大量庞廷出血通过双注射自体血

摘要

我们提出了一个协议，通过双注射自体血液，在老鼠中建立一个巨大的庞然大河出血模型。

摘要

我们提供一个协议，在老鼠中建立一个巨大的庞然大河出血模型。这项研究使用了重约250克的老鼠。一百微升的自体血从尾静脉中取出，立体有毒地注射到庞斯中。注射过程分为两个步骤:首先，将10μL的血液注射到特定位置，前柱位置（AP）-9.0毫米:横向（拉特） 0 毫米:垂直（垂直）-9.2毫米，然后第二次注射位于AP-9.0毫米的残余血液;拉特 0 毫米;垂直 -9.0 毫米，间隔 20 分钟。平衡束测试、肢体放置测试和修改后的 Voestch 神经分数用于评估神经功能。磁共振成像 （MRI） 用于评估体内出血量。这种模型的症状与大量庞汀出血患者一致。

引言

脑内出血占中风患者的五分之一。脑内出血的预后取决于出血的速度、体积和位置^。与前脑出血相比，脑干出血具有较高的死亡率和发病率^3。大约40%的脑部出血发生在第4个庞氏^菌中。庞汀出血的病因学和病理生理学与前脑出血⁵大出血有很大不同，研究较少。

有两种庞丁出血动物模型。一种是自发出血模型，由注入细菌拼贴酶在庞^6，7，8诱发。这种模式的最大优点是出血是自发的。然而，拼贴酶只能诱发少量的庞丁出血。此外，拼贴酶可能会导致大脑的其他伤害。另一种模型是由自体血液的立体定向注射^引起的。这种模式的优点是，它很容易掌握与高成功率。从理论上讲，研究人员可以将任何血量注入庞然大雅的任何位置。但是，由于通过针线的回漏，注射量有限。最近，双注法已推广，以减少回漏^9。这种方法注射两次自体血，注射间隔为20分钟。双注射法用于诱发轻度 （30 μL） 和中度 （60 μL） 庞廷出血，但不诱发大规模庞然大意出血。在诊所里，大多数预后不佳的庞廷出血患者有大出血（超过10毫升）。

在以前的研究中，我们提供了一个协议，以建立一个庞廷缺血中风模型大鼠^10。在这项研究中，我们修改了现有的双注射方法，并提供了一个详细的协议，通过在庞氏两个不同位置的100μL自体血的双重注射，诱导大鼠大量庞然大物出血。

研究方案

该议定书经广州医科大学第二附属医院动物护理与使用委员会审查批准。老鼠是由南方医科大学动物中心提供的。实验设计见图1。

1. 动物和仪器

1. 使用8周大的雄性斯普拉格-道利大鼠，体重250±10克。
2. 在环境温度为 25 °C、相对湿度为 65% 和 12/12h 的光暗循环下，在受控环境条件下将大鼠安置至少 7 天。
3. 无限制地提供食物和水。
4. 准备仪器（图2A-E）。

2. 将血液注射到庞斯

1. 手术前3天再次称重大鼠，选择体重合适的大鼠进行实验。
2. 在建模前的3天里，训练老鼠每天在平衡梁上行走3次，以确保正常大鼠能够不停顿地通过平衡梁。
3. 麻醉前将加热垫预热至37°C。
4. 将微钻连接到立体氧化框架上的支架上。
5. 给大鼠注射50毫克/千克氯胺酮和5毫克/千克西拉辛内皮。等到没有脚趾捏反应。
6. 将鼠在易发生位置的立体氧化框架中传输。将耳塞放在耳道上方，以确保头部安全。将头骨固定在水平位置，以避免注射偏斜（图 2F）。
7. 通过带入口和出口端口的立体氧化鼻锥通过异氟烷（97.5%氧气和2.5%异氟兰）维持麻醉。
8. 使用眼药膏保持角膜湿润。
9. 用微剃须刀剃掉头骨上方的头发。
10. 绘制一个3厘米的中线，在头骨的标记笔从双边横向坎图斯线到0.5厘米后方的字体，如 图2F所示。
11. 以圆形方式应用 Entoiodine 手术磨砂，从标记的中线中间开始，向外旋转。
12. 放置手术窗帘。
13. 沿着标记的中线用手术刀切开。
14. 使用棉签去除任何潜在的血液。
15. 在头皮瓣的每一侧放置一块钳子，以暴露头骨（图2G）。
16. 将棉签浸入 0.9% 盐水中，轻轻取出头骨上的结缔组织，以避免结缔组织陷入微钻。
17. 通过记号笔标记布雷格马的中心点作为原点。
18. 使用 AP-9.0 mm、Lat 0 mm（图 1B和表 1）的微钻进行颅骨切除术（直径为 1毫米）。仔细进行，因为这一点是非常接近静脉鼻窦（图2G）。
19. 从立体声轴框架中取出微钻。
20. 将 100 μL 汉密尔顿注射器放入立体声盒 （图2K）中。打开注射泵开关，单击 快速吸入 按钮，将肝素溶液（100 mL 盐水稀释的 12500 U）吸气至 100 μL，然后将其完全排干，以防止血液凝固过快。
21. 将氯西丁和75%酒精手术磨砂从根部涂抹到整个尾部至少3次，对皮肤进行消毒，软化角质，扩张尾静脉，提高注射成功率。
22. 将头皮针灸连接到 1 mL 注射器上。
23. 将头皮针灸插入从尾尖3厘米处的横向尾静脉，并取出150微L的血液（图2H）。
24. 从 1 mL 注射器中取出头皮针灸。
25. 将血液转移到管子里（图2I）。
    注意:快速转移以防止血液凝固。
26. 换手术手套
27. 选择 退出 模式，将音量设置为 100 μL，将速度设置为 200 μL/min，单击 RUN 按钮，将 100 μL 的血液吸进汉密尔顿注射器（图 2J）。
28. 选择 注入 模式，将速度设置为 1 μL/分钟。
29. 推进注射器，直到尖端达到大脑表面以下9.2毫米（图1C和图2L）。
30. 单击 "运行" 按钮，以 1μL/min（表 1 ）的速度注入前10μL 血液。
31. 停止注射，将注射器留在位20分钟，以防止血液流入亚拉赫诺德空间。
32. 收回注射器，直到尖端到达大脑表面以下9.0毫米。
33. 以 1μL/min 的相同速度重新启动注射，直到完全注射残余血液。
34. 将注射器留在原位10分钟，以避免血液回流。
35. 慢慢地从大脑中取出注射器。
36. 使用骨水泥覆盖颅骨切除孔。
37. 当水泥干燥时，用4-0聚酰胺缝合丝缝合伤口。缝制3或4个刺后，打2-1-1标准手术结。
38. 为防止感染，在内皮注射青霉素（0.25 mL，80 IU稀释在4mL盐水）。
39. 给大鼠注射皮下酸酸盐（2.5毫克/千克），每2小时重复注射一次，以缓解术后疼痛，直到手术后24小时。
40. 观察老鼠每15分钟，直到它完全从麻醉中恢复过来。将其返回到原始的笼子，笼子下方有一个加热垫。为老鼠提供免费食物和水，直到牺牲。

3. 行为测试

注意:在建模后的第 1 天、第 3 天、第 7 天和第 14 天进行行为测试，包括平衡束测试、肢体放置测试和修改后的 Voetsch 神经分数测试。

1. 平衡梁测试¹¹.
   注意:这是专门检查后肢感官运动功能的测试。
   1. 准备仪器，以确保梁（3厘米宽×70厘米长）是20厘米以上的地板。
   2. 在横梁的后端放一个深色的盒子，入口处很窄。
   3. 放置一个白噪声发生器和一个明亮的光源，用于激励老鼠穿过光束，进入目标框，在光束的头部端。
   4. 当动物进入目标框时，停止噪音和光线。记录从头端到球门框的延迟（在几秒钟内）和后肢在穿过横梁时的性能。
   5. 将绩效分数记录如下:0、以稳定的姿势平衡:1、握梁侧:2、紧贴横梁，1个后肢脱落:3、紧贴横梁，2个四肢脱落，或绕梁旋转60多s:4、试图在梁上平衡>40s，但脱落:5、试图在梁上平衡>20s，但脱落:和6，脱落，没有试图在梁上平衡或平衡<20s。
2. 肢体放置测试
   注:肢体放置测试用6个参数检查了3个独立的视觉、触摸和自我感觉刺激，以评估大鼠的感官运动功能。神经功能总分从0到12不等。在测试之前，老鼠应该习惯处理。
   1. 把老鼠抱在后面，从10厘米高的地方慢慢放在桌子上。通常，老鼠会伸展前肢，放在桌子上。
   2. 抓住老鼠的背部，并举行它面对桌子的边缘。观察前肢的反应。一只普通的老鼠会把前肢放在桌子上。
   3. 让老鼠抓住桌子的边缘。普通大鼠会用下巴防止鼻子和鼻毛接触桌子边缘。
   4. 将大鼠放在桌子上，用温和的横向压力将大鼠推向桌子边缘，并观察前肢和后肢的位置。一只普通的老鼠会用前肢和后肢抓住边缘。
   5. 将鼠放在桌子上，将脸朝向边缘，然后轻轻地将其从后面推到边缘。一只普通的老鼠会用它的前肢抓住边缘。
   6. 将鼠放在桌子上，背靠边缘，从后面推到桌子边上。观察后肢的反应。一只普通的老鼠会用后肢抓住边缘。
   7. 评估前肢或后肢放置到表边缘。记录分数如下:0，无放置:1、未完成和/或延迟安置:2、立即、完整放置。
3. 修改后的沃茨神经分数⁸
   注:修改后的Voetsch神经分数是感官运动能力的椎骨杆菌比例评分，包含14个参数:头部运动、活动、听力、疼痛反射、角膜反射、自我感觉、颈部感觉、探索、盘旋、轴向躯干感、4肢运动、前肢运动、攀爬和横梁行走。每个参数的分数范围从 0（完全神经缺陷）到 3（无神经缺陷）。神经功能总分从 0 到 42 不等。
   1. 将老鼠放在桌子上（50厘米长，35厘米宽）×，让它四处走动5分钟。观察其头部的自发运动:在各个维度上移动，3:喜欢一边，2:只运动到一边，1:弯曲到单边一方，0。
   2. 将老鼠放在桌子上（50厘米长，35厘米宽）×，让它四处走动5分钟。活动定义为:完全响应，3:反应适度，2:反应最少，1:昏迷，0。
   3. 观察颅骨环:双边转弯，3:喜欢1面，2面:只到1面，1面:下降到1侧，0。
   4. 评估前肢运动:平等和双边运动，3:轻微不对称，2:伟大的不对称，1:帕雷西斯， 0 。
   5. 评价四肢运动:平等和双边运动，3:轻微不对称，2:伟大的不对称，1:帕雷西斯， 0 。
   6. 当大鼠静止时，执行耳捏以刺激尿道并测试疼痛反射:快速对称地远离刺激，3:缓慢或不对称地从刺激中移开，2:显示一些运动，以回应疼痛，1:没有反应，0。
   7. 当大鼠静止时，在老鼠身体的两侧发出噪音以测试听力:手指摩擦，3:手指的捕捉，2:响亮的鼓掌，1和没有惊人的，0。
   8. 要检查自感性，用钝棒分别触摸老鼠的两侧振动，观察其对刺激的反应:触摸反应，3:一方面反应减弱，2:减少双方，1:缺席，0。
   9. 要评估躯干轴向感觉，在大鼠身体的两侧放置一根钝棒，观察其对刺激的反应:对刺激的轻快和对称反应，3:轻微减少或不对称反应，2:大大减少和不对称的反应，1和没有反应，0。
   10. 要测试角膜反射，抓住大鼠，用棉签快速触摸两侧的角膜:双眼快速闭合，3:一侧反射减少，2:减少双方，1:缺席，0。
   11. 要检查颈部的感觉，握住大鼠，用钝棒触摸颈部:主动触摸反应，3:触摸反应缓慢，2:反应大大减少，1:没有反应，0。
   12. 要观察探索，请使用浅暗框。
       注意:三分之二的盒子应该打开并点亮，而其余的盒子则被覆盖和黑暗。一扇7厘米的门连接着两个隔间。
   13. 将鼠放在灯舱中5分钟，然后在暗隔间再放置5分钟，让它四处走动并记录老鼠的活动。当4个四肢被放置在一个房间，记录它作为一个入口。记录分数如下:主动到达光暗隔间，3:达到1个隔间，2个:只有在刺激后才会缓慢移动，1:没有运动，0。
   14. 为了检查爬升能力，将鼠放在一个20厘米宽，70厘米长的平面底部，以30度角到水平地面。记录分数如下:能够爬到顶部，3:有损攀岩，2:固定握把，1:并立即下降，0。
   15. 要检查光束行走情况，将鼠放在一个3厘米宽、70厘米长的横梁的一端，该光束距地面20厘米，记录分数如下:探索整个光束，3:探索光束的一部分，2:一些运动和下降，1:没有运动，0。
   16. 计算点。

4. MRI 确认出血

1. 手术后24小时进行核磁共振扫描。
2. 用异氟兰麻醉大鼠（5%用于感应，1%-1.5%用于维护）。
3. 将大鼠的头部固定在大鼠大脑阵列线圈中，并结合仅传输体积线圈。
4. 将线圈与大鼠一起放在 MRI 扫描仪中。通过牙齿和耳栏将老鼠固定在摇篮内。
5. 在 MRI 扫描期间，使用闭路热夹克将大鼠的体温保持在 37 ± 0.5 °C。
6. 执行试点序列，以确保正确的几何形状。
7. 应用快速旋转回声序列来收集 T2 加权扫描。将参数设置如下:回声时间（TE），132毫秒:重复时间（TR），2，500毫秒;收购矩阵，148×148;视场，100毫米×100毫米:12 片;1.5 毫米厚。
8. 把老鼠送回笼子里

5. 毛解剖确认出血

注:在手术后24小时和14分的指定时间点牺牲大鼠（图1D）。

1. 用5%的异氟烷麻醉大鼠，直到失去知觉。然后，用二氧化碳_（CO2）（每分钟20-30%的笼子体积）安乐死它。
2. 使用以下迹象确认死亡:没有胸部上升和下降，没有明显的心跳，没有反应脚趾捏，粘膜颜色差，颜色变化，或眼睛不透明。
3. 执行颈椎脱位。
4. 通过在无菌平台上用爪子绑住老鼠来保护老鼠的安全。从子宫颈创建一个中线切口，使下气囊暴露在胸腔和肝脏中。从上侧骨边缘沿锁骨到最左边，从隔膜沿西波德到最左边的另一个横向切口，露出心脏。提起肋骨皮瓣，用销子固定到平台上。
5. 将针头末端 （27 G） 连接到含有 4 °C 盐水的灌注泵。沿着左心室的左边缘将针尖推进到心脏，以避免进入中庭。打开灌注泵，确保尖端位于左心室，然后在右中庭进行切割。
6. 当从右中庭排出的液体变成无色，肝脏变白时，关闭灌注泵。此过程需要大约 100 mL 4 °C 盐水。
7. 用剪刀和钳子斩首老鼠，收获整个大脑。用印迹纸去除大脑表面的任何水分。
8. 将整个大脑保持在-80°C 1分钟。
   注意:如果大脑可以不冻结地被切割，这一步可以跳过。
9. 将大脑放入冠状大鼠大脑矩阵中，由后部侧向上放置。
10. 根据大脑表面的孔，将一个 0.21 毫米厚的不锈钢刀片插入出血中心。
11. 每隔2毫米插入其他刀片到大脑中。
12. 在 4 °C 下将大脑部分浸入 10 mL 的 4% 副甲醛 （PFA） 溶液中，24 小时。 用 0.01 mmol/L 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗它们。
13. 组织从罗斯特拉尔到考达尔的部分，并将其映像。

6. 石蜡部分和血氧林和欧辛 （HE） 染色

1. 在室温下用 4% PFA 溶液修复大脑至少 24 小时。PFA的体积应该是大脑体积的5-10倍。
2. 通过刀片和冠状大鼠脑基将出血中心的大脑切成两块。
3. 制作石蜡嵌入式组织块。
4. 将石蜡嵌入的组织块以 40μm 厚度在微原子上滑动，从出血中心开始连续切割 4 个部分，并将它们漂浮在 40 °C 的水浴中。
5. 将 40 μm 部分（一个大脑总共 8 个滑梯）安装到干净的玻璃滑梯上，并在室温下通宵干燥。
6. 在 56 °C 下烘烤幻灯片 1 小时。
7. 用二甲苯洗3分钟，3次。
8. 在100%乙醇中浸渍30次，在100%乙醇中浸渍30次，在95%乙醇中浸渍30次，在95%乙醇中浸渍30次以上。
9. 在自来水中冲洗，直到清除。
10. 将赫马托西林的部分浸入约 10 分钟。
11. 在自来水中冲洗，直到清除。
12. 浸入欧辛污渍30s的部分。
13. 脱水滑梯与 3-4 浸 95% 乙醇， 3-4 浸在 100% 乙醇， 100% 乙醇 1 分钟， 10 下降 100% 乙醇 + 二甲苯 （1:1）.
14. 用二甲苯清洁部分1分钟，2次。
15. 使用非液态安装介质和盖滑安装。
16. 在室温下在空气中干燥部分过夜，然后将其擦干。

7. 统计

1. 使用图形板棱镜 6.0 来计算学生的 t 测试或曼恩惠特尼 U 测试。
   注:所有数据应表示为平均± SE。两组之间的差异由双尾学生 t 测试或曼恩惠特尼 U 测试确定。P<0.05 定义为统计意义。

结果

共使用25只动物，3只用于控制，6只用于30μL，6只用于60μL，10只用于100μL血液注射。一只接受100μL注射自体血（1/10）的老鼠在手术后24小时内死亡。

手术后在第1天、第3天、第7天和第14天进行行为测试。手术后不同时间点对照组和注射血组的分数在表2中显示。庞丁出血导致神经缺陷，如角膜反射和盘旋（

讨论

在本研究中，我们提供了一个协议，以产生一个巨大的庞然大海大鼠模型。该模型可用于研究大庞丁出血的病理生理机理和预后。

在整个实验中，使用了25只老鼠，其中只有一只死亡。对MRI、毛解剖和 HE 染色的验证表明，该方法的死亡率非常低，成功率很高。要建立大规模的庞然大物出血模型，必须解决两个问题，注射的自体血液往往泄漏到亚拉氏体空间，并沿着针道流回?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100ml Saline solution	Guangdong yixiang	191222201 C1	Preparing heparin diluent
100μl Microinjector	Shanghai Gaoge		Injection of autologous blood
1ml Syringe	Jiangsu Zhiyu	20191014	Withdraw autologous blood from the tail vein
75% Alcohol	Shandong Lierkang		Disinfection of rat tail
Adhesive tape	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Animal anesthesia system	RWD	R510-31S-6	Inducing and maintaining anesthesia
Balance beam	Jiangsu Saiangsi		For neurological deficit scores
Blades	Shanghai Feiying	74-C	For gross anatomy
Bone cement	Shanghai Xinshiji	20180306	Surgicl instruments
Brain tank	Shenzhen LEIYEA		For gross anatomy
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		For pain management
Electric cranial drill	Nanjing  Darwin biotechnology	20180090018	Making a burr hole on the skull
EP tube	Nantong Surui		Transfer autologous blood
Erythromycin eye cream	Yunnan pharmacy		Eyes protection
HE dye liquor	Solarbio	G1120	For HE staining
Heating pad	Dangerous Jungle	JR01	Keeping warm
Heparin sodium injection	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	Preparing heparin diluent
IndoPhors	Guoyao of China		Sterilization
Isoflurane	RWD	20080701	Inducing and maintaining anesthesia
Light dark box	Jiangsu Saiangsi		For neurological deficit scores
Micro-injection pump	Baoding Leifu	TFD03-01-C	Injection of autologous blood
MRI system	Philips		Confirmation of infarction in vivo
Needle holder	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Q-tips	Jiangxi Songhe		Surgicl instruments
Scalp heedle	Jiangxi Hongda	20200313	Withdraw autologous blood from the tail vein
Scalpel	Shanghai Kaiyuan	170902	Surgicl instruments
Shearing scissors	Shanghai Jinzhong	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus	RWD	900-00001-00	for surgical positioning
Surgical towel	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Surgicl instruments
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Suture scissors	Shanghai Jinzhong	J25041	Surgicl instruments
Tissue holding forcepts	Shanghai Jinzhong	J31080	Surgicl instruments