Un ensayo rápido de preferencia alimentaria en Drosophila

Resumen

Presentamos un protocolo para un ensayo de alimentación de dos opciones para moscas. Este ensayo de alimentación es rápido y fácil de ejecutar y es adecuado no sólo para la investigación de laboratorio a pequeña escala, sino también para pantallas de comportamiento de alto rendimiento en moscas.

Resumen

Para seleccionar alimentos con valor nutricional evitando al mismo tiempo el consumo de agentes dañinos, los animales necesitan un sistema de sabor sofisticado y robusto para evaluar su entorno alimentario. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un organismo modelo genéticamente tractable que se utiliza ampliamente para descifrar los fundamentos moleculares, celulares y neuronales de la preferencia alimentaria. Para analizar la preferencia de los alimentos con mosca, se necesita un método de alimentación robusto. Aquí se describe un ensayo de alimentación de dos opciones, que es riguroso, que ahorra costos y es rápido. El ensayo es a base de placa de Petri e implica la adición de dos alimentos diferentes complementados con tinte azul o rojo a las dos mitades del plato. A continuación, ~ 70 precediendo, 2-4 días de edad moscas se colocan en el plato y se les permite elegir entre alimentos azules y rojos en la oscuridad durante unos 90 minutos. El examen del abdomen de cada mosca es seguido por el cálculo del índice de preferencias. A diferencia de las placas multiwell, cada placa Petri toma sólo ~ 20 s para llenar y ahorra tiempo y esfuerzo. Este ensayo de alimentación se puede emplear para determinar rápidamente si a las moscas les gusta o no un alimento en particular.

Introducción

A pesar de las diferencias dramáticas en la estructura anatómica de los órganos gustativos entre moscas y mamíferos, las respuestas conductuales de las moscas a muchas sustancias tástricas son sorprendentemente similares a las de los mamíferos. Por ejemplo, las moscas prefieren el azúcar^{1,2,3,4,5,6,7,8,}aminoácidos^9,10y baja sal^11,que indican nutrientes, pero rechazan los alimentos amargos^12,13,14,15 que son desagradables o tóxicos. En las últimas dos décadas, las moscas han demostrado ser un organismo modelo muy valioso para avanzar en la comprensión de muchas cuestiones fundamentales relacionadas con la sensación del gusto y el consumo de alimentos, incluyendo la detección de tastant, la transducción del sabor, la plasticidad del sabor y la regulación de alimentación^{16,17,18,19,20.} Notablemente, una serie de estudios han demostrado que la transducción del sabor y los mecanismos de circuito neural subyacentes a la percepción del gusto son análogos entre las moscas de la fruta y los mamíferos. Por lo tanto, la mosca de la fruta sirve como un organismo experimental ideal, permitiendo a los investigadores descubrir conceptos y principios conservados evolutivamente que rigen la detección y el consumo de alimentos en el reino animal.

Para investigar la sensación de sabor en las moscas, es fundamental establecer un ensayo rápido y riguroso para medir objetivamente la preferencia alimentaria. A lo largo de los años, varios métodos de alimentación, tales como ensayos a base de tintes^{11,12,13,21,22,23}, el ensayo de respuesta de extensión de proboscis mosca²⁴, el alimentador capilar (CAFE) ensayo^25,26, el ensayo Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC)²⁷y otros métodos combinatorios se han desarrollado para medir cuantitativamente la preferencia alimentaria y/o la ingesta de alimentos para moscas de la fruta^28,29,30,31. Uno de los paradigmas de alimentación populares es el ensayo de alimentación a base de tinte de dos opciones utilizando una placa de microtitro multi-well^12,21,32 o, como se describe aquí, una pequeña placa de Petri^11,22 como cámara de alimentación. Este ensayo está diseñado sobre la base de la transparencia del abdomen de la mosca. Durante este ensayo, las moscas se colocan en la cámara de alimentación y se presentan con dos opciones de alimentos mezclados con tinte rojo o tinte azul. Una vez completado el ensayo, los abdomens de mosca aparecen rojos o azules dependiendo de los alimentos que hayan consumido.

Tanto la placa Petri como los ensayos de alimentación a base de tinte multiwell-plate son altamente robustos y producen aproximadamente los mismos resultados. Utilizando estos dos ensayos, numerosos descubrimientos importantes y avances se han hecho para descifrar los receptores y células altamente diversificados responsables de detectar los gustos de los alimentos y la textura de los alimentos^{11,12,21,22,32,33}. En el ensayo a base de tinte, un paso experimental que requiere un tiempo y esfuerzo considerables es preparar y cargar alimentos en la cámara de alimentación. Para reducir el tiempo de preparación y carga de los alimentos, este ensayo se modificó reemplazando la placa de microtiter multiporípodo por una pequeña placa Petri, que se divide en dos compartimentos iguales. En el ensayo a base de placas de Petri, se añaden dos alimentos diferentes complementados con tinte azul o rojo a las dos mitades del plato. A continuación, ~ 70 precediendo, 2-4 días de edad moscas se colocan en el plato y se les permite elegir entre alimentos azules y rojos en la oscuridad durante unos 90 minutos. A continuación, se examina el abdomen de cada mosca y se calcula el índice de preferencias (PI).

Este ensayo de alimentación de dos opciones basado en placas Petri es asequible, simple y rápido. Una placa multi-well requiere aproximadamente 110 s para llenar, mientras que cada placa Petri toma sólo ~ 20 s. Además, la placa multipobado requiere canalizar pequeños volúmenes de alimentos en un gran número de pequeños pozos (por ejemplo, 60 o más pozos por plato), lo que requiere una precisión y atención considerables. Por el contrario, el ensayo basado en placas De Petri requiere sólo dos acciones por plato. Como el ensayo de alimentación puede implicar un gran número de réplicas, el ensayo basado en placas De Petri ahorra una cantidad notrivial de tiempo y esfuerzo. Este ensayo da resultados equivalentes a los del ensayo a base de múltiples oleajes y ha demostrado tener éxito en abordar muchas preguntas fundamentales en la sensación de sabor, incluyendo la codificación del sabor de la sal^11,la plasticidad del sabor modificado por la experiencia alimentaria^22,y la base molecular de la sensación de textura de los alimentos^33. En resumen, este ensayo de dos opciones basado en placas de Petri es una poderosa herramienta para investigar cómo las moscas perciben los ambientes de nutrientes externos e internos para provocar un comportamiento de alimentación adecuado.

Protocolo

1. Montaje de las cámaras de ensayo

NOTA: Si bien este protocolo describe el uso de una placa Petri de 35 mm(Figura 1A),el efecto deseado se puede lograr utilizando cualquier recipiente estanco y de fondo liso que pueda ser bisectado y cubierto.

1. En primer lugar, bisect una placa Petri tapada de 35 mm fijando una longitud de plástico (5 mm de ancho y 3 mm de altura) por la línea media con adhesivo impermeable, formando dos compartimentos estancos. Confirme que el sello está completo para evitar fugas que puedan llevar a la mezcla de los dos sustratos alimentarios que se están probando.
   NOTA: Después del montaje, reutilice este aparato siempre y cuando el sello se mantenga.

2. Preparación de viales de inanición

1. Preparar un número suficiente de viales de plástico vacíos; luego, compactar libremente un pedazo de papel tisú en la parte inferior. Comprima el papel tisú lo suficiente como para llenar el espacio, pero no tanto que forme una masa densa.
   NOTA: Asegúrese de que no haya grietas profundas o pliegues en el tejido, ya que esto puede llevar a que las moscas queden atrapadas.
2. Agregue ~3 ml de agua pura al vial para que el tejido esté completamente saturado, pero no hay agua estancada. Asegúrese de que no haya gotas grandes de exceso de agua en la pared del vial. Alternativamente, sustituir la agarose por el papel empapado mediante la preparación de una solución de agar 1% w/v (sin sacarosa) añadiendo 5 ml de 1% de agarose a cada vial vacío y permitiendo que la agarose se solidifique a temperatura ambiente.

3. Inanición húmeda de moscas antes del experimento

1. Inicie la inanición 24 h antes del momento del experimento. Bajo anestesia de CO_2, clasifica grupos de ~70, moscas de 2-4 días de edad en los viales de inanición preparados, etiquetando cada vial con el genotipo y el tiempo de inanición.

4. Configuración de reactivos

1. Preparación de tintes
   NOTA: Antes de realizar cualquier experimento, es importante realizar un ensayo de control preliminar para determinar las concentraciones correctas de tintes rojos y azules a utilizar.
   1. Para el ensayo de control, prepare una gama de diluciones para cada tinte y realice el ensayo de alimentación con el mismo alimento con un color de tinte diferente. Utilice los resultados para identificar concentraciones de dos tintes (un rojo, otro azul) que producen un PI de ~0 cuando no se agrega ningún compuesto experimental (ver sección 7).
      NOTA: Por ejemplo, la concentración final de tinte azul se fijó en 50 μM y se probó contra una serie de concentraciones de tinte rojo. Basado en la curva de dosificación de tinte rojo, la concentración óptima de tinte rojo fue de 210 μM, lo que dio un sesgo mínimo de tinte (Figura 1B). Una mayor concentración de tinte rojo impulsa a las moscas a preferir los alimentos rojos, mientras que una menor concentración impulsa a las moscas a preferir la comida azul. Refinar cuidadosamente las concentraciones de colorante azul o rojo en incrementos de 1 μM, ya que las diferencias de esta magnitud y mayores pueden afectar a los resultados experimentales.
2. Preparación del 1% de agarose
   1. Combine 0,5 g de agarose y 50 ml de agua pura (o algunos de ellos múltiples) en un recipiente apto para microondas. Microondas la solución de agarose hasta que se disuelva, revolviendo según sea necesario.
3. Preparación de otros componentes alimentarios
   1. Disolver cada componente alimentario, incluyendo sacarosa y cualquier compuesto experimental, en agua a una concentración 100 veces o mayor de la concentración final probada.
      NOTA: El volumen total de cada ingrediente alimenticio añadido al 1% de agar no debe exceder de 1 ml por agar fundido de 10 ml. De lo contrario, la agarose puede diluirse demasiado y no se solidificará adecuadamente.
4. Preparación de medios alimentarios
   1. Mezcle el agar, el tinte y el compuesto experimental deseado en tubos centrífugas de polipropileno cónico (15 o 50 ml); utilizar agua en lugar del tacstant experimental en el alimento de control. Haga esto mientras el agar todavía es completamente líquido y mezcle bien usando un mezclador de vórtice. Mantenga los tubos en un baño de agua de 60 °C mientras no esté en uso para evitar que la agarose se endurezca antes de ser distribuida en platos.
5. Preparación de platos para el experimento
   NOTA: Asegúrese de que todos los platos estén completamente secos antes de comenzar.
   1. Pipeta 1 mL de medio de alimentos experimentales rojos en un lado del plato de ensayo (Figura 1A); repetir para el número deseado de platos. Deje que la agarose se enfríe hasta que se firme (3-5 min), y luego pipetear 1 mL de comida de control azul en el otro lado de los platos(Figura 1A). Repita este proceso con el par azul rojo/experimental de control.
      NOTA: Asegúrese de que todos los platos estén completamente configurados antes de comenzar el experimento. Utilice los platos en un plazo de 30 minutos.

5. Iniciar el ensayo de alimentación bidireccional

1. Paralizar temporalmente las líneas de vuelo experimentales sobre hielo hasta que no se observen actividades motoras obvias como volar y escalar. Una vez inmovilizadas las moscas, invierta suavemente el vial y toque para transferir todas las moscas a la cámara de ensayo.
   NOTA: Choque frío toma ~ 3-5 min. La exposición prolongada al frío puede afectar la fisiología y la salud de la mosca y, por lo tanto, debe evitarse.
2. Coloque rápidamente la cubierta en la cámara y reservela. Una vez que todas las moscas hayan sido transferidas, mueva todas las cámaras a un espacio oscuro y cerrado. Permita que el ensayo funcione durante 90 minutos.
   NOTA: Un entorno oscuro minimiza la influencia de la vía visual de la mosca en el comportamiento de alimentación y elimina cualquier señal ambiental del exterior del plato.

