JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

עבודה זו מציגה גישה מלמטה למעלה להנדסה של כוחות מגנטיים מקומיים לשליטה בארגון העצבי. תאים דמויי נוירון עמוסים ננו-חלקיקים מגנטיים (MNPs) מצופים על גבי ונשלטים על ידי פלטפורמה מיקרו בדוגמת עם מגנטיזציה בניצב. כמו כן מתוארים אפיון מגנטי, ספיגה תאית MNP, כדאיות התא, וניתוח סטטיסטי.

Abstract

ליכולת לכוון נוירונים לרשתות עצביות מאורגנות יש השלכות רבות על רפואה רגנרטיבית, הנדסת רקמות וביו-התערבות. מחקרים רבים נועדו לכוון נוירונים באמצעות רמזים כימיים טופוגרפיים. עם זאת, דיווחים על שליטה ארגונית בקנה מידה מיקרון על פני שטחים גדולים הם נדירים. כאן, שיטה יעילה תוארה להצבת נוירונים באתרים מוגדרים מראש והנחיית צמחיית עצבים ברזולוציה בקנה מידה מיקרון, באמצעות פלטפורמות מגנטיות מוטבע עם מיקרו בדוגמת, אלמנטים מגנטיים. הוכח כי טעינת נוירונים עם חלקיקים מגנטיים (MNPs) ממירה אותם ליחידות מגנטיות רגישות שיכולות להיות מושפעות ממדרגיים מגנטיים. בעקבות גישה זו, פלטפורמה מגנטית ייחודית כבר מפוברק שבו תאי PC12, מודל נפוץ דמוי נוירון, היו מצופים וטעונים עם חלקיקים superparamagnetic. סרטים דקים של רב שכבות פרומגנטיות (FM) עם מגנטיזציה ניצבת יציבה הופקדו כדי לספק כוחות משיכה יעילים לכיוון הדפוסים המגנטיים. תאי PC12 אלה, המצופה והמבדילים על גבי הפלטפורמות המגנטיות, היו מחוברים באופן מועדף לתבניות המגנטיות, וצמחיית הנויריטים הייתה מיושרת היטב עם צורת התבנית, ויצרה רשתות מכוונות. מוצגות שיטות אפיון כמותי של התכונות המגנטיות, ספיגת MNP תאית, כדאיות התא וניתוח סטטיסטי של התוצאות. גישה זו מאפשרת שליטה על היווצרות רשת עצבית ומשפרת ממשק נוירון לאלקטרודה באמצעות מניפולציה של כוחות מגנטיים, אשר יכול להיות כלי יעיל למחקרים במבחנה של רשתות ועשוי להציע כיוונים טיפוליים חדשניים biointerfacing.

Introduction

Micropatterning של נוירונים מחזיק פוטנציאל גדול עבורהתחדשות רקמות 1,2,3,4,5 ופיתוח של מכשירים נוירו-אלקטרוניים6,7,8. עם זאת, המיקום בקנה מידה מיקרון של נוירונים ברזולוציה מרחבית גבוהה, כמו ברקמות ביולוגיות, מהווה אתגר משמעותי. יצירת מבנים מעוצבים מראש בקנה מידה זה דורשת הדרכה של תהליכי תאי עצב על ידי שליטה מקומית תנועתיות סומה וצמחיית אקסונל. מחקרים קודמים הראו שימוש ברמזים כימיים ופיזיים9,10,11,12 להנחיית צמיחה עצבית. כאן, גישה חדשנית מתמקדת בשליטה על מיקום התאים על ידי שיפוע שדה מגנטי13,14,15,16,17, הפיכת תאים טעונים עם MNPs ליחידות רגישות מגנטיות, אשר ניתן לתפעל מרחוק.

Kunze et al., שאפיין את הכוח הדרוש כדי לגרום לתגובות הסלולר באמצעות שבב מגנטי- ותאים טעונים MNP, הוכיח כי התארכות אקסונית מוקדמת יכולה להיות מופעלת על ידי מתח מכני בתוך תאים18. Tay et al. אישר כי מצעים מיקרו מפוברק עם שיפוע שדה מגנטי משופר לאפשר גירוי אלחוטי של מעגלים עצביים מנוקד עם MNPs באמצעות צבעי מחוון סידן19. יתר על כן, Tseng et al. חלקיקים מתמזגים בתוך תאים, וכתוצאה מכך כוחות מתווכים חלקיקים מקומיים שהתקרבו למתח התאי20. זה הוביל לייצור דפוסים מוגדרים של מצעים מיקרומגנטיים שעזרו ללמוד תגובה תאית לכוחות מכניים. מתח תאי הנובע מיישום של כוחות מתווכים ננו-חלקיקים מקומיים הושג על ידי התמזגות חלקיקים בתוך תאים20. מערכת היברידית מיקרופלואידית משלימה תחמוצת מתכת (CMOS) פותחה על ידי Lee et al. שהטמיע מערך של מיקרו אלקטרומגנטים בשבב CMOS כדי לשלוט בתנועה של תאים בודדים מתויגים עם חרוזים מגנטיים21.

אלון ואח' השתמשו ברפידות מגנטיות מיקרו-סולם, מתוכנתות מראש, כ"נקודות חמות" מגנטיות לאיתור תאים22. פעילות ספציפית יכולה גם להיות מגורה בתוך תאים באמצעות מערכים מגנטיים בדוגמת מיקרו כדי להתאים חלקיקים במקומות תת תאיים ספציפיים23. ספיגת MNP הסלולר הוכח בהצלחה עלוקה, חולדה, ועכבר נוירונים ראשוניים24,25,26. כאן, זה הוכח על קו תא PC12 pheochromocytoma חולדה, אשר דווח בעבר להראות ספיגה גבוהה של MNPs27. בשנים האחרונות היו יישומים רפואיים שונים של חברי פרלמנט, כולל אספקת תרופות ותרמותרפיה בטיפולי סרטן28,29,30,31. באופן ספציפי, מחקרים עוסקים ביישום של MNPs ורשתות נוירונים32,33,34,35. עם זאת, הארגון המגנטי של נוירונים באמצעות MNPs ברמת תא יחיד ראוי לחקירה נוספת.

בעבודה זו, גישה מלמטה למעלה תוארה להנדס כוחות מגנטיים מקומיים באמצעות פלטפורמות מעוצבות מראש לשליטה בסידור העצבי. הייצור של דפוסים בקנה מידה מיקרון של שכבות FM הוצגה. מבנה רב שכבתי ייחודי זה יוצר מגנטיזציה ניצבת יציבה שתוצאתה כוחות משיכה יעילים כלפי כל הדפוסים המגנטיים. באמצעות דגירה, חברי פרלמנט הועמסו לתאי PC12, והפכו אותם ליחידות רגישות מגנטיות. תאים טעונים MNP, מצופים ומובחנים על גבי הפלטפורמות המגנטיות, היו מחוברים באופן מועדף לתבניות המגנטיות, וצמחיית הנויריטים הייתה מיושרת היטב עם צורת התבנית, ויצרה רשתות מכוונות. מספר שיטות תוארו כדי לאפיין את התכונות המגנטיות של שכבות FM ו- MNPs, וטכניקות עבור ספיגת MNP הסלולר מבחני הכדאיות התא הוצגו גם. בנוסף, מפורטים פרמטרים מורפומטריים של צמיחה עצבית וניתוח סטטיסטי של התוצאות.

Protocol

הערה: בצע את כל התגובות הביולוגיות בארון biosafety.

1. ייצור פלטפורמה מגנטית

  1. הדפס אבן
    1. חותכים מגלשות זכוכית ל-2x2 ס"מ2 באמצעות עט סופר. נקה את מגלשות הזכוכית באצטון ולאחר מכן איזופרופנול במשך 5 דקות כל אחד באמבט אולטרה sonication. יבש עם חנקן טוהר גבוה במיוחד (UHP).
    2. מצפים את הזכוכית עם פוטורסיסט באמצעות ציפוי ספין ב 6,000 סל"ד עבור 60 s, כדי להשיג 1.5 מיקרומטר עובי, ואופים ב 100 מעלות צלזיוס עבור 60 s. לחשוף את המדגם למקור אור, באמצעות אורך גל מתאים עבור photoresist, עם דפוס הרצוי, באמצעות פוטומסק או ליתוגרפיה ללא מסכה.
    3. לפתח במשך 40 s במפתח, מדולל במים מזוקקים (DW) על פי הוראות היצרן; לשטוף DW במשך 45 s, ויבש עם גז חנקן UHP. בדוק את התבנית תחת מיקרוסקופ אופטי.
  2. תצהיר ספוטר
    1. הכנס את הדגימה לתא הראשי של מערכת התצהיר והמתן ללחץ בסיס (~ 5 × 10-8 טור). פתח את זרימת הגז; הגדר את זרימת הארגון עבור sputtering סטנדרטי (28 sccm [ס"מ מעוקב סטנדרטי לדקה) בזאת. להצית את מטרות sputter, ולאחר מכן להגדיר את הלחץ sputter ל 3 mTorr.
    2. הגדל את העוצמה בכל יעד עד להשגת הקצב הרצוי.
      הערה: Pd Rate: 0.62 A/s = 1.0 ננומטר ב- 16 שניות; Co80Fe20 שיעור: 0.32 A/s, 0.2 ננומטר ב 6.25 s.
    3. הפעל סיבוב. להפקיד את multilayer FM, לסירוגין בין Co80Fe20 ו Pd מטרות, על ידי פתיחה וסגירה של תריסי היעד, בהתאמה. הפקד 14 bilayers של Co80Fe20 (0.2 ננומטר)/Pd (1.0 ננומטר), ולסיים עם שכבת 2 ננומטר נוספת Pd capping.
    4. הרמה: משרים את הדגימה באצטון במשך 30 דקות, ושוטף עם isopropanol. לאחר מכן, יבש עם חנקן UHP, ולשמור את המדגם בסביבה נקייה ויבשה עד השימוש.

2. אפיון המכשיר המגנטי באמצעות מדידות הובלה

  1. השתמש במצע Si או בשקופית זכוכית עם פס מגנטי בצורת צלב ברוחב 100 מיקרומטר, המופקד עם שכבות FM (ראה איור 1C inset). חבר את הדגימה למחזיק באמצעות קלטת דו-צדדית.
  2. באמצעות משועבד תיל, קשר 4 חוטים לדגימה, אחד על כל רגל של האלקטרודה הצולבת. הגדר את מחזיק הדגימה ודגימה בתוך מערכת מדידת התובלה עם שדה מגנטי, כך השדה המגנטי הוא בניצב לדגימה. בצע מדידות בטמפרטורת החדר.
  3. בצע מדידת מתח רוחבי (VT)של ההתקן; עקבו אחר הסימונים באיור 1C (כניסה): החל זרם של 1 mA בין אנשי קשר 1 ו- 3; למדוד אתV T בין מגעים 2 ו 4; לאחר מכן, להחיל זרם בין 2 ל 4, ולמדוד את המתח בין 1 ל 3. לבסוף, לחשב את ההפרש בין המתחים של שתי המדידות ולחלק על ידי 2 כדי לקבל VT. השתמש במערכת מיתוג כדי לעבור באופן אוטומטי בין שתי תצורות המדידה.
  4. לטאטא את השדה המגנטי בין 0.4 T כדי -0.4 T בשלבים של 5 mT ולמדוד את VT כפונקציה של השדה. התווה את ההתנגדות הרוחבית (VT/I) לעומת השדה המגנטי כדי לקבוע את אות האולם החריג, שהוא פרופורציונלי למגנטיזציה הניצבת בסרט.

3. אפיון של MNPs ורב שכבתי מגנטי על ידי מדידות מגנטומטריה

  1. מדידה מגנטומטרית עבור שכבות FM
    1. הפקד את שכבת FM על המצע Si (ראה סעיף 1.2). חותכים את המדגם ל 6 ריבועים של 4 x 4 מ"מ2 גודל. עורמים את הדגימות אחת מעל השנייה ומסדרים אותן בכמוסה בניצב לכיוון השדה המגנטי (ראו איור 1D inset).
    2. הכנס את הקפסולה לתוך המגנטומטר ולמדוד את המגנטיזציה בטמפרטורת החדר. לטאטא את השדה המגנטי בין -0.4 T ו 0.4 T.
    3. לחשב את הנפח הכולל של החומר המגנטי, בהתחשב בעובי השכבה המגנטית, בגודל הדגימות ובמספר המצעים. חלק את המגנטיזציה לפי הנפח הכולל של החומר המגנטי.
    4. התווה את המגנטיזציה (ליחידת נפח) לעומת השדה המגנטי. הפחת את הרקע הסמאגנטי של המצע מתגובת השדה המגנטי הגבוה והנח את מגנטיזציית הרוויה של ה- FM מהגרף.
  2. מדידה מגנטומטרית עבור MNPs
    1. הכנס מסה ייעודית של חברי פרלמנט לכמוסת פולימר סינתטית. שקול נפח גדול יותר אם מודדים ערכי רוויה קטנים של מגנטיזציה.
    2. אם חברי הפרלמנט מושעים בממס, יבש את חברי הפרלמנט על ידי השארת הקפסולה פתוחה למשך הלילה. הכנס את הקפסולה לתוך המגנטומטר ולמדוד את המגנטיזציה בטמפרטורת החדר. לטאטא את השדה המגנטי בין -0.2 T ו 0.2 T.
    3. חשב את המסה הכוללת של חברי הפרלמנט על-ידי הכפלת הנפח המיועד בריכוז החלקיקים. לנרמל את התוצאות ל 1 גרם.
    4. התווה את המגנטיזציה המנורמלת (לגרם) לעומת השדה המגנטי. לשער את רוויית המגנטיזציה של חברי הפרלמנט מהגרף.

4. פרוטוקול ציפוי קולגן

  1. ציפוי מנות פלסטיק
    1. הכן 0.01 M HCl על ידי הוספת 490 μL של HCl ל 500 מ"ל של מים מזוקקים כפולים autoclaved (DDW).
      הערה: בצע שלב זה רק במכסה המנוע הכימי.
    2. לדלל קולגן מסוג 1 (פתרון מזנב חולדה) 1:60-1:80 ב 0.01 M HCl כדי להשיג את ריכוז העבודה הסופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל. מניחים 1.5 מ"ל של הפתרון המדולל בצלחת תרבות 35 מ"מ. השאירו את המנה במכסה המנוע למשך שעה, מכוסה.
    3. הסר את הפתרון, ולשטוף 3x מלוחים סטריליים 1x פוספט אגירה (PBS). המנה מוכנה לזריעת תאים.
  2. ציפוי שקופיות זכוכית
    1. לדלל קולגן מסוג 1 (פתרון מזנב עכברוש) 1:50 ב 30% v / v אתנול. לציפוי צלחת 35 מ"מ, להוסיף 20 μL של קולגן ל 1 מ"ל של 30% אתנול.
    2. מכסים את המנה בתמיסה, ומחכים עד שכל הפתרון מתאדה, משאירים את המנה חשופה לכמה שעות. לשטוף 3x ב סטרילי 1x PBS; שקופית הזכוכית מוכנה לזריעת תאים.

5. ספיגת MNP סלולרית וכדאיות

  1. ספיגת MNP סלולרית
    1. הכן מדיום צמיחה בסיסי לתרבות התאים PC12 על ידי הוספת 10% סרום סוסים (HS), 5% סרום שור עוברי (FBS), 1% ל-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.2% אמפוטריצין למדיום המכון הרפואי רוזוול פארק (RPMI), וסינון באמצעות מסנן ניילון של 0.22 מיקרומטר.
    2. הוסיפו 1% סרום סוסים (HS), 1% ל-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.2% אמפיטריצין למדיום RPMI להכנת מדיום הבידול של PC12, ומסננים באמצעות מסנן ניילון 0.22 מיקרומטר.
    3. לגדל תאים בבקבוק תרבות שאינו מטופל עם 10 מ"ל של מדיום צמיחה בסיסי; להוסיף 10 מ"ל של מדיום צמיחה בסיסית לבקבוק כל 2-3 ימים, ותת תרבות התאים לאחר 8 ימים.
    4. לספיגה תאית, צנטריפוגה השעיית התא בצינור צנטריפוגה במשך 8 דקות ב 200 × g וטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant.
    5. Resuspend התאים ב 3 מ"ל של מדיום צמיחה בסיסי טרי. שוב, צנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 200 × g וטמפרטורת החדר, ולזרוק את supernatant. resuspend התאים ב 3 מ"ל של מדיום בידול טרי.
    6. לשאוף את התאים 10x באמצעות מזרק ומחט לשבור אשכולות תאים. לספור את התאים באמצעות hemocytometer, וזרע 106 תאים בצלחת רגילה לא צבוע 35 מ"מ.
    7. הוסף למנה את הנפח המחושב של המתלה MNP ונפח של מדיום בידול כדי להשיג את ריכוז MNP הרצוי ואת הנפח הכולל. ערבבו את התאים, ה- MNPs והבינוני; דגירה את המנה באינקובטור לחות CO2 5% ב 37 °C (60 °F) עבור 24 שעות.
    8. צנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 200 × g בטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant. Resuspend התאים ב 1 מ"ל של מדיום בידול טרי, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
  2. בידול תאים טעון MNP
    1. בצע פרוטוקול ספיגה (סעיף 5.1). זרע 8 × 104 תאים טעונים MNP על צלחת 35 מ"מ, קולגן סוג l מצופה בנוכחות מדיום בידול (ראה פרוטוקול ציפוי קולגן בסעיף 4.1). לאחר 24 שעות, להוסיף 1:100 גורם גדילה בטא עצבי מורין טרי (β-NGF) (ריכוז סופי 50 ng/mL).
    2. לחדש את מדיום הבידול ולהוסיף מורין טרי β-NGF כל 2 ימים. תמונה התאים כל 2 ימים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. לאחר היווצרות הרשת (6-8 ימים עבור תאי PC12), תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופיה confocal, ולבחון את הפלואורסצנטיות של החלקיקים.
  3. בדיקת כדאיות לתאים טעונים MNP: 2,3-ביס-(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-2H-טטרזוליום-5-קרבוקסניליד (XTT) בדיקת כדאיות התא.
    1. הכינו את מדיום הצמיחה הבסיסי לפי שלב 5.1.1. לטפח את תאי PC12 עם MNPs בריכוזים שונים (0.1 מ"ג / מ"ל, 0.25 מ"ג / מ"ל, ו 0.5 מ"ג / מ"ל במדיום צמיחה בסיסי) וגם ללא MNPs לשליטה משולשת בצלחת שטוחה 96-באר (נפח כולל של 100 μL / באר). דגירה התאים עבור 24 שעות ב 5% CO2, חממה לחה ב 37 °C (69 °F).
    2. הכן בארות ריקות המכילות מדיום ללא תאים לתיקון רקע. להפשיר את הפתרון ריאגנט XTT, ואת פתרון התגובה המכיל N-מתיל dibenzopyrazine מתיל סולפט) באמבטיה 37 מעלות צלזיוס מיד לפני השימוש. מערבולת בעדינות עד פתרונות ברורים מתקבלים.
    3. לקבלת צלחת אחת של 96 באר, יש לערבב 0.1 מ"ל של פתרון הפעלה עם 5 מ"ל של ריאגנט XTT. מוסיפים 50 μL של פתרון התגובה לכל באר, מעט לנער את הצלחת לחלוקה שווה של הצבע בבארות, ולאחר מכן דגירה את הצלחת באינקובטור במשך 5 שעות.
    4. למדוד את ספיגת המדגם נגד בארות ריקות באמצעות אנזים מקושר immunosorbent assay (ELISA) קורא באורך גל של 450 ננומטר. למדוד את ספיגת ההפניה באמצעות אורך גל של 630 ננומטר ולחסר אותו ממדידת 450 ננומטר.
    5. כמו ספיגה ספונטנית קלה מתרחשת במדיום התרבות דגירה עם ריאגנט XTT ב 450 ננומטר, לחסר את הספיגה הממוצעת של בארות ריקות מזה של בארות אחרות. הפחת ערכי אותות מדגימות מקבילות של חברי פרלמנט באותם ריכוזים שנבדקו כמו דגימות התאים.
  4. בדיקת כדאיות לתאים טעונים MNP: בדיקת כדאיות תאים מבוססת resazurin
    1. הכן מדיום צמיחה בסיסי לפי שלב 5.1.1. לטפח את תאי PC12 עם MNPs בריכוזים שונים (0.1 מ"ג / מ"ל, 0.25 מ"ג / מ"ל, ו 0.5 מ"ג / מ"ל במדיום צמיחה בסיסי) וללא MNPs כשליטה משולשת בצלחת שטוחה 96-באר עבור 24 שעות. דגירה התאים עבור 24 שעות ב 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F). הכן בארות ריקות המכילות מדיום ללא תאים.
    2. לשטוף את התאים עם 1x PBS. מוסיפים את ריאגנט מבוסס resazurin (10% w / v) למדיום דגירה עבור 2 שעות באינקובטור 37 °C (70 °F).
    3. מניחים 150 μL aliquots של הדגימות בקורא ELISA, ולמדוד את הספיגה באורך גל עירור של 560 ננומטר ואורך גל פליטה של 590 ננומטר. הפחת את ערכי האות מהדגימות המקביליות של חברי פרלמנט באותם ריכוזים שנבדקו כמו דגימות התאים.

6. אפיון ריכוז MNP בתוך התאים באמצעות פלזמה מצמדית השראתית (ICP)

  1. הכן מדיום צמיחה בסיסי לפי שלב 5.1.1. לטפח את תאי PC12 עם MNPs בריכוזים שונים (0.1 מ"ג / מ"ל, 0.25 מ"ג / מ"ל, ו 0.5 מ"ג / מ"ל במדיום צמיחה בסיסי) וללא MNPs כשליטה משולשת בצלחת שטוחה 96-באר (נפח כולל של 100 μL / גם). דגירה ב 5% CO2,חממה לחה ב 37 °C (69 °F) עבור 24 שעות.
  2. מעבירים את ההשעיה לצינור צנטריפוגה (מכל באר בנפרד), תאי צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. Resuspend התאים ב 1 מ"ל של מדיום בידול טרי, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
  3. Lyse התאים על ידי טיפול עם 100 μL של 70% חומצה חנקתית לכל באר בנפרד לפחות 15 דקות. הוסף 5 מ"ל של DDW לתאים lysed ולסנן את הפתרונות.
  4. למדוד את ריכוז הברזל באמצעות ICP ולהשתמש בספירת התאים כדי להקליט ריכוז Fe לכל תא.

7. בידול וצמיחה של תאים בפלטפורמה מגנטית

  1. לנקות את המצע בדוגמת עם 70% v / v / אתנול ומניחים את המצע בצלחת תרבות 35 מ"מ במכסה המנוע. מניחים מגנט גדול (~ 1500 Oe) מתחת למצע בדוגמת במשך 1 דקות ולהסיר את המגנט על ידי הזזת המנה הראשונה למעלה והתרחקות מהמגנט, ולאחר מכן לקחת את המגנט מחוץ למכסה המנוע. הדליקו את האור האולטרה סגול במשך 15 דקות.
  2. מצפים את המצע עם קולגן מסוג 1 לפי סעיף 4.2. להשעות את התאים לאחר ספיגת MNP הסלולר (סעיף 5.1), זרע 105 תאים בצלחת תרבות 35 מ"מ, ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום בידול. דגירה את התרבות ב 5% CO2,חממה לחה ב 37 °C (69 °F).
  3. לאחר 24 שעות, להוסיף 1:100 מורין טרי β-NGF (ריכוז סופי של 50 ng/mL). לחדש את מדיום הבידול ולהוסיף מורין טרי β-NGF כל 2 ימים. תמונה התאים כל 2 ימים באמצעות מיקרוסקופיה אור, ולאחר היווצרות הרשת, לבצע immunostaining על התאים (סעיף 8.1).

8. כתמי תאים טעונים MNP

  1. טובולין אימונוסטין
    1. הכן 4% פתרון paraformaldehyde (PFA) על ידי ערבוב 10 מ"ל של 16% w / v פתרון PFA, 4 מ"ל של 10x PBS, ו 26 מ"ל של DDW. הכן 50 מ"ל של 1% PBT על ידי הוספת 500 μL של פעילי שטח שאינם יוניים ל 50 מ"ל של 1x PBS. הכן 50 מ"ל של 0.5% PBT על ידי ערבוב 25 מ"ל של 1% PBT עם 25 מ"ל של 1x PBS. הכן פתרון חסימה על ידי ערבוב 1% אלבומין סרום שור ו 1% סרום חמור רגיל ב 0.25% PBT.
      הערה: השתמש PFA רק בתוך מכסה המנוע הכימי.
    2. הסר את המדיום העל-טבעי מהתאים. לתקן את התאים טעון MNP ב 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מכסה המנוע כימי. לשטוף את התאים MNP טעון 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף, בתוך מכסה המנוע הכימי.
    3. לחלחל לתאים טעונים MNP עם 0.5% PBT במשך 10 דקות. דגירה תאים טעונים MNP הראשון בחסימת פתרון במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן עם נוגדן ארנב נגד α-tubulin בחסימת פתרון לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף תאים טעונים MNP 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף.
    4. דגירה תאים טעונים MNP עם נוגדן משני נגד ארנב חמור Cy2 מצומד במשך 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים MNP טעון 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף.
    5. בצע הדמיה קונפוקלית. עבור טובולין, השתמש באורך גל עירור של 492 ננומטר ואורך גל פליטה של 510 ננומטר. עבור חברי הפרלמנט (רודמין), השתמש באורך גל עירור של 578 ננומטר ואורך גל פליטה של 613 ננומטר.
  2. כתמים גרעיניים עם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)
    1. לשטוף את התאים MNP טעון 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף. הסר נוזל עודף סביב המדגם, להוסיף 1 טיפה (~ 50 μL) של הרכבה בינונית המכילה DAPI כדי לכסות שטח של 22 מ"מ x 22 מ"מ, ואת הדגירה במשך 5 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
    2. לשטוף את התאים MNP טעון 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף. בצע הדמיה קונפוקלית. עבור DAPI, השתמש באורך גל עירור של 358 ננומטר ואורך גל פליטה של 461 ננומטר. עבור חברי הפרלמנט (רודמין), השתמש באורך גל עירור של 578 ננומטר ואורך גל פליטה של 613 ננומטר.

9. מדידות וניתוח סטטיסטי

  1. ניתוח מורפומטרי של בידול תאים טעון MNP
    1. כדי למדוד את מספר הצמתים במרחקים שונים מגוף התא, לרכוש תמונות שלב של תאים תרבותיים עד 3 ימים לאחר הטיפול עם NGF.
      הערה: אם הדבר נעשה מאוחר יותר, התאים עלולים לפתח רשתות ולמנוע מדידות של רזולוציה של תא יחיד.
      1. פתח את התמונות בתוכנית עיבוד התמונה ImageJ, והשתמש בתוסף NeuronJ, המאפשר מעקב נויריט חצי אוטומטי ומדידתאורך 36. באמצעות תוסף המעקב של Neurite, עקבו אחר הנויריטים והמירו את הנתונים לתמונות בינאריות. הגדר את מרכז הסומא.
      2. בצע ניתוח Sholl, זמין בתוסף NeuronJ. הגדר את הרדיוס המקסימלי. חזור על הניסוי שלוש פעמים. לנתח יותר מ -100 תאים בכל ניסוי.
  2. ניתוח לוקליזציה של תאים
    1. כדי לקבוע את אחוז התאים המותאמים לאזור המגנטי לאחר 3 ימים של דגירה, לרכוש תמונות מיקרוסקופיות confocal של תאים עם וללא ספיגת MNP. השתמש בכתם DAPI (סעיף 8.2).
    2. לספור ידנית את התאים על גבי או חלקית על גבי התבנית (תאים נוגעים) ואת התאים שאינם. חזור על הפעולה לשלושה ניסויים. לנתח יותר מ 400 תאים עם MNP וללא ספיגה.
    3. חשב את החלק היחסי של התאים שנמצאים בראש הדפוסים המגנטיים מתוך המספר הכולל של תאים, עם ובלי MNPs. בנוסף, לחשב את אחוז האזור היעיל של התבנית המגנטית על ידי הוספת קוטר גוף התא לרוחב התבנית כדי לקבוע את ההסתברות האקראית של תאים הנחיתה על דפוס מגנטי.
    4. בצע מדגם יחיד Z-test כדי לנתח אם התפלגות התא היא תוצאה של נחיתת תא isotropic, או אם יש הטיה מועדפת לתבנית המגנטית.
  3. ניתוח כיווניות צמיחה
    1. כדי לכמת את ההשפעה על כיווניות נוייריט מחוץ לגדולה, לרכוש תמונות מיקרוסקופיות confocal של התאים עם וללא טיפול MNP לאחר 8 ימים של דגירה. בצע חיסון מכתים (סעיף 8.1).
    2. באמצעות תוכנת ImageJ, למדוד את הזווית בין נויריט התא ואת הפסים המגנטיים בשני התנאים.
      הערה: נתח רק נויריטים שמקורם בסומות הממוקמות על הפסים המגנטיים.
    3. התווה את התפלגות זוויות הנויריטים ביחס לכיוון הפסים (Δθ). בצע מבחן Chi בריבוע של התפלגות Δθ כדי להוכיח כי ההתפלגות אינה נורמלית או אחידה.

תוצאות

פלטפורמות מגנטיות עם צורות גיאומטריות שונות היו מפוברקות (איור 1A). דפוסים מגנטיים הופקדו על ידי sputtering: 14 שכבות של Co80Fe20 ו Pd, 0.2 ננומטר ו 1 ננומטר, בהתאמה. מיקרוסקופ אלקטרונים חשף את הגובה הכולל של התבניות המגנטיות כ- 18 ננומטר(איור 1B).

Discussion

התוצאות הייצוגיות ממחישות את האפקטיביות של המתודולוגיה המוצגת לשליטה וארגון היווצרות רשת עצבית בקנה מידה מיקרון. תאי PC12 הטעונים על ידי MNP נשארו בני קיימא והפכו ליחידות רגישות מגנטיות שנמשכו על ידי הכוחות המגנטיים מאלקטרודות FM לאתרים ספציפיים. הדבר בא לידי ביטוי בצורה הטובה ביותר

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, ישראל והקרן הישראלית למדע (569/16).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
6-well cell culture plateFALCON353846
96-well cell culture plateSPL life sciences30096
Amphotericin B solutionBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H photoresistMicroChemicals GmbH
AZ 351 B developerMicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA)Biological Industries03-010-1B
Cell and Tissue cultur flaskBiofilTCF00225075.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dishGreiner Bio-One627-16035 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based)Biological Industries20-300-1000
Centrifuge tubeBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% sputter targetACI Alloys99.95%
Collagen type ICorning Inc.354236Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscopeLeicaTCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Disposable needleKDL23 G
Disposable  syringeMedispo116022764010 mL
Donor horse serumBiological Industries04-124-1A
ELISA readerMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated)Biolab-chemicals52505
Fetal bovine serum (FBS)Biological Industries04-127-1A
Fresh murine β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame electromagnet .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measureKeithley2400
Keithley switching systemKeithley3700
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Light microscopeLeicaDMIL LED
Maskless photolithographyHeidelberg Inst.MLA150
Microscope SlidesBAR-NAORBN1042000C
Nitric acid 70%Sigma-Aldrich438073
Normal donkey serum (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 cell lineATCCCRL-1721
Pd sputter targetACI Alloys99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solutionBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagentMolecular probesA-13261resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulinSanta Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering systemOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamineBiological Industries01-100-1A
Sonication bathKUDOSSK3210HPFrequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometerQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173PMA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved