نزيف بونتين ضخمة عن طريق الحقن المزدوج للدم الذاتي

Summary

نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج نزيف بونتين ضخم في الفئران عن طريق الحقن المزدوج للدم الذاتي.

Abstract

نحن نقدم بروتوكول لإنشاء نموذج نزيف بونتين ضخمة في الفئران. استخدمت الفئران التي تزن حوالي 250 غراما في هذه الدراسة. تم أخذ مائة ميكرولتر من الدم الذاتي من الوريد الذيل وحقنها بشكل ستيريوتكاكسيكالي في المهور. تم تقسيم عملية الحقن إلى خطوتين: أولا، تم حقن 10 ميكرولتر من الدم في مكان معين، وضعية الأمامي (AP) -9.0 مم. الجانبي (لات) 0 مم؛ عمودي (فيرت) -9.2 ملم، تليها حقنة ثانية من الدم المتبقي الموجود في AP -9.0 مم؛ اللات 0 مم; Vert -9.0 مم مع فاصل زمني مدته 20 دقيقة. تم استخدام اختبار شعاع التوازن واختبار موضع الطرفين وعصب Voestch المعدل لتقييم الوظيفة العصبية. تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لتقييم حجم النزيف في الجسم الحي. وكانت أعراض هذا النموذج تمشيا مع المرضى الذين يعانون من نزيف بونتين ضخمة.

Introduction

النزيف داخل المخ يمثل خمس مرضى السكتة الدماغية. يعتمد تشخيص النزيف داخل المخ على سرعة وحجم وموقع النزيف^1،2. بالمقارنة مع نزيف الدماغ الأمامي ، فإن نزيف جذع الدماغ لديه معدل وفيات واعتلال أعلى³. حوالي 40٪ من نزيف جذع الدماغ يحدث في المهور⁴. المسببات والفيزيولوجيا المرضية لنزيف بونتين مختلفة تماما وأقل دراسة من نزيف الدماغ الأمامي⁵.

هناك نوعان من النماذج الحيوانية نزيف بونتين. واحد هو نموذج نزيف عفوي الناجمة عن ضخ الكولاجين البكتيري في المهور^6،7،8. أكبر ميزة لهذا النموذج هو أن النزيف هو عفوي. ومع ذلك، الكولاجيناز يمكن أن تحفز سوى حجم صغير من نزيف بونتين. الى جانب ذلك، الكولاجيناز قد يسبب إصابات أخرى في الدماغ. يتم تحريض النموذج الآخر عن طريق الحقن المجسم للدم الذاتي في المهور⁹. ميزة هذا النموذج هو أنه من السهل لإتقان مع نسبة نجاح عالية. نظريا، يمكن للباحثين حقن أي حجم من الدم في أي مكان من المهور. ومع ذلك ، بسبب التسرب الخلفي من خلال مسار الإبرة ، فإن الحجم المحقون محدود. في الآونة الأخيرة ، تم الترويج لطريقة الحقن المزدوج للحد من التسرب الخلفي⁹. هذه الطريقة تحقن الدم الذاتي مرتين مع فاصل زمني لمدة 20 دقيقة بين الحقن. يتم تطبيق طريقة الحقن المزدوج للحث على نزيف بونتين خفيف (30 ميكرولتر) ومعتدل (60 ميكرولتر) ولكن ليس نزيف بونتين هائل. في العيادة، فإن غالبية المرضى الذين يعانون من نزيف بونتين يعانون من سوء التكهن لديهم نزيف هائل (أكثر من 10 مل).

في الدراسة السابقة، قدمنا بروتوكولا لإنشاء نموذج السكتة الدماغية بونتين في الفئران¹⁰. في هذه الدراسة، نقوم بتعديل طريقة الحقن المزدوج القائمة، وتوفير بروتوكول مفصل للحث على نزيف بونتين ضخمة في الفئران عن طريق الحقن المزدوج من الدم الذاتي 100 ميكرولتر في موقعين مختلفين في المهور.

Protocol

وقد راجعت البروتوكول ووافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة للمستشفى الثانى التابع لجامعة قوانغتشو الطبية . تم توفير الفئران من قبل مركز الحيوانات في الجامعة الطبية الجنوبية. يظهر التصميم التجريبي في الشكل 1.

1. الحيوان والأدوات

1. استخدام الفئران سبراغ دولي الذكور 8 أسابيع من العمر وزنها 250 ± 10 غرام.
2. إيواء الفئران لمدة 7 أيام على الأقل قبل الجراحة في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة مع درجة حرارة محيطة تبلغ 25 درجة مئوية ، ورطوبة نسبية تبلغ 65٪، ودورة ضوء داكنة 12/12 ساعة.
3. توفير الغذاء والماء دون حد.
4. إعداد الصكوك (الشكل 2A- ه).

2. حقن الدم في المهور

1. وزن الفئران مرة أخرى قبل 3 أيام من الجراحة لاختيار الفئران مع وزن الجسم مناسبة للتجارب.
2. خلال 3 أيام قبل النمذجة، وتدريب الفئران على المشي على شعاع التوازن 3 مرات في اليوم الواحد لضمان الفئران العادية يمكن أن تمر شعاع التوازن دون توقف.
3. سخني وسادة التدفئة إلى 37 درجة مئوية قبل التخدير.
4. إرفاق ميكرودريل إلى حامل على الإطار ستيريوتاكسيك.
5. حقن الفئران مع 50 ملغ / كغ الكيتامين و 5 ملغ / كغ xylazine intraperitoneally. انتظر حتى لا يكون هناك استجابة إصبع القدم قرصة.
6. نقل الفئران في إطار ستيريوتاكسيك في موقف عرضة. ضع قضبان الأذن فوق قناة الأذن لتأمين الرأس. إصلاح الجمجمة في وضع أفقي لتجنب انحراف الحقن (الشكل 2F).
7. الحفاظ على التخدير بواسطة isoflurane (97.5٪ الأكسجين و 2.5٪ isoflurane) من خلال مخروط الأنف ستيريوتاكسيك مع مدخل ومنفذ الميناء.
8. استخدام مرهم العين للحفاظ على القرنية رطبة.
9. حلق الشعر فوق الجمجمة مع آلة حلاقة صغيرة.
10. رسم خط منتصف 3 سم مع قلم علامة في الجمجمة من خط canthus الجانبية الثنائية إلى 0.5 سم وراء فونتانيل الخلفي، كما هو مبين في الشكل 2F.
11. تطبيق فرك Entoiodine الجراحية بطريقة دائرية، بدءا من منتصف خط منتصف ملحوظ وتناوب إلى الخارج.
12. ضع الستائر الجراحية.
13. إجراء شق مع مشرط على طول خط منتصف ملحوظ.
14. استخدام مسحة القطن لإزالة أي دم محتمل.
15. ضع قطعة من ملقط على كل جانب من رفرف فروة الرأس لفضح الجمجمة(الشكل 2G).
16. تراجع مسحة القطن في 0.9٪ المالحة وإزالة بلطف الأنسجة الضامة من عظم الجمجمة لتجنب الأنسجة الضامة الوقوع في microdrill.
17. وضع علامة على النقطة المركزية لل bregma كنقطة الأصل عبر قلم علامة.
18. إجراء عملية استئصال القحف (1 مم في القطر) باستخدام ميكرودريل في AP-9.0 مم، Lat 0 مم(الشكل 1B والجدول 1). المضي قدما بعناية لأن هذه النقطة قريبة جدا من الجيوب الوريدية (الشكل 2G).
19. إزالة ميكرودريل من الإطار ستيريوتاكسيك.
20. وضع 100 ميكرولتر هاملتون حقنة في حامل stereotaxic (الشكل 2K). بدوره على التبديل مضخة الحقن، انقر فوق زر الاستنشاق السريع، أسبيرات محلول الهيبارين (12500 U المخفف في 100 مل من المالحة) إلى 100 ميكرولتر ومن ثم استنزاف تماما لمنع تخثر الدم بسرعة كبيرة جدا.
21. تطبيق الكلورهيكسيدين و 75٪ فرك الكحول الجراحية إلى الذيل كله من الجذر إلى طرف على الأقل 3 مرات لتطهير الجلد، وتليين قرنية، وتمدد الوريد الذيل لزيادة معدل نجاح الحقن.
22. إرفاق الوخز بالإبر فروة الرأس إلى حقنة 1 مل.
23. أدخل الوخز بالإبر فروة الرأس في الوريد ذيل الجانبي 3 سم من طرف الذيل واتخاذ 150 ميكرولتر من الدم (الشكل 2H).
24. إزالة الوخز بالإبر فروة الرأس من حقنة 1 مل.
25. نقل الدم إلى أنبوب (الشكل 2I).
    ملاحظة: نقل بسرعة لمنع تخثر الدم.
26. غير القفازات الجراحية
27. اختر وضع السحب، تعيين مستوى الصوت إلى 100 ميكرولتر، تعيين السرعة في 200 ميكرولتر / دقيقة، انقر فوق زر RUN، أسبر 100 ميكرولتر من الدم في حقنة هاملتون (الشكل 2J).
28. اختر وضع غرس، وحدد السرعة بسرعة 1 ميكرولتر/دقيقة.
29. تقدم الحقنة حتى يصل الطرف إلى 9.2 مم تحت سطح الدماغ(الشكل 1C والشكل 2L).
30. انقر على زر التشغيل، وحقن أول 10 ميكرولتر من الدم بسرعة 1 ميكرولتر/دقيقة (الجدول 1).
31. أوقف الحقن واترك الحقنة في موضعها لمدة 20 دقيقة لمنع تدفق الدم إلى الفضاء تحت العنكبوتية.
32. اسحب الحقنة حتى يصل الطرف إلى 9.0 مم تحت سطح الدماغ.
33. أعد الحقن بنفس السرعة 1 ميكرولتر/دقيقة حتى يتم حقن الدم المتبقي بالكامل.
34. اترك الحقنة في موضعها لمدة 10 دقائق لتجنب تدفق الدم الخلفي.
35. إزالة الحقنة من الدماغ ببطء.
36. استخدم أسمنت العظام لتغطية ثقب فغر القحف.
37. عندما يجف الاسمنت، خياطة الجرح مع خيوط خياطة البولي أميد 4-0. بعد الخياطة 3 أو 4 stiches، التعادل 2-1-1 عقدة الجراحية القياسية.
38. لمنع العدوى، وحقن الجرذ مع البنسلين (0.25 مل، 80 وحدة IU المخففة في 4 مل المالحة) intraperitoneally.
39. حقن الفئران تحت الجلد مع طرطرات بوتولفانول (2.5 ملغ / كغ) وتكرار الحقن كل 2 ساعة لتخفيف الألم بعد الجراحة حتى 24 ساعة بعد الجراحة.
40. مراقبة الفئران كل 15 دقيقة حتى يتعافى تماما من التخدير. إعادته إلى القفص الأصلي، مع وسادة التدفئة تحت القفص. توفير وصول الفئران مجانا إلى الغذاء والماء حتى التضحية.

3. الاختبارات السلوكية

ملاحظة: إجراء اختبارات سلوكية في اليوم الأول واليوم الثالث واليوم السابع واليوم الرابع عشر بعد النمذجة، بما في ذلك اختبار شعاع التوازن واختبار موضع الطرفين وعصب Voetsch المعدل.

1. اختبار شعاع التوازن¹¹.
   ملاحظة: هذا اختبار خصيصا لفحص وظيفة الحسية الحركية من hindlimb.
   1. أعد الجهاز لضمان أن شعاع (3 سم × 70 سم طويلة) هو 20 سم فوق الأرض.
   2. وضع مربع الظلام في النهاية الخلفية للشعاع مع مدخل ضيق.
   3. ضع مولد ضوضاء أبيض ومصدر ضوء ساطع ، والتي تستخدم لتحفيز الفئران لاجتياز شعاع ودخول مربع الهدف ، في نهاية رأس شعاع.
   4. وقف الضوضاء والضوء عندما يدخل الحيوان مربع الهدف. سجل زمن الوصول من نهاية الرأس إلى مربع الهدف (بالثواني) وأداء الواجهة الخلفية أثناء عبور الشعاع.
   5. تسجيل درجة الأداء على النحو التالي: 0، أرصدة مع موقف ثابت. 1، يمسك الجانب من شعاع. 2، يحتضن شعاع مع 1 hindlimb السقوط؛ 3، يحتضن شعاع مع 2 أطرافه تسقط، أو الغزل حول شعاع لأكثر من 60 ثانية. 4، يحاول تحقيق التوازن على شعاع >40 ق، ولكن يسقط؛ 5، يحاول تحقيق التوازن على شعاع >20 ق، ولكن يسقط؛ و 6، يسقط، مع عدم وجود محاولة لتحقيق التوازن أو التوازن على شعاع <20 s.
2. اختبار وضع الأطراف
   ملاحظة: اختبار وضع الأطراف يفحص 3 محفزات مستقلة للرؤية واللمس والبروبريوبسيبسيون مع 6 معلمات ، لتقييم وظيفة الحسية الحركية للفئران. وتراوحت درجة الوظيفة العصبية الإجمالية بين صفر و12. قبل الاختبار ، يجب أن يكون الفئران معتادا على التعامل معه.
   1. عقد الفئران من الخلف ووضعه على الطاولة ببطء من ارتفاع 10 سم. عادة، فإن الفئران تمتد الأطراف الأمامية ووضعها على الطاولة.
   2. الاستيلاء على الفئران من الخلف والاحتفاظ بها تواجه حافة الجدول. ويلاحظ رد فعل الأطراف الأمامية. الجرذ العادي سيضع الأطراف الأمامية على الطاولة
   3. دع الجرذ يمسك حافة الطاولة يستخدم الجرذ العادي الذقن لمنع شعر الأنف والأنف من لمس حافة الطاولة.
   4. ضع الجرذ على الطاولة ، وادفع الجرذ بضغط الجانبي اللطيف خلف كتف الجرذ نحو حافة الطاولة ، ولاحظ وضع الأطراف الأمامية والأطراف الخلفية. الجرذ العادي سيمسك الحافة بأطرافه الأمامية وأطرافه الخلفية.
   5. ضع الجرذ على الطاولة مع الوجه نحو الحافة ، ودفعه بلطف من الخلف إلى الحافة. الجرذ العادي سيمسك الحافة بأطرافه الأمامية
   6. ضع الجرذ على الطاولة وظهره إلى الحافة وادفعه من الخلف إلى حافة الطاولة. لاحظ رد فعل الأطراف الخلفية. الجرذ العادي سيمسك الحافة بأطرافه الخلفية
   7. تقييم موضع الأطراف الأمامية أو hindlimbs إلى حافة الجدول. سجل الدرجات كما يلي: 0، لا تنسيب؛ 1، لم تنته و / أو تأخر التنسيب؛ 2، على الفور، والتنسيب الكامل.
3. المعدلة Voetsch العصبية⁸
   ملاحظة: المعدلة Voetsch neuroscore هو درجة مقياس vertebrobasilar من القدرة الحسية الحركية، التي تحتوي على 14 المعلمات: حركة الرأس، والنشاط، والسمع، منعكس الألم، منعكس القرنية، proprioception، الإحساس الرقبة، والاستكشاف، والدوران، والإحساس الجذع المحوري، وحركة 4 أطراف، وحركة الأطراف الأمامية، والتسلق، والمشي شعاع. وتتراوح النتيجة لكل معلمة من 0 (العجز العصبي الكامل) إلى 3 (أي عجز عصبي). مجموع درجة الوظيفة العصبية يتراوح من 0 إلى 42.
   1. ضع الجرذ على الطاولة (50 سم × عرضه 35 سم) والسماح له بالتحرك لمدة خمس دقائق. مراقبة الحركة العفوية لرأسه: يتحرك في جميع الأبعاد، 3؛ يفضل جانب واحد، 2؛ حركة فقط إلى جانب واحد، 1؛ استعرض إلى جانب أحادي، 0.
   2. ضع الجرذ على الطاولة (50 سم × عرضه 35 سم) والسماح له بالتحرك لمدة خمس دقائق. ويعرف النشاط بأنه: الاستجابة الكاملة، 3؛ و 3؛ و 3؛ و 3؛ و 3؛ و 3؛ و 3؛ و استجابة معتدلة، 2؛ استجابة الحد الأدنى، 1؛ غيبوبة، 0.
   3. مراقبة الدوران القحفي: يتحول ثنائيا، 3؛ يفضل الجانب 1، 2؛ فقط إلى جانب واحد، 1؛ سقط إلى جانب واحد، 0.
   4. تقييم حركة الأطراف الأمامية: حركة متساوية وثنائية، 3؛ عدم تناسق طفيف، 2؛ عدم التماثل الكبير، 1؛ لغة ال paresis، 0.
   5. تقييم حركة الأطراف 4: حركة متساوية وثنائية، 3؛ عدم تناسق طفيف، 2؛ عدم التماثل الكبير، 1؛ لغة ال paresis، 0.
   6. عندما يكون الجرذ ثابتا ، قم بإجراء قرصة أذن لتحفيز اليوريكلز واختبار منعكس الألم: يتحرك بعيدا بسرعة وتناسقا عن التحفيز ، 3 ؛ يتحرك بعيدا ببطء أو غير متماثل من التحفيز, 2; يظهر بعض الحركة استجابة للألم، 1؛ لا رد فعل، 0.
   7. عندما يكون الجرذ ثابتا ، قم بعمل ضوضاء على جانبي جسم الجرذ لاختبار السمع: فرك الأصابع ، 3 ؛ المفاجئة من الأصابع، 2؛ التصفيق بصوت عال، 1 وليس مذهلا، 0.
   8. للتحقق من proprioception، لمس vibrissae الجرذ على كلا الجانبين على التوالي مع عصا حادة ومراقبة استجابتها للتحفيز: رد فعل على اتصال، 3؛ تقلص رد الفعل على جانب واحد، 2؛ تضاءلت على كلا الجانبين، 1؛ غائب، 0.
   9. لتقييم الإحساس المحوري للجذع ، ضع عصا حادة على جانبي جسم الجرذ ولاحظ استجابته للتحفيز: رد فعل سريع ومتناظر للمحفزات ، 3 ؛ رد فعل متضائل قليلا أو غير متماثل، 2؛ تقلصت إلى حد كبير وردود الفعل غير المتماثلة، 1 وليس رد فعل، 0.
   10. لاختبار منعكس القرنية، عقد الجرذ ولمس القرنية بسرعة على كلا الجانبين مع مسحة القطن: كلتا العينين إغلاق بسرعة، 3. منعكسة متضائلة على جانب واحد، 2؛ تضاءلت على كلا الجانبين، 1؛ غائب، 0.
   11. للتحقق من الإحساس من الرقبة، عقد الجرذ واستخدام عصا حادة للمس الرقبة: يتفاعل للمس بنشاط، 3. رد فعل بطيء للمس، 2؛ تقلصت كثيرا رد الفعل, 1; لا رد فعل، 0.
   12. لمراقبة الاستكشاف، استخدم صندوقا داكنا فاتحا.
       ملاحظة: يجب أن يكون ثلثي المربع مفتوحا ومضاءا، بينما يتم تغطية باقي المربع ومظلم. باب 7 سم يربط بين المقصورتين.
   13. ضع الجرذ في حجرة الضوء لمدة 5 دقائق ثم المقصورة المظلمة لمدة 5 دقائق أخرى ، والسماح لها بالتحرك وتسجيل أنشطة الجرذ. عندما يتم وضع 4 أطراف في غرفة واحدة، سجل كمدخل. تسجيل الدرجات على النحو التالي: تصل إلى مقصورات الضوء والظلام بنشاط، 3؛ تصل إلى 1 مقصورة، 2؛ يتحرك ببطء فقط بعد التحفيز، 1؛ ولا حركة، 0.
   14. للتحقق من قدرة التسلق، ضع الجرذ في الجزء السفلي من 20 سم، 70 سم طائرة طويلة مع زاوية 30 درجة إلى الأرض الأفقية. سجل عشرات على النحو التالي : قادرة على الصعود إلى أعلى ، 3 ؛ ضعف التسلق، 2؛ قبضة ثابتة، 1؛ ويسقط فورا، 0
   15. لفحص المشي شعاع، ووضع الفئران على نهاية واحدة من شعاع 3 سم واسعة، 70 سم طويلة وهو 20 سم فوق سطح الأرض، وسجل عشرات على النحو التالي: يستكشف شعاع كامل، 3؛ يستكشف جزءا من شعاع، 2؛ بعض الحركة والسقوط، 1؛ لا حركة، 0.
   16. حساب النقاط.

4. تأكيد نزيف عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي

1. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في 24 ساعة بعد الجراحة.
2. تخدير الفئران مع ايزوفلوران (5٪ للتحريض، 1٪- 1.5٪ للصيانة).
3. تأمين رأس الجرذ في لفائف صفيف الدماغ الفئران جنبا إلى جنب مع لفائف حجم الإرسال فقط.
4. ضع الملف مع الجرذ في الماسح الضوئي للتصوير بالرنين المغناطيسي. تأمين الفئران داخل المهد عن طريق قضبان الأسنان والأذن.
5. استخدم سترة حرارية مغلقة للحفاظ على درجة حرارة جسم الجرذ عند 37 ± 0.5 درجة مئوية أثناء التصوير بالرنين المغناطيسي.
6. تنفيذ تسلسل تجريبي لضمان الهندسة الصحيحة.
7. تطبيق تسلسل صدى سريع الدوران لجمع الاشعة T2 المرجحة. تعيين المعلمات كما يلي: وقت الصدى (TE)، 132 مللي ثانية؛ وقت التكرار (TR)، 2500 مللي ثانية؛ مصفوفة الاستحواذ، 148 × 148؛ مجال الرؤية، 100 مم × 100 مم؛ 12 شريحة؛ سمكها 1.5 مم.
8. أعد الجرذ إلى القفص

5. تأكيد نزيف عن طريق التشريح الإجمالي

ملاحظة: التضحية الفئران في نقطة زمنية معينة، 24 ح و 14 د بعد الجراحة (الشكل 1D).

1. تخدير الفئران مع 5٪ isoflurane حتى فقدان الوعي. ثم، القتل الرحيم مع ثاني أكسيد الكربون (CO₂) (20-30٪ من حجم القفص في الدقيقة الواحدة).
2. تأكد من الوفاة باستخدام العلامات التالية: لا ارتفاع في الصدر وهبوط ، ولا نبضات قلب واضحة ، ولا استجابة لقرصة إصبع القدم ، أو لون الغشاء المخاطي الفقير ، أو تغيير اللون ، أو التعتيم في العينين.
3. إجراء خلع عنق الرحم.
4. تأمين الفئران عن طريق تسجيل الكفوف على منصة معقمة. إنشاء شق خط الوسط من عنق الرحم لفضح نقص الوذم إلى الصدر والكبد. إجراء شق الجانبي من الهامش القصي العلوي على طول الترقوة إلى أقصى اليسار وقطع الجانبية آخر من xiphoid على طول الحجاب الحاجز إلى أقصى اليسار، لفضح القلب. رفع رفرف القفص الصدري وإصلاحه إلى المنصة مع دبوس.
5. قم بتوصيل نهاية الإبرة (27 جم) بمضخة تغلغل تحتوي على 4 درجات مئوية ملحية. تقدم طرف الإبرة إلى القلب على طول الحافة اليسرى من البطين الأيسر لتجنب دخول الأذين. قم بتشغيل مضخة النفخ لضمان وجود الطرف في البطين الأيسر ، ثم قم بقطع الأذين الأيمن.
6. إيقاف مضخة النفخ عندما السائل استنزفت من الأذين الأيمن يتحول عديم اللون والكبد يتحول الأبيض. يحتاج هذا الإجراء إلى ما يقرب من 100 مل 4 درجة مئوية من المحلول الملحي.
7. قطع رأس الجرذ وحصاد الدماغ كله باستخدام مقص والمملقط. إزالة أي رطوبة من سطح الدماغ مع ورقة النشاف.
8. إبقاء الدماغ كله في -80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
   ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كان يمكن قطع الدماغ دون تجميد.
9. وضع الدماغ في مصفوفة الدماغ الفئران التاجية مع الجانب الظهري حتى.
10. أدخل شفرة سميكة من الفولاذ المقاوم للصدأ 0.21 ملم في مركز النزيف وفقا للثقب في سطح الدماغ.
11. أدخل شفرات أخرى في الدماغ على فاصل زمني من 2 ملم.
12. تزج أقسام الدماغ في 10 مل من محلول paraformaldehyde 4٪ (PFA) لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية. شطف لهم مع 0.01 مليمول / لتر فوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS).
13. تنظيم المقاطع من rostral إلى caudal وصورة لهم.

6. قسم البارافين والهيماتوكسيلين واليوسين (HE) تلطيخ

1. إصلاح الدماغ مع 4٪ PFA الحل لمدة 24 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. حجم PFA يجب أن يكون 5-10 مرات من حجم الدماغ.
2. قطع الدماغ من مركز النزيف إلى قطعتين عن طريق مصفوفة دماغ شفرة والجرذان التاجية.
3. جعل كتل الأنسجة المضمنة البارافين.
4. قسم الأنسجة المضمنة البارافين كتلة تاجي في الشرائح سمك 40 ميكرومتر على microtome، وقطع 4 أقسام على التوالي، بدءا من مركز النزيف، وتعويمها في حمام مائي 40 درجة مئوية.
5. قم بتركيب أقسام 40 ميكرومتر (8 شرائح في المجموع لدماغ واحد) على شرائح زجاجية نظيفة والهواء الجاف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
6. خبز الشرائح في 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
7. يغسل لمدة 3 دقائق في إكسيلين، 3 مرات.
8. تراجع أقسام 30 مرة في الإيثانول 100٪، 30 مرات أخرى في الإيثانول 100٪، 30 مرة في الإيثانول 95٪، و 30 مرة أخرى في الإيثانول 95٪.
9. شطف في ماء الصنبور حتى واضحة.
10. تزج المقاطع في هيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق.
11. شطف في ماء الصنبور حتى واضحة.
12. تزج أقسام في وصمة عار إيوزين لمدة 30 s.
13. الشرائح المجففة مع 3-4 الانخفاضات 95٪ الإيثانول، 3-4 الانخفاضات في الإيثانول 100٪، 100٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة، و 10 الانخفاضات في الإيثانول 100٪ + xylene (1:1).
14. تنظيف المقاطع مع xylene لمدة 1 دقيقة، 2 مرات.
15. جبل باستخدام غير مائي تصاعد المتوسطة وأغطية.
16. جفف الأقسام في الهواء بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسلها.

7. الإحصاءات

1. استخدم GraphPad Prism 6.0 لحساب اختبار الطالب t أو اختبار Mann Whitney U.
   ملاحظة: يجب التعبير عن كافة البيانات على أنها متوسط ± SE. يتم تحديد الاختلافات بين مجموعتين باختبار t-test للطالب ذو ذيلين أو اختبار Mann Whitney U. P<0.05 يعرف بأنه أهمية إحصائية.

النتائج

واستخدم ما مجموعه 25 حيوانا، منها 3 للسيطرة، و6 ل 30 ميكرولتر، و6 ل 60 ميكرولتر، و10 لحقن دم 100 ميكرولتر. توفي أحد الفئران التي تلقت حقن 100 ميكرولتر من الدم الذاتي (1/10) في غضون 24 ساعة بعد الجراحة.

أجريت اختبارات سلوكية في اليوم الأول واليوم الثالث ...

Discussion

في هذه الدراسة، قدمنا بروتوكولا لتوليد نموذج فئران نزيف بونتين ضخمة. ويمكن استخدام هذا النموذج للبحث في آلية المرضية والتكهن بنزيف بونتين ضخمة.

وطوال التجربة، استخدم 25 فأرا، توفي منها جرذ واحد فقط. وقد أشار التحقق من التصوير بالرنين المغناطيسي، والتشريح الإجمالي، وتلطيخ HE...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100ml Saline solution	Guangdong yixiang	191222201 C1	Preparing heparin diluent
100μl Microinjector	Shanghai Gaoge		Injection of autologous blood
1ml Syringe	Jiangsu Zhiyu	20191014	Withdraw autologous blood from the tail vein
75% Alcohol	Shandong Lierkang		Disinfection of rat tail
Adhesive tape	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Animal anesthesia system	RWD	R510-31S-6	Inducing and maintaining anesthesia
Balance beam	Jiangsu Saiangsi		For neurological deficit scores
Blades	Shanghai Feiying	74-C	For gross anatomy
Bone cement	Shanghai Xinshiji	20180306	Surgicl instruments
Brain tank	Shenzhen LEIYEA		For gross anatomy
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		For pain management
Electric cranial drill	Nanjing  Darwin biotechnology	20180090018	Making a burr hole on the skull
EP tube	Nantong Surui		Transfer autologous blood
Erythromycin eye cream	Yunnan pharmacy		Eyes protection
HE dye liquor	Solarbio	G1120	For HE staining
Heating pad	Dangerous Jungle	JR01	Keeping warm
Heparin sodium injection	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	Preparing heparin diluent
IndoPhors	Guoyao of China		Sterilization
Isoflurane	RWD	20080701	Inducing and maintaining anesthesia
Light dark box	Jiangsu Saiangsi		For neurological deficit scores
Micro-injection pump	Baoding Leifu	TFD03-01-C	Injection of autologous blood
MRI system	Philips		Confirmation of infarction in vivo
Needle holder	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Q-tips	Jiangxi Songhe		Surgicl instruments
Scalp heedle	Jiangxi Hongda	20200313	Withdraw autologous blood from the tail vein
Scalpel	Shanghai Kaiyuan	170902	Surgicl instruments
Shearing scissors	Shanghai Jinzhong	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus	RWD	900-00001-00	for surgical positioning
Surgical towel	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Surgicl instruments
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Suture scissors	Shanghai Jinzhong	J25041	Surgicl instruments
Tissue holding forcepts	Shanghai Jinzhong	J31080	Surgicl instruments