6. Terminación del ensayo de alimentación bidireccional

1. Después de que hayan transcurrido 90 minutos, transfiera las cámaras a un congelador de -20 °C para sacrificar las moscas. Después de ~1 h, cuente las moscas.
   NOTA: Invertir cada placa de Petri antes de colocar el plato en el congelador para asegurarse de que no se congelarán moscas en el alimento.

7. Asignar un índice de preferencias (PI) para determinar la preferencia alimentaria

1. Bajo un microscopio de disección estándar, examine el color abdominal de las moscas en cada plato individual. Cuente las moscas como rojas, azules o púrpuras según el color de su abdomen(Figura 2A). Cuente la mosca si su abdomen está más del 50% coloreado, lo que indica una alimentación robusta(Figura 2B). Excluya la mosca si su abdomen contiene sólo un pequeño punto de comida, lo que indica una mala alimentación(Figura 2C).
2. Después de contar el número de moscas que comen alimentos azules, rojos o azules y rojos, utilice la siguiente ecuación para asignar a cada placa de Petri un índice de preferencias (PI):

PI = (Número de moscas comiendo alimentos experimentales) - (Número de moscas comiendo alimentos de control) / (Número de moscas comiendo alimentos experimentales) + (Número de moscas comiendo alimentos de control) + (Número de moscas comiendo ambas)

PI > 0 indica una preferencia por el compuesto experimental, PI < 0 indica una aversión al compuesto experimental, y PI = 0 indica ningún efecto del compuesto en el comportamiento de alimentación.

8. Limpieza de las cámaras de ensayo

1. Limpie rápidamente los platos de Petri raspando el sustrato de alimentos y enjuagando con agua y jabón sin aroma. Remoje los platos de Petri durante la noche en agua destilada. Compruebe que el sello divisorio en cada plato todavía está estanco, luego deje que el plato se seque al aire.
   NOTA: Después de asegurarse de que no haya agarose residual o tinción de tinte, las placas Petri están listas para usarse de nuevo.

Resultados

En este ensayo, un plato de 35 mm se dividió en dos compartimentos de alimentación iguales, con cada mitad del plato que contenía alimentos agarose junto con tinte azul o rojo(Figura 1A). Para excluir el sesgo de tinte, las concentraciones de tinte azul y rojo se refinaron cuidadosamente para producir un PI aproximado "0" cuando sólo se añadieron estos dos tintes (Figura 1B). Una vez que la placa de Petri fue cargada con alimentos probados, ~ 70 moscas adul...

Discusión

Este método implica varios pasos cruciales donde pueden producirse problemas. En primer lugar, asegúrese de que las moscas ingieren una cantidad suficiente de alimentos para proporcionar datos estables. Si las moscas comen mal, asegúrese de que las moscas hayan estado hambrientas durante al menos 24 h, y que el medio experimental contenga al menos una concentración mínima de sacarosa (2 mM). Para estimular aún más el consumo de alimentos, prolongue el período de inanición húmeda más allá de las 24 h, dependie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Petri dish	Fisher Scientific	08-772E
Agarose	Thomas Scientific	C756P56
Clear adhesive	Fisher Scientific	NC9884114
Conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-527-90
Dissection microscope	Amscope	SM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant Blue	Wako Chemical	3844-45-9
Fly CO2 anesthesia setup	Genesee Scientfic	59-114/54-104M
Fly incubator with programmable day/night cycle	Powers Scientific Inc.	IS33SD
Fly lines
Glass dish (microwave-safe)
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A
Media storage bottle	Fisher Scientific	50-192-9998
Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm
Plastic fly vials	Genesee Scientific	32-116
Sucrose	Millipore Sigma	S9378
Sulforhodamine B	Millipore Sigma	S9012
Tastant compound of interest
Vortex mixer	Benchmark Scientific	BV1000
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD05