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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Arbeit stellt einen Bottom-up-Ansatz zur Entwicklung lokaler magnetischer Kräfte zur Steuerung der neuronalen Organisation dar. Neuronenähnliche Zellen, die mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) beladen sind, werden auf einer mikrogemusterten Plattform mit senkrechter Magnetisierung plattiert und gesteuert. Ebenfalls beschrieben werden magnetische Charakterisierung, MNP-Zellaufnahme, Zelllebensfähigkeit und statistische Analyse.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, Neuronen in organisierte neuronale Netze zu leiten, hat große Auswirkungen auf die regenerative Medizin, das Tissue Engineering und die Bio-Schnittstelle. Viele Studien zielen darauf ab, Neuronen mit chemischen und topographischen Hinweisen zu lenken. Berichte über organisatorische Kontrolle im Mikrometerbereich über große Flächen sind jedoch rar. Hier wurde eine effektive Methode beschrieben, um Neuronen an voreingestellten Stellen zu platzieren und neuronales Auswachsen mit einer Auflösung im Mikrometerbereich zu leiten, wobei magnetische Plattformen mit mikrogemusterten, magnetischen Elementen eingebettet sind. Es wurde gezeigt, dass die Belastung von Neuronen mit magnetischen Nanopartikeln (MNPs) sie in empfindliche magnetische Einheiten umwandelt, die durch magnetische Gradienten beeinflusst werden können. Nach diesem Ansatz wurde eine einzigartige magnetische Plattform hergestellt, auf der PC12-Zellen, ein gängiges neuronenähnliches Modell, plattiert und mit superparamagnetischen Nanopartikeln beladen wurden. Dünne Schichten von ferromagnetischen (FM) Multischichten mit stabiler senkrechter Magnetisierung wurden abgeschieden, um effektive Anziehungskräfte auf die magnetischen Muster auszustrahlen. Diese MNP-geladenen PC12-Zellen, die auf den magnetischen Plattformen plattiert und differenziert wurden, wurden bevorzugt an den magnetischen Mustern befestigt, und das Auswachsen des Neuriten war gut auf die Musterform ausgerichtet und bildete orientierte Netzwerke. Quantitative Charakterisierungsmethoden der magnetischen Eigenschaften, der zellulären MNP-Aufnahme, der Zelllebensfähigkeit und der statistischen Analyse der Ergebnisse werden vorgestellt. Dieser Ansatz ermöglicht die Kontrolle der Bildung neuronaler Netzwerke und verbessert die Neuron-elektroden-Schnittstelle durch die Manipulation magnetischer Kräfte, die ein effektives Werkzeug für In-vitro-Studien von Netzwerken sein können und neuartige therapeutische Biointerfacing-Richtungen bieten können.

Einleitung

Die Mikrostrukturierung von Neuronen birgt ein großes Potenzial für die Geweberegeneration1,2,3,4,5 und die Entwicklung neuroelektronischer Geräte6,7,8. Die mikrometerskalige Positionierung von Neuronen bei hoher räumlicher Auflösung, wie in biologischen Geweben, stellt jedoch eine erhebliche Herausforderung dar. Die Bildung von vorgefertigten Strukturen in dieser Größenordnung erfordert die Führung von Nervenzellprozessen durch lokale Kontrolle der Somamotilität und des axonalen Auswuchses. Frühere Studien haben die Verwendung von chemischen und physikalischen Hinweisen9,10,11,12 zur Steuerung des neuronalen Wachstums vorgeschlagen. Hier konzentriert sich ein neuartiger Ansatz auf die Steuerung der Zellpositionierung durch Magnetfeldgradienten13,14,15,16,17, wobei mit MNPs beladene Zellen in magnetisch empfindliche Einheiten umgewandelt werden, die aus der Ferne manipuliert werden können.

Kunze et al., die die Kraft charakterisierten, die benötigt wird, um zelluläre Reaktionen mit magnetischen Chip- und MNP-geladenen Zellen zu induzieren, bewiesen, dass eine frühe axonale Dehnung durch mechanische Spannung in Zellen ausgelöst werden kann18. Tay et al. bestätigten, dass mikrogefertigte Substrate mit verbesserten Magnetfeldgradienten eine drahtlose Stimulation neuronaler Schaltkreise ermöglichen, die mit MNPs unter Verwendung von Kalziumindikatorfarbstoffen dosiert wurden19. Darüber hinaus verschmolzen Tseng et al. Nanopartikel in Zellen, was zu lokalisierten Nanopartikel-vermittelten Kräften führte, die sich der zellulären Spannungnäherten 20. Dies führte zur Herstellung definierter Muster mikromagnetischer Substrate, die dazu beitrugen, die zelluläre Reaktion auf mechanische Kräfte zu untersuchen. Die zelluläre Spannung, die durch die Anwendung lokalisierter Nanopartikel-vermittelter Kräfte entsteht, wurde durch die Verschmelzung von Nanopartikeln innerhalb von Zellen erreicht20. Ein komplementäres Metalloxidhalbleiter (CMOS)-mikrofluidisches Hybridsystem wurde von Lee et al. entwickelt, die eine Reihe von Mikroelektromagneten in den CMOS-Chip eingebettet haben, um die Bewegung einzelner Zellen zu steuern, die mit magnetischen Perlen markiert sind21.

Alon et al. verwendeten mikroskalige, vorprogrammierte Magnetpads als magnetische "Hot Spots", um Zellen zu lokalisieren22. Spezifische Aktivität könnte auch innerhalb von Zellen stimuliert werden, indem mikrogemusterte magnetische Arrays verwendet werden, um Nanopartikel an bestimmten subzellulären Stellen zu lokalisieren23. Die zelluläre MNP-Aufnahme wurde erfolgreich in den primären Neuronen24 , 25,26von Blutegel, Ratten undMäusennachgewiesen. Hier wurde dies an einer Phäochromozytom-Zelllinie der Ratte PC12 nachgewiesen, von der zuvor berichtet wurde, dass sie eine hohe Aufnahme von MNPs27zeigt. In den letzten Jahren gab es verschiedene medizinische Anwendungen von MNPs, einschließlich Medikamentenabgabe und Thermotherapie bei Krebsbehandlungen28,29,30,31. Konkret befassen sich Studien mit der Anwendung von MNPs und Neuronennetzwerken32,33,34,35. Die magnetische Organisation von Neuronen, die MNPs auf Einzelzellebene verwenden, verdient jedoch weitere Untersuchungen.

In dieser Arbeit wurde ein Bottom-up-Ansatz beschrieben, um lokale magnetische Kräfte über vorgefertigte Plattformen zur Kontrolle der neuronalen Anordnung zu entwickeln. Die Herstellung von Mustern im Mikrometerbereich von FM-Multilayern wurde vorgestellt. Diese einzigartige, mehrschichtige FM-Struktur erzeugt eine stabile senkrechte Magnetisierung, die zu effektiven Anziehungskräften für alle magnetischen Muster führt. Durch Inkubation wurden MNPs in PC12-Zellen geladen und in magnetisch empfindliche Einheiten umgewandelt. MNP-geladene Zellen, die auf den magnetischen Plattformen plattiert und differenziert wurden, wurden bevorzugt an den magnetischen Mustern befestigt, und das Neuritenwachstum war gut auf die Musterform ausgerichtet und bildete orientierte Netzwerke. Es wurden mehrere Methoden beschrieben, um die magnetischen Eigenschaften der FM-Multischichten und der MNPs zu charakterisieren, und es wurden auch Techniken für die zelluläre MNP-Aufnahme und Zelllebensfähigkeitstests vorgestellt. Zusätzlich werden morphometrische Parameter des neuronalen Wachstums und statistische Analyse der Ergebnisse detailliert beschrieben.

Protokoll

HINWEIS: Führen Sie alle biologischen Reaktionen in einer Biosicherheitswerkbank durch.

1. Herstellung magnetischer Plattformen

  1. Lithographie
    1. Glasdias mit einem Schreibstift in 2 x 2 cm2 schneiden. Reinigen Sie die Glasobjektträger in Aceton und dann Isopropanol für jeweils 5 min in einem Ultraschallbad. Trocken mit ultrahochreinem (UHP) Stickstoff.
    2. Das Glas mit Fotolack mit Spin-Coating bei 6.000 U/min für 60 s beschichten, um eine Dicke von 1,5 μm zu erreichen, und bei 100 °C für 60 s backen. Setzen Sie die Probe einer Lichtquelle aus, wobei Sie eine geeignete Wellenlänge für den Fotolack verwenden, mit einem gewünschten Muster, indem Sie eine Fotomaske oder maskenlose Lithographie verwenden.
    3. Entwickeln Sie für 40 s in einem Entwickler, verdünnt in destilliertem Wasser (DW) gemäß den Anweisungen des Herstellers; 45 s in DW waschen und mit UHP-Stickstoffgas trocknen. Untersuchen Sie das Muster unter einem optischen Mikroskop.
  2. Sputterablagerung
    1. Setzen Sie die Probe in die Hauptkammer des Abscheidesystems ein und warten Sie auf den Basisdruck (~ 5 × 10-8 Torr). Öffnen Sie den Gasstrom; Legen Sie den Argonfluss für das Standard-Sputtern (28 sccm [Standardkubikmeter pro Min.) hierin fest. Zünden Sie die Sputterziele an und stellen Sie dann den Sputterdruck auf 3 mTorr ein.
    2. Erhöhen Sie die Leistung auf jedem Ziel, bis die gewünschte Rate erreicht ist.
      HINWEIS: Pd Rate: 0,62 A/s = 1,0 nm in 16 s; Co80Fe20 Rate: 0,32 A/s, 0,2 nm in 6,25 s.
    3. Aktivieren Sie die Drehung. Lagern Sie die FM-Multischicht abwechselnd zwischen den Zielen Co80Fe20 und Pd ab, indem Sie die Zielverschlüsse öffnen bzw. schließen. 14 Doppelschichten Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm) abscheiden und mit einer zusätzlichen 2 nm Pd-Verschließschicht abschließen.
    4. Abheben: Die Probe 30 Minuten in Aceton einweichen und mit Isopropanol abspülen. Trocknen Sie dann mit UHP-Stickstoff und bewahren Sie die Probe bis zur Verwendung in einer sauberen und trockenen Umgebung auf.

2. Charakterisierung magnetischer Geräte durch Transportmessungen

  1. Verwenden Sie ein Si-Substrat oder einen Glasschlitten mit einem kreuzförmigen Magnetbalken von 100 μm Breite, der mit FM-Multilayern abgeschieden wird (siehe Abbildung 1C-Einschub). Befestigen Sie die Probe mit doppelseitigem Klebeband am Halter.
  2. Verbinden Sie mit einem Drahtbonder 4 Drähte mit der Probe, einen an jedem Bein der Kreuzelektrode. Stellen Sie den Probenhalter und die Probe innerhalb des Transportmesssystems mit einem Magnetfeld ein, so dass das Magnetfeld senkrecht zur Probe steht. Führen Sie Messungen bei Raumtemperatur durch.
  3. Durchführung von Querspannungsmessungen (VT)des Geräts; Befolgen Sie die Markierungen in Abbildung 1C (Einschub): Wenden Sie einen Strom von 1 mA zwischen den Kontakten 1 und 3 an; Messen Sie die VT zwischen den Kontakten 2 und 4; Dann wenden Sie einen Strom zwischen 2 und 4 an und messen Sie die Spannung zwischen 1 und 3. Berechnen Sie schließlich die Differenz zwischen den Spannungen beider Messungen und dividieren Sie durch 2, um VTzu erhalten. Verwenden Sie ein Schaltsystem, um automatisch zwischen den beiden Messkonfigurationen zu wechseln.
  4. Streichen Sie das Magnetfeld zwischen 0,4 T und -0,4 T in Schritten von 5 mT und messen Sie das VT als Funktion des Feldes. Zeichnen Sie den Querwiderstand (VT/ I) im Vergleich zum Magnetfeld auf, um das anomale Hall-Signal zu bestimmen, das proportional zur senkrechten Magnetisierung im Film ist.

3. Charakterisierung von MNPs und magnetischen Multilayern durch Magnetometriemessungen

  1. Magnetometrische Messung für FM-Multilayer
    1. Legen Sie die FM-Multischicht auf das Si-Substrat (siehe Abschnitt 1.2). Schneiden Sie die Probe in 6 Quadrate von 4 x 4 mm2 Größe. Stapeln Sie die Proben übereinander und ordnen Sie sie in der Kapsel senkrecht zur Richtung des Magnetfeldes an (siehe Abbildung 1D-Einschub).
    2. Setzen Sie die Kapsel in das Magnetometer ein und messen Sie die Magnetisierung bei Raumtemperatur. Streichen Sie das Magnetfeld zwischen -0,4 T und 0,4 T.
    3. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des magnetischen Materials unter Berücksichtigung der Dicke der magnetischen Schicht, der Größe der Proben und der Anzahl der Substrate. Teilen Sie die Magnetisierung durch das Gesamtvolumen des magnetischen Materials.
    4. Zeichnen Sie die Magnetisierung (pro Volumeneinheit) im Vergleich zum Magnetfeld auf. Subtrahieren Sie den diamagnetischen Hintergrund des Substrats von der hohen Magnetfeldantwort und extrapolieren Sie die Sättigungsmagnetisierung des FM aus dem Graphen.
  2. Magnetometrische Messung für MNPs
    1. Geben Sie eine bestimmte Masse von MNPs in eine synthetische Polymerkapsel ein. Berücksichtigen Sie ein größeres Volumen, wenn Sie kleine Magnetisierungssättigungswerte messen.
    2. Wenn die MNPs in einem Lösungsmittel suspendiert sind, trocknen Sie die MNPs, indem Sie die Kapsel über Nacht offen lassen. Setzen Sie die Kapsel in das Magnetometer ein und messen Sie die Magnetisierung bei Raumtemperatur. Streichen Sie das Magnetfeld zwischen -0,2 T und 0,2 T.
    3. Berechnen Sie die Gesamtmasse der MNPs, indem Sie das angegebene Volumen mit der Partikelkonzentration multiplizieren. Normalisieren Sie die Ergebnisse auf 1 g.
    4. Zeichnen Sie die normalisierte Magnetisierung (pro Gramm) im Vergleich zum Magnetfeld auf. Extrapolieren Sie die Magnetisierungssättigung der MNPs aus der Grafik.

4. Kollagen-Beschichtungsprotokoll

  1. Beschichtung von Kunststoffschalen
    1. Bereiten Sie 0,01 M HCl vor, indem Sie 490 μL HCl zu 500 ml autoklaviertem doppelt destilliertem Wasser (DDW) hinzufügen.
      HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt nur in der chemischen Haube aus.
    2. Kollagen Typ 1 (Lösung aus Rattenschwanz) 1:60-1:80 in 0,01 M HCl verdünnen, um die endgültige Arbeitskonzentration von 50 μg/ml zu erhalten. 1,5 ml der verdünnten Lösung in eine 35 mm Kulturschale geben. Lassen Sie die Schüssel für 1 h bedeckt in der Kapuze.
    3. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie 3x in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Das Gericht ist bereit für die Zellaussaat.
  2. Beschichtung von Glasobjektträgern
    1. Kollagen Typ 1 (Lösung aus Rattenschwanz) 1:50 in 30% v/v Ethanol verdünnen. Um eine 35-mm-Schüssel zu beschichten, fügen Sie 20 μL Kollagen zu 1 ml 30% Ethanol hinzu.
    2. Decken Sie die Schüssel mit der Lösung ab und warten Sie, bis die gesamte Lösung verdunstet ist, und lassen Sie die Schüssel einige Stunden unbedeckt. 3x in sterilem 1x PBS waschen; der Glasträger ist bereit für die Zellaussaat.

5. Zelluläre MNP-Aufnahme und Lebensfähigkeit

  1. Zelluläre MNP-Aufnahme
    1. Bereiten Sie das grundlegende Wachstumsmedium für die PC12-Zellkultur vor, indem Sie 10% Pferdeserum (HS), 5% fetales Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin und 0,2% Amphotericin zum Medium des Roswell Park Medical Institute (RPMI) hinzufügen und mit einem 0,22 μm Nylonfilter filtern.
    2. Fügen Sie 1% Pferdeserum (HS), 1% L-Glutamin, 1% Penicillin / Streptomycin und 0,2% Amphotericin zu RPMI-Medium hinzu, um PC12-Differenzierungsmedium herzustellen, und filtern Sie mit einem 0,22 μm Nylonfilter.
    3. Züchten Sie Zellen in einem nicht behandelten Kulturkolben mit 10 ml basism Wachstumsmedium; Fügen Sie alle 2-3 Tage 10 ml basisch einfaches Wachstumsmedium in den Kolben hinzu und subkulturieren Sie die Zellen nach 8 Tagen.
    4. Für die Zellaufnahme zentrifugiert man die Zellsuspension in einem Zentrifugenröhrchen für 8 min bei 200 × g und Raumtemperatur und entsorgt den Überstand.
    5. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml frischem Basiswachstumsmedium. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut für 5 min bei 200 × g und Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml frischem Differenzierungsmedium.
    6. Saugen Sie die Zellen 10x mit einer Spritze und einer Nadel an, um Zellcluster aufzubrechen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie 106 Zellen in einer normalen unbeschichteten 35-mm-Schüssel.
    7. Fügen Sie der Schüssel das berechnete Volumen der MNP-Suspension und das Volumen des Differenzierungsmediums hinzu, um die gewünschte MNP-Konzentration und das Gesamtvolumen zu erreichen. Mischen Sie die Zellen, MNPs und das Differenzierungsmedium; inkubieren Sie die Schale in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 °C für 24 h.
    8. Zentrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 200 × g bei Raumtemperatur und entsorge den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml frischem Differenzierungsmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
  2. MNP-geladene Zelldifferenzierung
    1. Führen Sie das Aufnahmeprotokoll durch (Abschnitt 5.1). Seed 8 × 104 MNP-beladenen Zellen auf einer 35 mm, kollagenartigen l-beschichteten Schale in Gegenwart eines Differenzierungsmediums (siehe Kollagenbeschichtungsprotokoll in Abschnitt 4.1). Nach 24 h 1:100 frischen murinen Betanerven-Wachstumsfaktor (β-NGF) hinzufügen (Endkonzentration 50 ng/ml).
    2. Erneuern Sie das Differenzierungsmedium und fügen Sie alle 2 Tage frische murine β-NGF hinzu. Bilden Sie die Zellen alle 2 Tage mit optischer Mikroskopie ab. Nach der Netzwerkbildung (6-8 Tage für PC12-Zellen) bilden Sie die Zellen mit konfokalem Mikroskopie ab und beobachten Sie die Fluoreszenz der Partikel.
  3. Lebensfähigkeitstest für MNP-geladene Zellen: 2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilid (XTT)-Zelllebensfähigkeitstest.
    1. Bereiten Sie das Grundlegende Wachstumsmedium gemäß Schritt 5.1.1 vor. Kultivieren Sie die PC12-Zellen mit MNPs in verschiedenen Konzentrationen (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml und 0,5 mg/ml in basism Wachstumsmedium) und auch ohne MNPs zur Kontrolle in dreifacher Ausfertigung in einer flachen 96-Well-Platte (Gesamtvolumen von 100 μL/Well). Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in einem 5% CO2, befeuchteten Inkubator bei 37 °C.
    2. Bereiten Sie leere Vertiefungen, die Medium ohne Zellen enthalten, für die Hintergrundkorrektur vor. Die XTT-Reagenzlösung und die Reaktionslösung,die N-Methyldibenzopyrazinmethylsulfat enthält, unmittelbar vor der Verwendung in einem 37 °C-Bad auftauen. Vorsichtig schwenken, bis klare Lösungen erhalten sind.
    3. Für eine 96-Well-Platte mischen Sie 0,1 ml Aktivierungslösung mit 5 ml XTT-Reagenz. Fügen Sie 50 μL der Reaktionslösung zu jeder Vertiefung hinzu, schütteln Sie die Platte leicht für eine gleichmäßige Verteilung des Farbstoffs in den Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte dann in einem Inkubator für 5 h.
    4. Messen Sie die Absorption der Probe gegen die Blanko-Vertiefungen mit einem ELISA-Lesegerät (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) bei einer Wellenlänge von 450 nm. Messen Sie die Referenzabsorption mit einer Wellenlänge von 630 nm und subtrahieren Sie sie von der 450 nm Messung.
    5. Da eine leichte spontane Absorption in dem mit dem XTT-Reagenz inkubierten Kulturmedium bei 450 nm auftritt, subtrahieren Sie die durchschnittliche Absorption der leeren Vertiefungen von der der anderen Vertiefungen. Subtrahieren Sie Signalwerte von parallelen Proben von MNPs in den gleichen getesteten Konzentrationen wie die Zellproben.
  4. Lebensfähigkeitstest für MNP-geladene Zellen: Resazurin-basierter Zelllebensfähigkeitstest
    1. Bereiten Sie das Basiswachstumsmedium gemäß Schritt 5.1.1 vor. Kultivieren Sie die PC12-Zellen mit MNPs in verschiedenen Konzentrationen (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml und 0,5 mg/ml in basism Basiswachstumsmedium) und ohne MNPs als Kontrolle in dreifacher Ausfertigung in einer flachen 96-Well-Platte für 24 h. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in einem 5% CO2 Inkubator bei 37 °C. Bereiten Sie leere Vertiefungen vor, die Medium ohne Zellen enthalten.
    2. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS. Das Reagenz auf Resazurinbasis (10 % w/v) wird in das Medium eingefüllt und 2 h in einem 37 °C-Inkubator inkubiert.
    3. Legen Sie 150 μL Aliquoten der Proben in den ELISA-Reader und messen Sie die Absorption bei einer Anregungswellenlänge von 560 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm. Subtrahieren Sie die Signalwerte von den parallelen Proben von MNPs bei den gleichen getesteten Konzentrationen wie die Zellproben.

6. Charakterisierung der MNP-Konzentration in den Zellen mittels induktiv gekoppeltem Plasma (ICP)

  1. Bereiten Sie das Basiswachstumsmedium gemäß Schritt 5.1.1 vor. Kultivieren Sie die PC12-Zellen mit MNPs in verschiedenen Konzentrationen (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml und 0,5 mg/ml in basism Basiswachstumsmedium) und ohne MNPs als Kontrolle in dreifacher Ausfertigung in einer flachen 96-Well-Platte (Gesamtvolumen von 100 μL/Well). Inkubieren Sie in einem 5% CO2, befeuchteten Inkubator bei 37 °C für 24 h.
  2. Die Suspension wird in ein Zentrifugenröhrchen (von jeder Vertiefung separat), Zentrifugenzellen bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur übertragen und den Überstand entsorgen. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml frischem Differenzierungsmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
  3. Lyse der Zellen durch Behandlung mit 100 μL 70% Salpetersäure zu jeder Vertiefung separat für mindestens 15 min. Fügen Sie 5 ml DDW zu den lysierten Zellen hinzu und filtern Sie die Lösungen.
  4. Messen Sie die Eisenkonzentration mit ICP und verwenden Sie die Zellzahl, um die Fe-Konzentration pro Zelle aufzuzeichnen.

7. Zelldifferenzierung und -wachstum auf magnetischer Plattform

  1. Reinigen Sie das gemusterte Substrat mit 70% v/v/Ethanol und legen Sie das Substrat in eine 35 mm Kulturschale in der Haube. Legen Sie einen großen Magneten (~ 1500 Oe) für 1 minute unter das gemusterte Substrat und entfernen Sie den Magneten, indem Sie zuerst die Schüssel nach oben und weg vom Magneten bewegen und dann den Magneten aus der Haube nehmen. Schalten Sie das ultraviolette Licht für 15 Minuten ein.
  2. Beschichten Sie das Substrat mit Kollagen Typ 1 gemäß Abschnitt 4.2. Suspendieren Sie die Zellen nach zellulärer MNP-Aufnahme (Abschnitt 5.1), säen Sie 105 Zellen in einer 35-mm-Kulturschale und fügen Sie 2 ml Differenzierungsmedium hinzu. Inkubieren Sie die Kultur in einem 5% CO2, befeuchteten Inkubator bei 37 °C.
  3. Nach 24 h 1:100 frische murine β-NGF (Endkonzentration von 50 ng/ml) hinzufügen. Erneuern Sie das Differenzierungsmedium und fügen Sie alle 2 Tage frische murine β-NGF hinzu. Bilden Sie die Zellen alle 2 Tage mit Lichtmikroskopie ab und führen Sie nach der Netzwerkbildung eine Immunfärbung der Zellen durch (Abschnitt 8.1).

8. MNP-geladene Zellfärbung

  1. Tubulin Immunfärbung
    1. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung durch Mischen von 10 mL 16% w / v PFA-Lösung, 4 mL 10x PBS und 26 ml DDW vor. Bereiten Sie 50 ml 1% PBT vor, indem Sie 500 μL eines nichtionischen Tensids zu 50 ml 1x PBS hinzufügen. Bereiten Sie 50 ml 0,5% PBT vor, indem Sie 25 ml 1% PBT mit 25 ml 1x PBS mischen. Bereiten Sie die Blockierungslösung vor, indem Sie 1% Rinderserumalbumin und 1% normales Eselserum in 0,25% PBT mischen.
      HINWEIS: Verwenden Sie PFA nur in der chemischen Haube.
    2. Entfernen Sie das überstandliche Medium aus den Zellen. Fixieren Sie die MNP-geladenen Zellen in 4% PFA für 15 min bei Raumtemperatur in einer chemischen Haube. Waschen Sie die MNP-geladenen Zellen 3x in 1x PBS, 5 min pro Waschgang, in einer chemischen Haube.
    3. Permeabilisieren Sie die MNP-geladenen Zellen mit 0,5% PBT für 10 min. Inkubieren Sie die MNP-geladenen Zellen zuerst in Blocklösung für 45 min bei Raumtemperatur und dann mit Kaninchen-Anti- α-Tubulin-Antikörper in Blocklösung über Nacht bei 4 °C. MNP-beladene Zellen 3x in 1x PBS waschen, 5 min pro Waschgang.
    4. Inkubieren Sie die MNP-geladenen Zellen mit Cy2-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern für 45 Minuten in der Dunkelheit und bei Raumtemperatur. Waschen Sie die MNP-beladenen Zellen 3x in 1x PBS, 5 min pro Waschgang.
    5. Führen Sie konfokale Bildgebung durch. Verwenden Sie für Tubulin eine Anregungswellenlänge von 492 nm und eine Emissionswellenlänge von 510 nm. Verwenden Sie für die MNPs (Rhodamin) eine Anregungswellenlänge von 578 nm und eine Emissionswellenlänge von 613 nm.
  2. Kernfärbung mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)
    1. Waschen Sie die MNP-beladenen Zellen 3x in 1x PBS, 5 min pro Waschgang. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit um die Probe, fügen Sie 1 Tropfen (~ 50 μL) Montagemedium mit DAPI hinzu, um einen Bereich von 22 mm x 22 mm abzudecken, und inkubieren Sie für 5 minuten in dunkelheit und bei Raumtemperatur.
    2. Waschen Sie die MNP-beladenen Zellen 3x in 1x PBS, 5 min pro Waschgang. Führen Sie konfokale Bildgebung durch. Verwenden Sie für DAPI eine Anregungswellenlänge von 358 nm und eine Emissionswellenlänge von 461 nm. Verwenden Sie für die MNPs (Rhodamin) eine Anregungswellenlänge von 578 nm und eine Emissionswellenlänge von 613 nm.

9. Messungen und statistische Auswertung

  1. Morphometrische Analyse der MNP-geladenen Zelldifferenzierung
    1. Um die Anzahl der Schnittpunkte in verschiedenen Entfernungen vom Zellkörper zu messen, erfassen Sie Phasenbilder von kultivierten Zellen bis zu 3 Tage nach der Behandlung mit NGF.
      HINWEIS: Wenn dies später geschieht, können die Zellen Netzwerke entwickeln, wodurch Messungen der Einzelzellauflösung verhindert werden.
      1. Öffnen Sie die Bilder im Bildverarbeitungsprogramm ImageJ und verwenden Sie das NeuronJ-Plug-in, das eine halbautomatische Neuritenverfolgung und Längenmessungermöglicht 36. Verfolgen Sie mit dem Neurit-Tracer-Plug-In die Neuriten und konvertieren Sie die Daten in binäre Bilder. Definieren Sie die Mitte des Somas.
      2. Führen Sie eine Sholl-Analyse durch, die im NeuronJ-Plug-In verfügbar ist. Definieren Sie den maximalen Radius. Wiederholen Sie das Experiment dreimal. Analysieren Sie mehr als 100 Zellen in jedem Experiment.
  2. Analyse der Zelllokalisierung
    1. Um den Prozentsatz der Zellen zu bestimmen, die nach 3 Tagen der Inkubation auf der magnetischen Fläche lokalisiert sind, erfassen Sie konfokale mikroskopische Bilder von Zellen mit und ohne MNP-Aufnahme. Verwenden Sie die DAPI-Färbung (Abschnitt 8.2).
    2. Zählen Sie manuell die Zellen über oder teilweise über dem Muster (berührende Zellen) und die Zellen, die es nicht sind. Wiederholen Sie dies für drei Experimente. Analysieren Sie mehr als 400 Zellen mit MNP und ohne Aufnahme.
    3. Berechnen Sie den relativen Anteil der Zellen, die sich auf den magnetischen Mustern befinden, aus der Gesamtzahl der Zellen, mit und ohne MNPs. Berechnen Sie zusätzlich den Prozentsatz der effektiven Fläche des magnetischen Musters, indem Sie den Zellkörperdurchmesser zur Musterbreite addieren, um die zufällige Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass Zellen auf einem magnetischen Muster landen.
    4. Führen Sie einen Z-Testmit einer einzigen Probe durch, um zu analysieren, ob die Zellverteilung auf die isotrope Zelllandung beruht oder ob eine bevorzugte Verzerrung des magnetischen Musters vorliegt.
  3. Wachstumsrichtungsanalyse
    1. Um die Wirkung auf die Auswuchsrichtung des Neuriten zu quantifizieren, erfassen Sie konfokale mikroskopische Bilder der Zellen mit und ohne MNP-Behandlung nach 8 Tagen Inkubation. Durchführung einer Immunfärbung (Abschnitt 8.1).
    2. Messen Sie mit der ImageJ-Software den Winkel zwischen dem Zellneurit und den Magnetstreifen unter beiden Bedingungen.
      HINWEIS: Analysieren Sie nur Neuriten, die von Somas auf den Magnetstreifen stammen.
    3. Zeichnen Sie die Verteilung der Winkel der Neuriten relativ zur Richtung der Streifen (Δθ) auf. Führen Sie einen Chi-Quadrat-Test der Verteilung von Δθ durch, um zu zeigen, dass die Verteilung nicht normal oder gleichmäßig ist.

Ergebnisse

Es wurden magnetische Plattformen mit unterschiedlichen geometrischen Formen hergestellt (Abbildung 1A). Magnetische Muster wurden durch Sputtern abgeschieden: 14 Multischichten Co80Fe20 und Pd, 0,2 nm bzw. 1 nm. Die Elektronenmikroskopie ergab, dass die Gesamthöhe der magnetischen Muster ~ 18 nm beträgt (Abbildung 1B). Diese einzigartige FM-Mehrschichtabscheidung schafft eine stabile Plattform mit senkrec...

Diskussion

Die repräsentativen Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der vorgestellten Methodik zur Steuerung und Organisation der neuronalen Netzwerkbildung auf der Mikrometerskala. Die MNP-geladenen PC12-Zellen blieben lebensfähig und wurden in magnetisch empfindliche Einheiten umgewandelt, die von den magnetischen Kräften der FM-Elektroden an bestimmte Stellen angezogen wurden. Dies wird am besten in Abbildung 5Cgezeigt, wo die Zellen bevorzugt an den größeren Scheitelpunkten der Sechsecke und nic...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Israel, und von der Israeli Science Foundation (569/16) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
6-well cell culture plateFALCON353846
96-well cell culture plateSPL life sciences30096
Amphotericin B solutionBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H photoresistMicroChemicals GmbH
AZ 351 B developerMicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA)Biological Industries03-010-1B
Cell and Tissue cultur flaskBiofilTCF00225075.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dishGreiner Bio-One627-16035 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based)Biological Industries20-300-1000
Centrifuge tubeBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% sputter targetACI Alloys99.95%
Collagen type ICorning Inc.354236Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscopeLeicaTCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Disposable needleKDL23 G
Disposable  syringeMedispo116022764010 mL
Donor horse serumBiological Industries04-124-1A
ELISA readerMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated)Biolab-chemicals52505
Fetal bovine serum (FBS)Biological Industries04-127-1A
Fresh murine β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame electromagnet .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measureKeithley2400
Keithley switching systemKeithley3700
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Light microscopeLeicaDMIL LED
Maskless photolithographyHeidelberg Inst.MLA150
Microscope SlidesBAR-NAORBN1042000C
Nitric acid 70%Sigma-Aldrich438073
Normal donkey serum (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 cell lineATCCCRL-1721
Pd sputter targetACI Alloys99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solutionBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagentMolecular probesA-13261resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulinSanta Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering systemOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamineBiological Industries01-100-1A
Sonication bathKUDOSSK3210HPFrequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometerQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

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