A سريع الغذاء تفضيل المقايسة في دروسوفيليا

Summary

نقدم بروتوكولاً لـ فحص تغذية خيارين للذباب هذا الخضوع للتغذية سريع وسهل التشغيل، وهو مناسب ليس فقط للبحوث المختبرية الصغيرة النطاق، ولكن أيضا للشاشات السلوكية عالية الإنتاجية في الذباب.

Abstract

لتحديد الغذاء ذات القيمة الغذائية مع تجنب استهلاك العوامل الضارة، تحتاج الحيوانات إلى نظام ذوق متطور وقوي لتقييم بيئتها الغذائية. ذبابة الفاكهة، Drosophila الميلانوغاستر، هو كائن حي نموذج قابل للخل وراثيا التي تستخدم على نطاق واسع لفك الأسس الجزيئية والخلوية والجسية من تفضيل الغذاء. لتحليل تفضيل الطعام الطائر ، هناك حاجة إلى طريقة تغذية قوية. وصف هنا هو اختبار التغذية خيارين، والتي هي صارمة، وتوفير التكاليف، وسريعة. المقايسة هي بيتري الطبق القائم على ويشمل إضافة اثنين من الأطعمة المختلفة تستكمل مع صبغة زرقاء أو حمراء إلى نصفي الطبق. ثم، ~ 70 prestarved، يتم وضع الذباب 2-4-day-4-العمر في الطبق ويسمح للاختيار بين الأطعمة الزرقاء والحمراء في الظلام لمدة 90 دقيقة تقريبا. ويتبع فحص البطن من كل ذبابة من حساب مؤشر تفضيل. على النقيض من لوحات متعددة، كل طبق بيتري يأخذ فقط ~ 20 s لملء ويوفر الوقت والجهد. يمكن استخدام هذا الفحص الغذائي لتحديد ما إذا كان الذباب مثل أو يكره طعامًا معينًا.

Introduction

على الرغم من الاختلافات الهائلة في البنية التشريحية لأعضاء الذوق بين الذباب والثدييات ، فإن الاستجابات السلوكية للذباب للعديد من المواد اللذيذة تشبه بشكل لافت للنظر تلك الخاصة بالثدييات. على سبيل المثال، يفضل الذباب السكر^{1،2،3،4،5،6،7،8،}الأحماض الأمينية^9،10،وانخفاض الملح^11،والتي تشير إلى المواد الغذائية، ولكن رفض الأطعمة المريرة^{12،13،14،15} التي هي غير مستساغة أو سامة. على مدى العقدين الماضيين، وقد ثبت الذباب أن كائن حي نموذج قيمة للغاية لتعزيز فهم العديد من الأسئلة الأساسية المتعلقة الإحساس بالذوق واستهلاك المواد الغذائية، بما في ذلك الكشف عن لذيذ، نقل طعم، طعم اللدونة، والتغذية تنظيم^{16،17،18،19،20}. ومن اللافت للنظر أن عددا من الدراسات أظهرت أن تحويل الذوق وآليات الدائرة العصبية الكامنة الكامنة في إدراك الذوق مماثلة بين ذباب الفاكهة والثدييات. لذلك ، فإن ذبابة الفاكهة بمثابة كائن تجريبي مثالي ، مما يتيح للباحثين الكشف عن المفاهيم والمبادئ المحفوظة تطورًا التي تحكم اكتشاف الطعام واستهلاكه في المملكة الحيوانية.

للتحقيق في الإحساس بالطعم في الذباب ، من الأهمية بمكان إنشاء فحص سريع وصارم لقياس تفضيل الطعام بموضوعية. على مر السنين ، وطرق التغذية المختلفة ، مثل المقايسات على أساس صبغ^{11،12،13،21،22،23}، و يطير proboscis تمديد استجابة المقايسة²⁴، تغذية شعرية (CAFE) مقايسة^25،26، ذبابة السائل الغذاء التفاعل عداد (FLIC) اختبار²⁷، وغيرها من أساليب combinatorial وضعت لقياس كميا تفضيل الغذاء و / أو تناول الطعام للذباب الفاكهة^{28،29،30،31}. واحدة من نماذج التغذية الشعبية هو صبغ القائمة على اثنين من خيار اختبار التغذية باستخدام إما لوحة microtiter متعددةويل^12،21،32 أو ، كما هو موضح هنا ، طبق بيتري صغيرة^11،22 كما غرفة التغذية. تم تصميم هذا الفحص بناءً على شفافية بطن الذبابة. خلال هذا الفحص ، يتم وضع الذباب في غرفة التغذية وتقديمه مع خيارين من الطعام ممزوجاً إما بصبغة حمراء أو صبغة زرقاء. بمجرد اكتمال الفحص ، تظهر البطن تطير حمراء أو زرقاء اعتمادًا على الطعام الذي استهلكوه.

كل من بيتري طبق ومجرّات التغذية متعددة المستويات القائمة على صبغة هي قوية للغاية وتسفر عن نفس النتائج تقريبا. باستخدام هذه المقايستين ، تم تحقيق العديد من الاكتشافات الهامة والاختراقات نحو فك رموز المستقبلات والخلايا المتنوعة للغاية المسؤولة عن استشعار أذواق الطعام والملمس الغذائي^{11،12،21،22،32،33}. في المقايسة القائمة على الصبغة، خطوة تجريبية واحدة تتطلب وقتا طويلا وجهدا هو إعداد وتحميل الطعام في غرفة التغذية. للحد من إعداد الطعام ووقت التحميل ، تم تعديل هذه المقايسة عن طريق استبدال لوحة microtiter متعددة الويل بطبق بيتري صغير ، والذي ينقسم إلى قسمين متساويين. في المقايسة التي تعتمد على طبق بيتري، يتم إضافة اثنين من الأطعمة المختلفة المكملة مع صبغة زرقاء أو حمراء إلى نصفي الطبق. ثم، ~ 70 prestarved، يتم وضع الذباب 2-4-day-4-العمر في الطبق ويسمح للاختيار بين الأطعمة الزرقاء والحمراء في الظلام لمدة 90 دقيقة تقريبا. ثم يتم فحص البطن من كل ذبابة، ويتم حساب مؤشر تفضيل (PI).

هذا بيتري طبق القائمة على اثنين من خيار اختبار التغذية بأسعار معقولة وبسيطة وسريعة. يتطلب لوح واحد متعدد المستويات حوالي 110 s لملء، في حين أن كل طبق بيتري يأخذ فقط ~20 s. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الصفيحة المتعددة الآبار تتطلب إدخال كميات صغيرة من الأغذية إلى عدد كبير من الآبار الصغيرة (مثل 60 بئراً أو أكثر لكل صفيحة)، الأمر الذي يتطلب قدراً كبيراً من الدقة والاهتمام. وعلى العكس من ذلك، يتطلب المقايسة القائمة على طبق بيتري إجراءين فقط لكل لوحة. كما يمكن أن تنطوي على فحص التغذية عدد كبير من النسخ المتماثلة، مقايسة بيتري الطبق القائم يوفر كمية غير تماثل من الوقت والجهد. هذا الفحص يعطي نتائج مكافئة لتلك التي من المقايسة متعددة القائم على الويل وقد ثبت نجاحه في معالجة العديد من الأسئلة الأساسية في الإحساس بالذوق، بما في ذلك الملح طعم الترميز¹¹، طعم اللدونة المعدلة من تجربة الغذاء²²، والأساس الجزيئي للالمسيج الغذائي الإحساس³³. وخلاصة القول، إن هذا الفحص القائم على خيارين من بيتري-طبق هو أداة قوية للتحقيق في كيفية إدراك الذباب للأوساط الغذائية الخارجية والداخلية لانتزاع سلوك التغذية المناسب.

Protocol

1. تجميع الدوائر المقايسة

ملاحظة: في حين يصف هذا البروتوكول استخدام طبق بيتري 35 مم(الشكل 1A)،يمكن تحقيق التأثير المطلوب باستخدام أي وعاء محكم ومصون القاع يمكن أن يقسم ويغطى.

1. أولاً، تقسيم طبق بيتري مصفى بـ 35 ملم من خلال تحديد طول من البلاستيك (5 مم في العرض و3 مم في الارتفاع) أسفل خط الوسط مع لاصق مقاوم للماء، مما يشكل مقصورتين محكمتين. تأكد من أن الختم كامل لتجنب التسرب الذي يمكن أن يؤدي إلى خلط ركائز الغذاء اثنين يجري اختبارها.
   ملاحظة: بعد التجميع، إعادة استخدام هذا الجهاز طالما الختم يحمل.

2. إعداد قارورة المجاعة

1. إعداد عدد كاف من قارورة ذبابة بلاستيكية فارغة؛ ثم، فضفاضة ضغط قطعة من الورق الأنسجة في الجزء السفلي. ضغط ورقة الأنسجة بما فيه الكفاية أنه يملأ الفضاء، ولكن ليس كثيرا أنه يشكل كتلة كثيفة.
   ملاحظة: تأكد من عدم وجود شقوق عميقة أو طيات في الأنسجة، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى الحصول على المحاصرين الذباب.
2. إضافة ~ 3 مل الماء النقي إلى القارورة بحيث يتم تشبع الأنسجة تماما، ولكن لا يوجد ماء قائم. تأكد من عدم وجود قطرات كبيرة من المياه الزائدة على جدار القارورة. بدلا من ذلك، استبدال agarose للورق غارقة عن طريق إعداد 1٪ ث / الخامس agar الحل (دون السكروز) عن طريق إضافة 5 مل من 1٪ agarose إلى كل قارورة فارغة والسماح agarose لترسيخ في درجة حرارة الغرفة.

3. تجويع الرطب من الذباب قبل التجربة

1. بدء المجاعة 24 ساعة قبل وقت التجربة. تحت CO₂ التخدير، مجموعات فرز من ~ 70، 2-4-يوم من العمر الذباب في قارورة المجاعة المعدة، ووضع العلامات على كل قارورة مع النمط الجيني ووقت المجاعة.

4. الإعداد الكاشف

1. إعداد الأصباغ
   ملاحظة: قبل إجراء أي تجارب، من المهم إجراء اختبار أولي لتحديد التركيزات الصحيحة من الأصباغ الحمراء والزرقاء لاستخدامها.
   1. للتشذيب التحكم، وإعداد مجموعة من التخفيفات لكل صبغة، وأداء مقايسة التغذية مع نفس الطعام مع لون صبغ مختلفة. استخدم النتائج لتحديد تركيزات الصبغتين (واحدة حمراء، واحدة زرقاء) التي تنتج PI من ~ 0 عند إضافة أي مركب تجريبي (انظر القسم 7).
      ملاحظة: على سبيل المثال، تم تثبيت تركيز الصبغة الزرقاء النهائي عند 50 ميكرومتر واختباره مقابل سلسلة من تركيزات الصبغة الحمراء. استنادا إلى منحنى جرعة صبغة حمراء، وكان التركيز الأمثل صبغة حمراء 210 μM، الذي أعطى الحد الأدنى من التحيز صبغ(الشكل 1B). أعلى تركيز صبغة حمراء يدفع الذباب إلى تفضيل الطعام الأحمر، في حين أن أقل تركيز يدفع الذباب إلى تفضيل الطعام الأزرق. صقل بعناية تركيزات الصبغة الزرقاء أو الحمراء بزيادات 1 ميكرومتر، حيث أن الاختلافات بهذا الحجم والأكبر يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية.
2. إعداد 1٪ agarose
   1. الجمع بين 0.5 غرام agarose و 50 مل من المياه النقية (أو بعض منها متعددة) في وعاء آمن بالموجات الدقيقة. الميكروويف حل agarose حتى يذوب، واثارة ذلك حسب الحاجة.
3. إعداد مكونات غذائية أخرى
   1. يذيب كل مكون غذائي، بما في ذلك السكروز وأي مركبات تجريبية، في الماء بتركيز 100 ضعف أو أعلى من التركيز النهائي الذي تم اختباره.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي لكل مكون غذائي يضاف إلى 1٪ أجار 1 مل لكل 10 مل أجار منصهر. وإلا، قد يكون agarose مخففة جدا، وسوف لا تتوطد بشكل مناسب.
4. إعداد وسائل الإعلام الغذائية
   1. مزيج أجار، صبغ، والمجمع التجريبي المطلوب في أنابيب الطرد المركزي البولي بروبلين المخروطية (15 أو 50 مل)؛ استخدام الماء بدلا من الطعم التجريبي في الغذاء التحكم. القيام بذلك في حين أن أجار لا يزال السائل تماما ومزيج تماما باستخدام خلاط دوامة. إبقاء الأنابيب في حمام مائي 60 درجة مئوية في حين لا تستخدم لمنع agarose من تصلب قبل أن توزع في أطباق.
5. إعداد الأطباق للتجربة
   ملاحظة: تأكد من أن جميع الأطباق جافة تمامًا قبل البدء.
   1. Pipette 1 مل من المتوسط الأحمر التجريبية الغذاء في جانب واحد من طبق المقايسة(الشكل 1A); كرر العدد المطلوب من الأطباق. السماح لأغاروز لتبرد حتى شركة (3-5 دقيقة)، ثم ماص 1 مل من الغذاء التحكم الأزرق في الجانب الآخر من الأطباق (الشكل 1A). كرر هذه العملية مع التحكم الأحمر / التجريبية الأزرق الزوج.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع الأطباق قد تم إعدادها بالكامل قبل بدء التجربة. استخدم الأطباق في غضون 30 دقيقة.

5. بدء فحص التغذية في الاتجاهين

1. شل مؤقتا خطوط الطيران التجريبية على الجليد حتى لا يتم رصد أي أنشطة محركية واضحة مثل الطيران والتسلق. مرة واحدة يتم شل حركة الذباب، عكس بلطف القارورة، والاستفادة لنقل جميع الذباب في غرفة الفحص.
   ملاحظة: صدمة الباردة يستغرق ~ 3-5 دقيقة. التعرض لفترات طويلة للبرد قد يؤثر على فسيولوجيا الذبابة والصحة، وبالتالي ينبغي تجنبها.
2. ضع الغطاء بسرعة على الغرفة واتركه جانباً. بمجرد أن يتم نقل جميع الذبابات، قم بنقل جميع الغرف إلى مساحة مظلمة ومغلقة. السماح للمجاح لتشغيل لمدة 90 دقيقة.
   ملاحظة: تقلل البيئة المظلمة من تأثير المسار البصري للذبابة على سلوك التغذية وتزيل أي إشارات بيئية من خارج الطبق.

6. إنهاء الطعم في الاتجاهين

1. بعد مرور 90 دقيقة، قم بنقل الغرف إلى ثلاجة -20 درجة مئوية للتضحية بالذباب. بعد ~1 ساعة، عد الذباب.
   ملاحظة: عكس كل طبق بيتري قبل وضع الطبق في الثلاجة لضمان عدم تجميد الذباب على الطعام.

7. تعيين مؤشر تفضيل (PI) لتحديد تفضيل الأغذية

1. تحت مجهر تشريح قياسي، فحص لون البطن الذباب 'في كل طبق على حدة. عد الذباب إما الأحمر أو الأزرق أو الأرجواني وفقا للون البطن (الشكل 2A). عد الذبابة إذا كان بطنها أكثر من 50٪ ملون، مما يدل على تغذية قوية(الشكل 2B). استبعاد ذبابة إذا كان يحتوي على بطنه بقعة الطعام صغيرة فقط، مما يدل على سوء الأكل (الشكل 2C).
2. بعد أن تم حساب أعداد الذباب الذي يأكل الأزرق أو الأحمر أو الأطعمة الزرقاء والحمراء ، استخدم المعادلة التالية لتعيين كل طبق بيتري مؤشر تفضيل (PI):

PI = (عدد الذباب تناول الطعام التجريبي) - (عدد الذباب الأكل الغذاء التحكم) / (عدد الذباب الأكل الغذاء التجريبي) + (عدد الذباب الأكل الغذاء التحكم) + (عدد الذباب الأكل الغذاء التحكم) + (عدد الذباب الأكل على حد سواء)

يشير PI > 0 إلى تفضيل المركب التجريبي، ويشير PI < 0 إلى نفور من المركب التجريبي، ويشير PI = 0 إلى عدم تأثير المركب على سلوك التغذية.

8. تنظيف الدوائر المقايسة

1. على الفور تنظيف أطباق بيتري عن طريق كشط من الركيزة الغذائية وشطفها مع الصابون غير معزز والماء. نقع أطباق بيتري بين عشية وضحاها في الماء المقطر. تحقق من أن الختم المقسم في كل طبق لا يزال محكمًا ، ثم اترك هواء الطبق جافًا.
   ملاحظة: بعد التأكد من عدم وجود agarose المتبقية أو صبغة تلطيخ، أطباق بيتري جاهزة للاستخدام مرة أخرى.

النتائج

في هذا الفحص، تم تقسيم طبق 35 مم إلى قسمين متساويين للتغذية، حيث يحتوي كل نصف من الطبق على طعام agarose إلى جانب صبغة زرقاء أو حمراء(الشكل 1A). لاستبعاد التحيز صبغ، تم صقل تركيزات صبغة زرقاء وحمراء بعناية لتحقيق تقريبي "0" PI عندما تم إضافة هذين الأصباغ فقط(الشكل 1B). ?...

Discussion

تتضمن هذه الطريقة عدة خطوات هامة حيث يمكن أن تحدث مشاكل. أولاً، تأكد من أن الذباب يبتلع كمية كافية من الطعام لتوفير بيانات مستقرة. إذا كان الذباب يأكل بشكل سيئ ، تأكد من أن الذباب قد تم تجويعه لمدة 24 ساعة على الأقل ، وأن الوسائط التجريبية تحتوي على الحد الأدنى من تركيز السكروز (2 mM). لمزيد من ت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	Fisher Scientific	08-772E
Agarose	Thomas Scientific	C756P56
Clear adhesive	Fisher Scientific	NC9884114
Conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-527-90
Dissection microscope	Amscope	SM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant Blue	Wako Chemical	3844-45-9
Fly CO2 anesthesia setup	Genesee Scientfic	59-114/54-104M
Fly incubator with programmable day/night cycle	Powers Scientific Inc.	IS33SD
Fly lines
Glass dish (microwave-safe)
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A
Media storage bottle	Fisher Scientific	50-192-9998
Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm
Plastic fly vials	Genesee Scientific	32-116
Sucrose	Millipore Sigma	S9378
Sulforhodamine B	Millipore Sigma	S9012
Tastant compound of interest
Vortex mixer	Benchmark Scientific	BV1000
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD05