation d’indices chimiques et physiques9,10,11,12 pour guider la croissance neuronale. Ici, une nouvelle approche se concentre sur le contrôle du positionnement des cellules par des gradients de champ magnétique13,14,15,16,17,transformant les cellules chargées de MNF en unités sensibles au magnétique, qui peuvent être manipulées à distance.

Kunze et al., qui ont caractérisé la force nécessaire pour induire des réponses cellulaires à l’aide de cellules chargées de puces magnétiques et de MNP, ont prouvé que l’élongation axonale précoce peut être déclenchée par une tension mécanique à l’intérieur des cellules18. Tay et coll. ont confirmé que les substrats microfabriqués avec des gradients de champ magnétique améliorés permettent la stimulation sans fil des circuits neuronaux dosés avec des MLP à l’aide de colorants indicateurs de calcium19. De plus, Tseng et al. ont coalisé des nanoparticules à l’intérieur des cellules, ce qui a entraîné des forces localisées médiées par les nanoparticules qui se sont approchées de la tension cellulaire20. Cela a conduit à la fabrication de modèles définis de substrats micromagnétiques qui ont aidé à étudier la réponse cellulaire aux forces mécaniques. La tension cellulaire résultant de l’application de forces localisées médiées par les nanoparticules a été obtenue en coalisant des nanoparticules dans les cellules20. Un système hybride microfluidique à semi-conducteur à oxyde métallique complémentaire (CMOS) a été développé par Lee et al. qui ont intégré un réseau de micro-électro-aimants dans la puce CMOS pour contrôler le mouvement des cellules individuelles marquées avec des billes magnétiques21.

Alon et al. ont utilisé des tampons magnétiques à micro-échelle, préprogrammés, comme « points chauds » magnétiques pour localiser les cellules22. Une activité spécifique pourrait également être stimulée au sein des cellules à l’aide de réseaux magnétiques micro-modelés pour localiser des nanoparticules à des emplacements subcellulaires spécifiques23. L’absorption cellulaire de MNP a été démontrée avec succès dans la sangsue, le rat, et les neurones primaires de souris24,25,26. Ici, ceci a été démontré sur une variété de cellule de phéochromocytome PC12 de rat, qui a été précédemment rapportée pour montrer la prise élevée des MNF27. Au cours des dernières années, il y a eu diverses applications médicales des MLP, y compris l’administration de médicaments et la thermothérapie dans les traitements du cancer28,29,30,31. Plus précisément, les études traitent de l’application des MLP et des réseaux neuronaux32,33,34,35. Cependant, l’organisation magnétique des neurones utilisant des MLP à un niveau unicellulaire mérite une enquête plus approfondie.

Dans ce travail, une approche ascendante a été décrite pour concevoir des forces magnétiques locales via des plates-formes prédéfinies pour contrôler l’arrangement neuronal. La fabrication des modèles à l’échelle du micron des multicouches FM a été présentée. Cette structure multicouche FM unique crée une aimantation perpendiculaire stable qui se traduit par des forces d’attraction efficaces vers tous les modèles magnétiques. Par incubation, les MLP ont été chargés dans des cellules PC12, les transformant en unités sensibles magnétiques. des cellules MNP-chargées, plaquées et différenciées au-dessus des plates-formes magnétiques, ont été préférentiellement attachées aux modèles magnétiques, et l’excroissance de neurite a été bien alignée avec la forme de modèle, formant des réseaux orientés. Plusieurs méthodes ont été décrites pour caractériser les propriétés magnétiques des multicouches FM et des MNP, et des techniques pour l’absorption cellulaire de MNP et les essais de viabilité cellulaire ont également été présentées. De plus, les paramètres morphométriques de la croissance neuronale et l’analyse statistique des résultats sont détaillés.

Protocole

REMARQUE: Effectuez toutes les réactions biologiques dans une armoire de biosécurité.

1. Fabrication de plateformes magnétiques

  1. lithographie
    1. Couper les lames de verre en 2 x 2 cm2 à l’aide d’un stylo scriber. Nettoyez les lames de verre à l’acétone puis à l’isopropanol pendant 5 min chacune dans un bain d’ultra-sonication. Sécher avec de l’azote de très haute pureté (UHP).
    2. Enduire le verre de photorésine en utilisant un revêtement par spin à 6 000 tr/min pendant 60 s, pour atteindre 1,5 μm d’épaisseur, et cuire au four à 100 °C pendant 60 s. Exposez l’échantillon à une source de lumière, en utilisant une longueur d’onde appropriée pour la photorésine, avec un motif souhaité, à l’aide d’un photomasque ou d’une lithographie sans masque.
    3. Développer pendant 40 s dans un révélateur, dilué dans de l’eau distillée (DW) selon les instructions du fabricant; laver en DW pendant 45 s et sécher avec de l’azote gazeux UHP. Inspectez le motif sous un microscope optique.
  2. Dépôt par pulvérisation
    1. Insérez l’échantillon dans la chambre principale du système de dépôt et attendez la pression de base (~ 5 × 10-8 Torr). Ouvrez le flux de gaz; régler le débit d’argon pour la pulvérisation standard (28 sccm [cm cube standard par min) ici. Enflammer les cibles de pulvérisation, puis régler la pression de pulvérisation à 3 mTorr.
    2. Augmentez la puissance sur chaque cible jusqu’à ce que le taux souhaité soit atteint.
      NOTA : Taux : 0,62 A/s = 1,0 nm en 16 s; Co80Fe20 Taux : 0,32 A/s, 0,2 nm en 6,25 s.
    3. Activez la rotation. Déposez le multicouche FM, en alternance entre les cibles Co80Fe20 et, en ouvrant et en fermant les volets cibles, respectivement. Déposez 14 couches de Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm) et terminez par une couche de capsulage supplémentaire de 2 nm.
    4. Décollage: Faire tremper l’échantillon dans de l’acétone pendant 30 min et rincer à l’isopropanol. Ensuite, séchez avec de l’azote UHP et conservez l’échantillon dans un environnement propre et sec jusqu’à son utilisation.

2. Caractérisation d’un dispositif magnétique par des mesures de transport

  1. Utilisez un substrat si ou une lame de verre avec une barre magnétique en forme de croix de 100 μm de largeur, déposée avec des multicouches FM (voir l’encart de la figure 1C). Fixer l’échantillon au support à l’aide de ruban adhésif double face.
  2. À l’aide d’un liant de fil, lions 4 fils à l’échantillon, un sur chaque jambe de l’électrode transversale. Régler le porte-échantillon et l’échantillon à l’intérieur du système de mesure du transport avec un champ magnétique de sorte que le champ magnétique soit perpendiculaire à l’échantillon. Effectuer des mesures à température ambiante.
  3. Effectuer la mesure de la tension transversale (VT)de l’appareil; suivre les marquages de la figure 1C (encart) : appliquer un courant de 1 mA entre les contacts 1 et 3 ; mesurer le VT entre les contacts 2 et 4 ; ensuite, appliquez un courant compris entre 2 et 4, et mesurez la tension entre 1 et 3. Enfin, calculer la différence entre les tensions des deux mesures et diviser par 2 pour obtenir VT. Utilisez un système de commutation pour basculer automatiquement entre les deux configurations de mesure.
  4. Balayer le champ magnétique entre 0,4 T et -0,4 T par pas de 5 mT et mesurer le VT en fonction du champ. Tracer la résistance transversale (VT/I) par rapport au champ magnétique pour déterminer le signal Hall anormal, qui est proportionnel à l’aimantation perpendiculaire dans le film.

3. Caractérisation des MNF et des multicouches magnétiques par des mesures magnétométriques

  1. Mesure magnétométrique pour multicouches FM
    1. Déposer le multicouche FM sur le substrat si (voir section 1.2). Couper l’échantillon en 6 carrés de 4 x 4 mm2 taille. Empilez les échantillons les uns sur les autres et disposez-les dans la capsule perpendiculairement à la direction du champ magnétique (voir figure 1D en médaillon).
    2. Insérez la capsule dans le magnétomètre et mesurez l’aimantation à température ambiante. Balayez le champ magnétique entre -0,4 T et 0,4 T.
    3. Calculer le volume total du matériau magnétique, en tenant compte de l’épaisseur de la couche magnétique, de la taille des échantillons et du nombre de substrats. Divisez l’aimantation par le volume total du matériau magnétique.
    4. Tracer l’aimantation (par unité de volume) par rapport au champ magnétique. Soustrayez le fond diamagnétique du substrat de la réponse à haut champ magnétique et extrapolez l’aimantation de saturation du FM du graphique.
  2. Mesure magnétométrique pour les MNF
    1. Insérer une masse désignée de MLP dans une capsule de polymère synthétique. Envisagez un volume plus important si vous mesurez de petites valeurs de saturation d’aimantation.
    2. Si les MNT sont en suspension dans un solvant, séchez-les en laissant la capsule ouverte pendant la nuit. Insérez la capsule dans le magnétomètre et mesurez l’aimantation à température ambiante. Balayez le champ magnétique entre -0,2 T et 0,2 T.
    3. Calculer la masse totale des MNF en multipliant le volume désigné par la concentration de particules. Normaliser les résultats à 1 g.
    4. Tracer l’aimantation normalisée (par gramme) par rapport au champ magnétique. Extrapoler la saturation d’aimantation des MNF à partir du graphique.

4. Protocole de revêtement de collagène

  1. Revêtement de vaisselle en plastique
    1. Préparer 0,01 M HCl en ajoutant 490 μL de HCl à 500 mL d’eau autoclavée doublement distillée (EDD).
      Remarque : effectuez cette étape uniquement dans le capot chimique.
    2. Diluer le collagène de type 1 (solution de la queue de rat) 1:60-1:80 dans 0,01 M HCl pour obtenir la concentration de travail finale de 50 μg/mL. Placer 1,5 mL de la solution diluée dans une parabole de culture de 35 mm. Laissez le plat dans la hotte pendant 1 h, couvert.
    3. Retirer la solution et laver 3x dans une solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS). Le plat est prêt pour l’ensemencement cellulaire.
  2. Revêtement de lames de verre
    1. Diluer le collagène de type 1 (solution de la queue de rat) 1:50 dans de l’éthanol à 30 % v/v. Pour enduire une capsule de 35 mm, ajouter 20 μL de collagène à 1 mL d’éthanol à 30 %.
    2. Couvrez le plat avec la solution et attendez que toute la solution s’évapore, laissant le plat à découvert pendant quelques heures. Laver 3x dans un PBS stérile 1x; la lame de verre est prête pour l’ensemencement cellulaire.

5. Adoption et viabilité du MNP cellulaire

  1. Adoption du MNP cellulaire
    1. Préparer le milieu de croissance de base pour la culture cellulaire PC12 en ajoutant 10 % de sérum de cheval (SH), 5 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine et 0,2 % d’amphotéricine au milieu du Roswell Park Medical Institute (RPMI), et filtrer à l’aide d’un filtre en nylon de 0,22 μm.
    2. Ajouter 1 % de sérum de cheval (SH), 1 % de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine et 0,2 % d’amphotéricine au milieu RPMI pour préparer le milieu de différenciation PC12, et filtrer à l’aide d’un filtre en nylon de 0,22 μm.
    3. Cultiver des cellules dans une fiole de culture non traitée avec 10 mL de milieu de croissance basique; ajouter 10 mL de milieu de croissance basique à la fiole tous les 2-3 jours, et sous-culturer les cellules après 8 jours.
    4. Pour l’absorption cellulaire, centrifuger la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger pendant 8 min à 200 × g et température ambiante, et jeter le surnageant.
    5. Ressusciter les cellules dans 3 mL de milieu de croissance basique frais. Encore une fois, centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 × g et température ambiante, et jeter le surnageant. Ressusciter les cellules dans 3 mL de milieu de différenciation frais.
    6. Aspirer les cellules 10x à l’aide d’une seringue et d’une aiguille pour briser les amas cellulaires. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ensemencez10 6 cellules dans un plat régulier non enrobé de 35 mm.
    7. Ajouter à la boîte le volume calculé de suspension MNP et le volume du milieu de différenciation pour atteindre la concentration MNP souhaitée et le volume total. Mélanger les cellules, les MLP et le milieu de différenciation; incuber la boîte dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 °C pendant 24 h.
    8. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 × g à température ambiante et jeter le surnageant. Ressusciter les cellules dans 1 mL de milieu de différenciation frais, et compter les cellules utilisant un hémocytomètre.
  2. Différenciation cellulaire chargée en MNP
    1. Exécuter le protocole d’adoption (section 5.1). Les semences 8 × 104 cellules chargées de MNP sur un plat enrobé de collagène de type l de 35 mm en présence d’un milieu de différenciation (voir protocole d’enrobage de collagène à la section 4.1). Après 24 h, ajoutez 1:100 facteur de croissance murin frais de bêta-nerf (β-NGF) (concentration finale 50 ng/mL).
    2. Renouveler le milieu de différenciation et ajouter du β-NGF murin frais tous les 2 jours. Imagez les cellules tous les 2 jours en utilisant la microscopie optique. Après la formation du réseau (6-8 jours pour les cellules PC12), imagez les cellules à l’aide de la microscopie confocale et observez la fluorescence des particules.
  3. Essai de viabilité pour les cellules chargées de MNP : essai de viabilité cellulaire du 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT).
    1. Préparer le milieu de croissance de base selon l’étape 5.1.1. Cultiver les cellules PC12 avec des MNF à différentes concentrations (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL et 0,5 mg/mL dans le milieu de croissance basique) et également sans MNF pour le contrôle en triple exemplaire dans une plaque plate de 96 puits (volume total de 100 μL/puits). Incuber les cellules pendant 24 h dans un incubateur humidifié à 5% deCO2à 37 °C.
    2. Préparer des puits vierges contenant du milieu sans cellules pour la correction de fond. Décongeler la solution de réactif XTT et la solution de réaction contenant du sulfate de méthyle N-méthyl dibenzopyrazine) dans un bain à 37 °C immédiatement avant l’utilisation. Tourbillonnez doucement jusqu’à ce que des solutions claires soient obtenues.
    3. Pour une plaque de 96 puits, mélanger 0,1 mL de solution d’activation avec 5 mL de réactif XTT. Ajouter 50 μL de la solution réactionnel à chaque puits, agiter légèrement la plaque pour une distribution uniforme du colorant dans les puits, puis incuber la plaque dans un incubateur pendant 5 h.
    4. Mesurer l’absorbance de l’échantillon par rapport aux puits vierges à l’aide d’un lecteur d’immunosorbant lié à des enzymes (ELISA) à une longueur d’onde de 450 nm. Mesurer l’absorbance de référence en utilisant une longueur d’onde de 630 nm et la soustraire de la mesure de 450 nm.
    5. Comme une légère absorbance spontanée se produit dans le milieu de culture incube incubé avec le réactif XTT à 450 nm, soustraire l’absorbance moyenne des puits vierges de celle des autres puits. Soustraire les valeurs de signal d’échantillons parallèles de MNF aux mêmes concentrations testées que les échantillons cellulaires.
  4. Essai de viabilité pour les cellules chargées de MNP : test de viabilité cellulaire à base de réazurine
    1. Préparer le milieu de croissance de base selon l’étape 5.1.1. Cultiver les cellules PC12 avec des MLP à différentes concentrations (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL, et 0,5 mg/mL dans le milieu de croissance de base) et sans MNF comme contrôle en triple exemplaire dans une plaque plate de 96 puits pendant 24 h. Incuber les cellules pendant 24 h dans un incubateur à 5 % deCO2 à 37 °C. Préparer des puits vierges contenant du milieu sans cellules.
    2. Lavez les cellules avec 1x PBS. Ajouter le réactif à base de réazurine (10 % p/v) au milieu et incuber pendant 2 h dans un incubateur à 37 °C.
    3. Placer des aliquotes de 150 μL des échantillons dans le lecteur ELISA et mesurer l’absorbance à une longueur d’onde d’excitation de 560 nm et une longueur d’onde d’émission de 590 nm. Soustrayez les valeurs du signal des échantillons parallèles de MNF aux mêmes concentrations testées que les échantillons cellulaires.

6. Caractérisation de la concentration de MNP à l’intérieur des cellules à l’aide de plasma à couplage inductif (ICP)

  1. Préparer le milieu de croissance de base selon l’étape 5.1.1. Cultiver les cellules PC12 avec des MNC à différentes concentrations (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL et 0,5 mg/mL dans le milieu de croissance de base) et sans MNF comme témoin en triple exemplaire dans une plaque plate de 96 puits (volume total de 100 μL/puits). Incuber dans un incubateur humidifié à 5% deCO2à 37°C pendant 24 h.
  2. Transférer la suspension dans un tube de centrifugation (de chaque puits séparément), centrifuger les cellules à 200 × g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant. Ressusciter les cellules dans 1 mL de milieu de différenciation frais, et compter les cellules utilisant un hémocytomètre.
  3. Lyser les cellules par traitement avec 100 μL d’acide nitrique à 70% dans chaque puits séparément pendant au moins 15 min. Ajouter 5 mL de DDW aux cellules lysées et filtrer les solutions.
  4. Mesurer la concentration de fer à l’aide de l’ICP et utiliser le nombre de cellules pour enregistrer la concentration de Fe par cellule.

7. Différenciation et croissance cellulaires sur plate-forme magnétique

  1. Nettoyez le substrat à motifs avec 70% v / v / éthanol et placez le substrat dans un plat de culture de 35 mm dans la hotte. Placez un grand aimant (~ 1500 Oe) sous le substrat à motifs pendant 1 min et retirez l’aimant en déplaçant d’abord la parabole vers le haut et loin de l’aimant, puis retirez l’aimant de la hotte. Allumez la lumière ultraviolette pendant 15 min.
  2. Enrober le substrat de collagène de type 1 conformément à la section 4.2. Suspendre les cellules après absorption cellulaire de MNP (section 5.1), ensemencer10 5 cellules dans une boîte de culture de 35 mm et ajouter 2 mL de milieu de différenciation. Incuber la culture dans un incubateur humidifié à 5% deCO2à 37 °C.
  3. Après 24 h, ajouter 1:100 murin frais β-NGF (concentration finale de 50 ng/mL). Renouveler le milieu de différenciation et ajouter du β-NGF murin frais tous les 2 jours. Imager les cellules tous les 2 jours à l’aide de la photomicroscopie et, après la formation du réseau, effectuer une immunomarquage sur les cellules (section 8.1).

8. Coloration des cellules chargées en MNP

  1. Immunomarquage de la tubuline
    1. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % en mélangeant 10 mL de solution de PFA à 16 % p/v, 4 mL de PBS 10x et 26 mL de DDW. Préparer 50 mL de PBT à 1 % en ajoutant 500 μL d’un tensioactif non ionique à 50 mL de PBS 1x. Préparer 50 mL de PBT à 0,5 % en mélangeant 25 mL de PBT à 1 % avec 25 mL de PBS 1x. Préparer la solution bloquante en mélangeant 1% d’albumine sérique bovine et 1% de sérum d’âne normal dans 0,25% de PBT.
      REMARQUE: Utilisez PFA uniquement à l’intérieur de la hotte chimique.
    2. Retirez le milieu surnageant des cellules. Fixer les cellules chargées de MNP dans 4% PFA pendant 15 min à température ambiante à l’intérieur d’une hotte chimique. Lavez les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage, à l’intérieur d’une hotte chimique.
    3. Perméabiliser les cellules chargées de MNP avec 0,5% pbt pendant 10 min. Incuber les cellules chargées de MNP d’abord dans une solution de blocage pendant 45 min à température ambiante, puis avec de l’anticorps anti-α-tubuline de lapin dans une solution de blocage pendant une nuit à 4 °C. Laver les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage.
    4. Incuber les cellules chargées de MNP avec de l’anticorps secondaire anti-lapin d’âne conjugué à Cy2 pendant 45 minutes dans l’obscurité et à température ambiante. Laver les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage.
    5. Effectuer une imagerie confocale. Pour la tubuline, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 492 nm et une longueur d’onde d’émission de 510 nm. Pour les MNF (rhodamine), utilisez une longueur d’onde d’excitation de 578 nm et une longueur d’onde d’émission de 613 nm.
  2. Coloration nucléaire avec 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)
    1. Laver les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage. Enlevez l’excès de liquide autour de l’échantillon, ajoutez 1 goutte (~50 μL) de milieu de montage contenant du DAPI pour couvrir une zone de 22 mm x 22 mm, et incuber pendant 5 min dans l’obscurité et à température ambiante.
    2. Laver les cellules chargées de MNP 3x dans 1x PBS, 5 min chaque lavage. Effectuer une imagerie confocale. Pour le DAPI, utilisez une longueur d’onde d’excitation de 358 nm et une longueur d’onde d’émission de 461 nm. Pour les MNF (rhodamine), utilisez une longueur d’onde d’excitation de 578 nm et une longueur d’onde d’émission de 613 nm.

9. Mesures et analyse statistique

  1. Analyse morphométrique de la différenciation cellulaire chargée de MNP
    1. Pour mesurer le nombre d’intersections à différentes distances du corps cellulaire, acquérir des images de phase des cellules cultivées jusqu’à 3 jours après le traitement par NGF.
      Remarque : Si cela est fait plus tard, les cellules peuvent développer des réseaux, empêchant les mesures de résolution de cellule unique.
      1. Ouvrez les images dans le programme de traitement d’image, ImageJ, et utilisez le plug-in NeuronJ, qui permet un traçage de neurite semi-automatique et une mesure de longueur36. À l’aide du plug-in de traceur de neurite, tracez les neurites et convertissez les données en images binaires. Définissez le centre du soma.
      2. Effectuez l’analyse Sholl, disponible dans le plug-in NeuronJ. Définissez le rayon maximal. Répétez l’expérience trois fois. Analyser plus de 100 cellules dans chaque expérience.
  2. Analyse de localisation cellulaire
    1. Pour déterminer le pourcentage de cellules localisées sur la zone magnétique après 3 jours d’incubation, acquérir des images microscopiques confocales de cellules avec et sans absorption de MNP. Utilisez la coloration DAPI (section 8.2).
    2. Comptez manuellement les cellules au sommet ou partiellement au-dessus du motif (cellules touchantes) et les cellules qui ne le sont pas. Répétez l’opération pour trois expériences. Analyser plus de 400 cellules avec MNP et sans absorption.
    3. Calculez la proportion relative des cellules qui se trouvent au sommet des motifs magnétiques sur le nombre total de cellules, avec et sans MNF. En outre, calculez le pourcentage de la surface effective du motif magnétique en ajoutant le diamètre du corps de la cellule à la largeur du motif pour déterminer la probabilité aléatoire que les cellules atterrissent sur un motif magnétique.
    4. Effectuez un seul test Zd’échantillon pour analyser si la distribution cellulaire est le résultat d’un atterrissage de cellules isotropes ou s’il existe un biais préféré au motif magnétique.
  3. Analyse de la directionnalité de la croissance
    1. Pour quantifier l’effet sur la directionnalité de l’excroissance des neurites, acquérir des images microscopiques confocales des cellules avec et sans traitement MNP après 8 jours d’incubation. Effectuer une immuno-coloration (section 8.1).
    2. À l’aide du logiciel ImageJ, mesurez l’angle entre la neurite cellulaire et les bandes magnétiques dans les deux conditions.
      REMARQUE: Analyser uniquement les neurites qui proviennent de somas situés sur les bandes magnétiques.
    3. Tracer la distribution des angles des neurites par rapport à la direction des rayures (Δθ). Effectuer un test du Khi-deux de la distribution de Δθ pour démontrer que la distribution n’est pas normale ou uniforme.

Résultats

Des plates-formes magnétiques de différentes formes géométriques ont été fabriquées(figure 1A). Des motifs magnétiques ont été déposés par pulvérisation : 14 multicouches de Co80Fe20 et, 0,2 nm et 1 nm, respectivement. La microscopie électronique a révélé que la hauteur totale des motifs magnétiques était d’environ 18 nm(figure 1B). Ce dépôt multicouche FM unique crée une plate-forme ...

Discussion

Les résultats représentatifs démontrent l’efficacité de la méthodologie présentée pour contrôler et organiser la formation de réseaux neuronaux à l’échelle du micron. Les cellules PC12 chargées de MNP sont restées viables et ont été transformées en unités sensibles magnétiques qui ont été attirées par les forces magnétiques des électrodes FM vers des sites spécifiques. Ceci est mieux démontré dans la figure 5C,où les cellules adhéraient préférentiellement au...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le Ministère de la science et de la technologie, Israël, et par la Fondation israélienne pour la science (569/16).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
6-well cell culture plateFALCON353846
96-well cell culture plateSPL life sciences30096
Amphotericin B solutionBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H photoresistMicroChemicals GmbH
AZ 351 B developerMicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA)Biological Industries03-010-1B
Cell and Tissue cultur flaskBiofilTCF00225075.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dishGreiner Bio-One627-16035 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based)Biological Industries20-300-1000
Centrifuge tubeBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% sputter targetACI Alloys99.95%
Collagen type ICorning Inc.354236Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscopeLeicaTCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Disposable needleKDL23 G
Disposable  syringeMedispo116022764010 mL
Donor horse serumBiological Industries04-124-1A
ELISA readerMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated)Biolab-chemicals52505
Fetal bovine serum (FBS)Biological Industries04-127-1A
Fresh murine β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame electromagnet .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measureKeithley2400
Keithley switching systemKeithley3700
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Light microscopeLeicaDMIL LED
Maskless photolithographyHeidelberg Inst.MLA150
Microscope SlidesBAR-NAORBN1042000C
Nitric acid 70%Sigma-Aldrich438073
Normal donkey serum (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 cell lineATCCCRL-1721
Pd sputter targetACI Alloys99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solutionBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagentMolecular probesA-13261resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulinSanta Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering systemOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamineBiological Industries01-100-1A
Sonication bathKUDOSSK3210HPFrequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometerQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

Références

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