JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представляем протокол для анализа кормления мух по два выбора. Это кормление анализ быстро и легко работать и подходит не только для небольших лабораторных исследований, но и для высокой пропускной способности поведенческих экранов у мух.

Аннотация

Чтобы выбрать пищу с питательной ценностью, избегая при этом потребления вредных веществ, животные нуждаются в сложной и надежной системе вкуса для оценки их пищевой среды. Плодовая муха, Drosophila меланогастер, является генетически урочищенных модель организма, который широко используется для расшифровки молекулярных, клеточных и нейронных основ пищевых предпочтений. Для анализа предпочтений мухи питания необходим надежный метод кормления. Описано здесь два выбора кормления анализ, который является строгим, экономия средств, и быстро. Анализ на основе Петри-блюдо и включает в себя добавление двух различных продуктов, дополненных синим или красным красителем на две половинки блюда. Затем, 70 фунтов стерлингов prestarved, 2-4-дневные мухи помещаются в блюдо и разрешено выбирать между синими и красными продуктами в темноте около 90 минут. Изучение брюшной полости каждой мухи сопровождается расчетом индекса предпочтений. В отличие от многоэлеберных пластин, каждое блюдо Петри занимает всего 20 с, чтобы заполнить и экономит время и усилия. Это кормление анализ может быть использован для быстрого определения того, мухи, как или не нравится конкретной пищи.

Введение

Несмотря на значительные различия в анатомической структуре вкусовых органов между мухами и млекопитающими, поведенческие реакции мух на многие вкусные вещества поразительно похожи на реакцию млекопитающих. Например, мухи предпочитаютсахар 1,2,3,4,5,6,7,8,аминокислоты 9,10инизкую соль11,которые указывают на питательные вещества, ноотвергают горькие продукты 12,13,14,15, которые являются неприятными или токсичными. За последние два десятилетия мухи зарекомендовали себя как очень ценная модель организма для продвижения понимания многих фундаментальных вопросов, связанных со вкусом ощущения и потребления пищи, в том числе вкус обнаружения, вкус трансдукции, вкусовой пластичности,и кормления регулирования 16,17,18,19,20. Примечательно, что ряд исследований показал, что вкус трансдукции и нейронных механизмов цепи, лежащих в основе восприятия вкуса аналогичны между плодовых мушек и млекопитающих. Таким образом, плодовая муха служит идеальным экспериментальным организмом, что позволяет исследователям раскрыть эволюционно сохраненные концепции и принципы, которые регулируют обнаружение и потребление пищи в животном мире.

Чтобы исследовать вкусовые ощущения у мух, очень важно установить быстрый и строгий анализ, чтобы объективно измерить предпочтения в еде. На протяжении многих лет различные методы кормления, такие как краситель наоснове анализов 11,12,13,21,22,23, летать хоботок расширение ответ анализ24, Капиллярный feeder (CAFE) анализ25,26, Fly Liquid-Food Взаимодействия Счетчик (FLIC) анализ27, и другие комбинаторные методы были разработаны для количественного измерения пищевых предпочтений и / или потребление пищи дляплодовых мушек 28,29,30,31. Одной из популярных парадигм кормления является краситель основе двух вариантов кормления анализа с использованием либо multiwell микротитрпластины 12,21,32 или, как описано здесь, небольшой чашки Петри11,22 в качестве кормунителя камеры. Этот анализ разработан на основе прозрачности живота мухи. Во время этого анализа, мухи помещаются в камеру кормления и представлены два варианта питания смешивается с красным красителем или синим красителем. После того, как анализ завершен, летать животы появляются красные или синие в зависимости от того, какую пищу они потребляли.

Как Петри-блюдо, так и многоявечее покрытие на основе красителя кормления являются весьма надежными и дают примерно одинаковые результаты. Используя эти два анализа, многочисленные важные открытия и прорывы были сделаны в направлении расшифровки высоко диверсифицированных рецепторов и клеток, ответственных за зондированиевкусов пищи и текстуры пищи 11,12,21,22,32,33. В анализе на основе красителя одним экспериментальным шагом, требующим значительного времени и усилий, является подготовка и загрузка пищи в кормовую камеру. Чтобы сократить время приготовления пищи и погрузки, этот анализ был изменен путем замены многоуровной пластины микротитр с небольшой чашкой Петри, которая разделена на два равных отсека. В анализе на основе чашки Петри в две половинки блюда добавляются две различные продукты, дополненные синим или красным красителем. Затем, 70 фунтов стерлингов prestarved, 2-4-дневные мухи помещаются в блюдо и разрешено выбирать между синими и красными продуктами в темноте около 90 минут. Затем изучается брюшной полости каждой мухи и рассчитывается индекс предпочтений (PI).

Это Петри-блюдо основе двух вариантов кормления анализ является доступным, простым и быстрым. Одна многоярдная пластина требует около 110 с для заполнения, в то время как каждая чашка Петри занимает всего 20 с. Кроме того, многоухардная пластина требует трубопроводов небольших объемов продовольствия в большое количество небольших скважин (например, 60 или более скважин на тарелку), что требует значительной точности и внимания. И наоборот, анализ на основе чашки Петри требует только двух действий на тарелку. Поскольку анализ кормления может включать в себя большое количество репликаций, анализ на основе петри-блюда экономит нетривиаляльное количество времени и усилий. Этот анализ дает результаты, эквивалентные тем из multiwell основе анализа и оказался успешным в решении многих фундаментальных вопросов в вкусовых ощущений, в том числесоль вкус кодирования 11, вкус пластичностьизменены пищевой опыт 22, и молекулярной основой пищевой текстурыощущение 33. Таким образом, это Петри-блюдо основе двух вариантов анализа является мощным инструментом для расследования того, как мухи воспринимают внешние и внутренние питательные среды, чтобы вызвать соответствующее поведение кормления.

протокол

1. Сборка камер анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как этот протокол описывает использование 35 мм чашки Петри(рисунок 1A), желаемый эффект может быть достигнут с помощью любого водонепроницаемого, гладкого дна судна, которые могут быть разделены и покрыты.

  1. Во-первых, раздекните крышкой 35 мм чашку Петри, зафиксировав длину пластика (5 мм в ширину и 3 мм в высоту) вниз по средней линии с водонепроницаемым клеем, образуя два водонепроницаемых отсека. Подтвердите, что уплотнение завершено, чтобы избежать утечки, которая может привести к смешиванию двух пищевых субстратов время анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После сборки повторное использование этого аппарата до тех пор, пока уплотнение держится.

2. Подготовка голодных флаконов

  1. Подготовь достаточное количество пустых пластиковых флаконов мухи; затем, свободно компактный кусок бумаги ткани в нижней части. Сжать бумагу достаточно, чтобы она заполнял пространство, но не настолько, чтобы она образует плотную массу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в тканях нет глубоких щелей или складок, так как это может привести к тому, что мухи оказываются в ловушке.
  2. Добавьте в флакон чистую воду в размере 3 мл, чтобы ткань была полностью насыщенной, но стоячей воды нет. Убедитесь, что на стене флакона нет больших капель избыточной воды. Кроме того, заменить агарозу для пропитанной бумаги, подготовив 1% ж / в агар раствор (без сахарозы), добавив 5 мл 1% агарозы на каждый пустой флакон и позволяет агарозы затвердеть при комнатной температуре.

3. Влажный голод мух до эксперимента

  1. Инициировать голод 24 ч до начала эксперимента. Поднаркозом CO 2 сортируют группы по 70 евро, 2-4-дневные мухи в подготовленные голодные флаконы, маркируют каждый флакон генотипом и временем голодания.

4. Установка реагентов

  1. Приготовление красителей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выполнением каких-либо экспериментов, важно выполнить предварительный анализ контроля, чтобы определить правильные концентрации красных и синих красителей для использования.
    1. Для контроля анализа, подготовить ряд разбавлений для каждого красителя, и выполнять кормления анализ с той же пищи с различным цветом красителя. Используйте результаты для определения концентраций двух красителей (один красный, один синий), которые дают PI 0, когда не добавляется экспериментальное соединение (см. раздел 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, окончательная концентрация синего красителя была зафиксирована на уровне 50 МКМ и протестирована на основе ряда концентраций красного красителя. Основываясь на кривой дозировки красного красителя, оптимальная концентрация красного красителя составила 210 МКМ, что дало минимальный уклон красителя(рисунок 1B). Более высокая концентрация красного красителя заставляет мух предпочитать красную пищу, в то время как более низкая концентрация заставляет мух предпочитать синюю пищу. Тщательно уточните концентрации синего или красного красителя с шагом в 1 мкм, так как различия такого масштаба и больше могут повлиять на экспериментальные результаты.
  2. Приготовление 1% агарозы
    1. Смешайте 0,5 г агарозы и 50 мл чистой воды (или несколько ее нескольких) в микроволновом сосуде. Микроволновая печь раствор агарозы до растворения, помешивая его по мере необходимости.
  3. Приготовление других пищевых компонентов
    1. Растворите каждый пищевой компонент, включая сахарозу и любые экспериментальные соединения, в воде при 100-кратной или более высокой концентрации конечной испытанной концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем каждого пищевого ингредиента, добавленного в 1% агара, не должен превышать 1 мл на 10 мл расплавленного агара. В противном случае агароза может быть слишком разбавленной и не затвердеет надлежащим образом.
  4. Подготовка пищевых средств массовой информации
    1. Смешать агар, краситель и желаемое экспериментальное соединение в конических полипропиленовых центрифугах (15 или 50 мл); использовать воду вместо экспериментального вкусного в контрольной пище. Сделайте это в то время как агар по-прежнему полностью жидкости и тщательно перемешать с помощью вихревого смесителя. Храните трубки в водяной бане 60 градусов по Цельсию, не используя их для предотвращения затвердевания агарозы перед тем, как их распределили в посуду.
  5. Подготовка блюд к эксперименту
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все блюда полностью сухие перед началом.
    1. Pipette 1 мл красной экспериментальной пищевой среды в одну сторону блюда анализа(рисунок 1A); повторить для нужного количества блюд. Дайте агарозе остыть до твердого (3-5 мин), а затем пипетку 1 мл голубой контрольной пищи в другую сторону посуды(рисунок 1A). Повторите этот процесс с помощью управления красно-экспериментальной синей парой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все блюда полностью установлены перед началом эксперимента. Используйте блюда в течение 30 минут.

5. Инициирование двухгового кормления

  1. Временно парализовать экспериментальные линии полета на льду, пока не наблюдается очевидных двигательных действий, таких как полет и альпинизм. После того, как мухи обездвижены, аккуратно инвертировать флакон, и нажмите, чтобы передать все мухи в камеру анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Холодный шок занимает 3-5 мин. Длительное воздействие холода может повлиять на физиологию и здоровье мухи и поэтому следует избегать.
  2. Быстро поместите крышку на камеру и отложите ее в сторону. После того, как все мухи были переданы, переместить все камеры в темное, замкнутое пространство. Разрешить анализ для запуска в течение 90 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Темная среда сводит к минимуму влияние визуального пути мухи на поведение кормления и удаляет любые экологические сигналы из-за пределов блюда.

6. Прекращение анализа на два способа кормления

  1. По протяждать 90 минут, перенесите камеры в морозильную камеру -20 градусов по Цельсию, чтобы принести мух в жертву. После 1 ч, подсчитайте мух.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертировать каждое блюдо Петри перед размещением блюдо в морозильной камере, чтобы убедиться, что не мухи будут заморожены на продукты питания.

7. Назначение индекса предпочтений (PI) для определения предпочтений в еде

  1. Под стандартным микроскопом вскрытия, изучить брюшной цвет мух в каждом отдельном блюде. Подсчитайте мух, как красный, синий или фиолетовый в зависимости от цвета живота (Рисунок 2A). Подсчитайте муху, если ее живот более чем на 50% окрашен, что указывает на надежное кормление(рисунок 2B). Исключите муху, если ее живот содержит только крошечное место питания, что указывает на плохое питание(рисунок 2C).
  2. После того, как количество мух, питаясь синим, красным или синим и красным продуктами, будет подсчитано, используйте следующее уравнение, чтобы назначить каждому блюду Петри индекс предпочтений (PI):

ИП (Количество мух, питаясь экспериментальной пищей) - (Количество мух, питаясь контрольной пищей) / (Количество мух, питаясь экспериментальной пищей)

PI > 0 указывает на предпочтение экспериментального соединения, PI < 0 указывает на отвращение к экспериментальному соединению, а PI No 0 не указывает на отсутствие влияния соединения на поведение кормления.

8. Очистка камер анализа

  1. Быстро очистить чашки Петри, выскабливание пищевой субстрат и полоскания их с без запаха мыла и воды. Замочите блюда Петри на ночь в дистиллированной воде. Убедитесь, что разделительная печать в каждом блюде по-прежнему водонепроницаема, а затем дайте блюду высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После обеспечения того, чтобы не было остаточной агарозы или окрашивания красителя, блюда Петри готовы использовать снова.

Результаты

В этом анализе, 35 мм блюдо было разделено на два равных отсеков кормления, с каждой половиной блюдо, содержащее пищу агарозы в сочетании с синим или красным красителем (Рисунок 1A). Чтобы исключить необъективность красителя, концентрации синего и красного красителей были ...

Обсуждение

Этот метод включает в себя несколько важных шагов, где проблемы могут возникнуть. Во-первых, убедитесь, что мухи ingest достаточное количество пищи, чтобы обеспечить стабильные данные. Если мухи едят плохо, убедитесь, что мухи были мокрые голодали, по крайней мере 24 ч, и что экспериментальны...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов или конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Tingwei Mi за помощь им оптимизировать два выбора кормления анализ. Они также хотели бы поблагодарить Сэмюэля Чана и Уайатта Кулмие за их комментарии к рукописи. Этот проект финансировался Национальными институтами здравоохранения грантов R03 DC014787 (Y.V.З.) и R01 DC018592 (Y.V.З.) и Фондом Амброуза Монелла.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm Petri dishFisher Scientific08-772E
AgaroseThomas ScientificC756P56
Clear adhesiveFisher ScientificNC9884114
Conical centrifuge tubesFisher Scientific05-527-90
Dissection microscopeAmscopeSM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant BlueWako Chemical3844-45-9
Fly CO2 anesthesia setupGenesee Scientfic59-114/54-104M
Fly incubator with programmable day/night cyclePowers Scientific Inc.IS33SD
Fly lines
Glass dish (microwave-safe)
KimwipesFisher Scientific06-666A
Media storage bottleFisher Scientific50-192-9998
Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm
Plastic fly vialsGenesee Scientific32-116
SucroseMillipore SigmaS9378
Sulforhodamine BMillipore SigmaS9012
Tastant compound of interest
Vortex mixerBenchmark ScientificBV1000
Water bathFisher ScientificFSGPD05

Ссылки

  1. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  2. Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
  3. Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
  4. Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
  5. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
  6. Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
  7. Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
  8. Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
  9. Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
  10. Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
  11. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  12. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  13. Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
  15. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  16. Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
  17. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  18. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  19. Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
  20. Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
  21. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  22. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  23. Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
  24. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
  25. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  26. Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
  27. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
  28. Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
  29. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  30. Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
  31. Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
  32. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
  33. Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
  34. Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
  35. Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
  36. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены