Hemorragia pontina maciça por dupla injeção de sangue autólogo

Resumo

Apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo maciço de hemorragia pontina em um rato através de dupla injeção de sangue autólogo.

Resumo

Nós fornecemos um protocolo para estabelecer um modelo maciço de hemorragia pontina em um rato. Foram utilizados neste estudo ratos com cerca de 250 gramas. Cem microliters de sangue autólogo foram retirados da veia da cauda e estereotipados injetados nos pons. O processo de injeção foi dividido em 2 etapas: Primeiro, 10 μL de sangue foi injetado em um local específico, posição anteroposterior (AP) -9,0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9,2 mm, seguida de uma segunda injeção do sangue residual localizado em AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm com um intervalo de 20 minutos. O teste do feixe de equilíbrio, o teste de colocação dos membros e o neuroscore Voestch modificado foram utilizados para avaliar a função neurológica. A Ressonância Magnética (RM) foi utilizada para avaliar o volume de hemorragia in vivo. Os sintomas deste modelo estavam em consonância com pacientes com hemorragia pontina maciça.

Introdução

Hemorragia intracerebral é responsável por um quinto dos pacientes com AVC. O prognóstico da hemorragia intracerebral depende da velocidade, volume e localização do sangramento^1,2. Em comparação com a hemorragia do cérebro, a hemorragia cerebral tem maior mortalidade e morbidade³. Cerca de 40% da hemorragia cerebral ocorre nos pons⁴. A etiologia e a fisiopatologia da hemorragia pontina são bem diferentes e menos estudadas do que a hemorragia do antebraína⁵.

Há dois tipos de modelos animais de hemorragia pontina. Um deles é o modelo de hemorragia espontânea induzido pela infusão de colagem bacteriana nos pons^6,7,8. A maior vantagem deste modelo é que o sangramento é espontâneo. No entanto, a colagemnase só pode induzir um pequeno volume de hemorragia pontina. Além disso, a colagem pode causar outras lesões no cérebro. O outro modelo é induzido pela injeção estereotática de sangue autólogo no pons⁹. A vantagem deste modelo é que é fácil dominar com uma alta taxa de sucesso. Teoricamente, os pesquisadores poderiam injetar qualquer volume de sangue em qualquer local de pons. No entanto, devido ao vazamento de volta através da rota da agulha, o volume injetado é limitado. Recentemente, o método de dupla injeção foi promovido para reduzir o vazamento de volta⁹. Este método injeta sangue autólogo duas vezes com um intervalo de 20 minutos entre as injeções. O método de dupla injeção é aplicado para induzir hemorragia pontina leve (30 μL) e moderada (60 μL), mas não hemorragia pontina maciça. Na clínica, a maioria dos pacientes com hemorragia pontina com prognóstico ruim tem hemorragia maciça (mais de 10 mL).

No estudo anterior, fornecemos um protocolo para estabelecer um modelo de derrame isquêmico pontino no rato¹⁰. Neste estudo, modificamos o método de dupla injeção existente, e fornecemos um protocolo detalhado para induzir hemorragia pontina maciça em um rato por injeção dupla de 100 μL de sangue autólogo em dois locais diferentes nos pons.

Protocolo

O protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou. Os ratos foram fornecidos pelo Centro Animal da Universidade Médica do Sul. O design experimental é mostrado na Figura 1.

1. Animais e instrumentos

1. Use ratos sprague-dawley machos de 8 semanas pesando 250 ± 10 g.
2. Abrigar os ratos por pelo menos 7 dias antes da cirurgia sob condições ambientais controladas com temperatura ambiente de 25 °C, umidade relativa de 65%, e um ciclo claro-escuro de 12/12 h.
3. Forneça comida e água sem limite.
4. Prepare os instrumentos (Figura 2A-E).

2. Injete o sangue nos pons

1. Pesar os ratos novamente 3 dias antes da cirurgia para selecionar ratos com peso corporal adequado para os experimentos.
2. Durante os 3 dias antes da modelagem, treine os ratos para andar em feixe de equilíbrio 3 vezes por dia para garantir que ratos normais possam passar a viga de equilíbrio sem pausa.
3. Pré-aqueça a almofada de aquecimento a 37 °C antes da anestesia.
4. Fixar um microdrill ao suporte no quadro estereotaxic.
5. Injete os ratos com 50 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina intraperitonealmente. Espere até que não haja resposta do dedo do dedo do dedo do dedo.
6. Transporte o rato para o quadro estereotaxic em uma posição propensa. Coloque as barras de ouvido acima do canal auditivo para fixar a cabeça. Fixar o crânio em uma posição horizontal para evitar a distorção da injeção(Figura 2F).
7. Mantenha a anestesia por isoflurane (97,5% de oxigênio e 2,5% de isoflurane) através de um cone de nariz estereotaxic com uma porta de entrada e saída.
8. Use pomada para manter a córnea úmida.
9. Raspe o cabelo acima do crânio com uma micro máquina de barbear.
10. Desenhe uma linha média de 3 cm com uma caneta marcadora no crânio da linha do canthus lateral bilateral a 0,5 cm atrás da fontanelle posterior, como mostrado na Figura 2F.
11. Aplique entoiodina esfoliante cirúrgico de forma circular, começando no meio da linha média marcada e girando para fora.
12. Coloque a cortina cirúrgica.
13. Faça uma incisão com um bisturi ao longo da linha média marcada.
14. Use um cotonete para remover qualquer sangue em potencial.
15. Coloque um pedaço de fórceps em cada lado da aba do couro cabeludo para expor o crânio(Figura 2G).
16. Mergulhe um cotonete em 0,9% salino e remova suavemente os tecidos conjuntivos do osso do crânio para evitar que os tecidos conjuntivos fique preso no microdrill.
17. Marque o ponto central do bregma como o ponto de origem através de uma caneta marcadora.
18. Realize uma craniotomia (1 mm de diâmetro) utilizando um microdrill em AP-9,0 mm, Lat 0 mm(Figura 1B e Tabela 1). Prossiga com cuidado porque este ponto é muito próximo do seio venoso (Figura 2G).
19. Remova o microdrill do quadro estereotaxic.
20. Coloque uma seringa Hamilton de 100 μL no suporte estereotaxista(Figura 2K). Ligue o interruptor da bomba de injeção, clique no botão de inalação rápida, aspira a solução de heparina (12500 U diluída em 100 mL de soro fisiológico) a 100 μL e depois drene-a completamente para evitar a coagulação sanguínea muito rápido.
21. Aplique clorexidina e 75% de álcool na cauda inteira da raiz para ponta pelo menos 3 vezes para desinfetar a pele, suavizar o chifre e dilatar a veia da cauda para aumentar a taxa de sucesso da injeção.
22. Conecte uma acupuntura do couro cabeludo a uma seringa de 1 mL.
23. Insira a acupuntura do couro cabeludo em uma veia lateral da cauda a 3 cm da ponta da cauda e tome 150 μL de sangue(Figura 2H).
24. Remova a acupuntura do couro cabeludo da seringa de 1 mL.
25. Transfira o sangue para um tubo(Figura 2I).
    NOTA: Transfira rapidamente para evitar a coagulação sanguínea.
26. Troque as luvas cirúrgicas.
27. Escolha o modo Retirar, defina o volume para 100 μL, defina a velocidade em 200 μL/min, clique no botão RUN, aspire 100 μL de sangue na seringa Hamilton(Figura 2J).
28. Escolha o modo Infuse, defina a velocidade em 1 μL/min.
29. Avance a seringa até que a ponta atinja 9,2 mm abaixo da superfície do cérebro (Figura 1C e Figura 2L).
30. Clique no botão Executar, injete os primeiros 10 μL de sangue a uma velocidade de 1 μL/min(Tabela 1).
31. Pare a injeção e deixe a seringa em posição por 20 minutos para evitar que o sangue flua para o espaço subaracnóide.
32. Retraia a seringa até que a ponta chegue a 9,0 mm abaixo da superfície do cérebro.
33. Reinicie a injeção na mesma velocidade de 1 μL/min até que o sangue residual tenha sido injetado completamente.
34. Deixe a seringa em posição por 10 minutos para evitar o fluxo sanguíneo.
35. Remova a seringa do cérebro lentamente.
36. Use cimento ósseo para cobrir o orifício de craniotomia.
37. Quando o cimento secar, sutura a ferida com filamento de sutura de poliamida 4-0. Depois de costurar 3 ou 4 stiches, empate 2-1-1 nós cirúrgicos padrão.
38. Para prevenir a infecção, injete penicilina (0,25 mL, 80 UI diluída em soro fisiológico de 4 mL) intraperitoneally.
39. Injete os ratos subcutâneamente com tartarato butorphanol (2,5 mg/kg) e repita a injeção a cada 2 horas para aliviar a dor pós-operatória até 24 horas após a cirurgia.
40. Observe o rato a cada 15 minutos até que ele se recupere totalmente da anestesia. Devolva-o à gaiola original, com uma almofada de aquecimento debaixo da gaiola. Forneça ao rato acesso livre a comida e água até o sacrifício.

3. Testes comportamentais

NOTA: Realizar testes comportamentais no dia 1, dia 3, dia 7 e dia 14 após a modelagem, incluindo o teste do feixe de equilíbrio, teste de colocação de membros e o neuroscore Voetsch modificado.

1. Teste de feixe de equilíbrio¹¹.
   NOTA: Este é um teste especificamente para examinar a função sensorial da plataforma traseira.
   1. Preparado o aparelho para garantir que o feixe (3 cm de largura × 70 cm de comprimento) esteja 20 cm acima do chão.
   2. Coloque uma caixa escura na parte de trás da viga com uma entrada estreita.
   3. Coloque um gerador de ruído branco e uma fonte de luz brilhante, que são usadas para motivar o rato a atravessar a viga e entrar na caixa de gol, na extremidade da cabeça da trave.
   4. Pare o barulho e a luz quando o animal entrar na caixa de gol. Regissuor a latência da cabeça para a caixa de gol (em segundos) e o desempenho do hindlimb durante a travessia da trave.
   5. Registrar a pontuação de desempenho a seguir: 0, equilibra-se com postura estável; 1, apertos lado do feixe; 2, aconchega o feixe com 1 subida traseira caindo; 3, aconchega o feixe com 2 membros caindo, ou girando ao redor da viga por mais de 60 s; 4, tenta equilibrar na trave >40 s, mas cai; 5, tenta equilibrar na trave >20 s, mas cai; e 6, cai, sem tentativa de equilibrar ou equilibrar na trave <20 s.
2. Teste de colocação de membros
   NOTA: O teste de colocação do membro examina 3 estímulos independentes de visão, toque e propriocepção com 6 parâmetros, para avaliar a função sensorial do rato. O escore total da função neurológica variou de 0 a 12. Antes do teste, o rato deve ser habituado ao manuseio.
   1. Segure o rato por trás e coloque-o sobre a mesa lentamente a partir de uma altura de 10 cm. Normalmente, o rato esticaria os membros dianteiros e os colocaria sobre a mesa.
   2. Pegue o rato pelas costas e segure-o de frente para a borda da mesa. Observa-se a reação dos membros dianteiros. Um rato normal colocaria os membros dianteiros na mesa.
   3. Deixe o rato agarrar a borda da mesa. Um rato normal usaria o queixo para evitar que o nariz e o nariz tocassem na borda da mesa.
   4. Coloque o rato sobre a mesa, empurre o rato com uma suave pressão lateral atrás do ombro do rato em direção à borda da mesa, e observe a colocação dos membros dianteiros e traseiros. Um rato normal agarraria a borda com seus membros dianteiros e traseiros.
   5. Coloque o rato sobre a mesa com o rosto em direção à borda, e empurre-o suavemente de trás para a borda. Um rato normal agarraria a borda com seus membros dianteiros.
   6. Coloque o rato sobre a mesa de costas para a borda e empurre-o por trás para a borda da mesa. Observe a reação dos blocos traseiros. Um rato normal agarraria a borda com seus traseiros.
   7. Avalie a colocação dos membros dianteiros ou de bordas traseiras na borda da tabela. Registos: 0, sem colocação; 1, colocação inacabada e/ou atrasada; 2, colocação imediata e completa.
3. A neuroscore Voetsch modificada⁸
   NOTA: O neuroscore Voetsch modificado é um escore vertebrobasilar de capacidade sensorial, contendo 14 parâmetros: movimento da cabeça, atividade, audição, reflexo da dor, reflexo da córnea, propriocepção, sensação do pescoço, exploração, circling, sensação de torso axial, movimento de 4 membros, movimento de membros dianteiros, escalada e caminhada de feixe. A pontuação para cada parâmetro varia de 0 (déficit neurológico completo) a 3 (sem déficit neurológico). O escore total da função neurológica varia de 0 a 42.
   1. Coloque o rato sobre a mesa (50 cm de comprimento × 35 cm de largura) e deixe que ele se mova por cinco minutos. Observe o movimento espontâneo de sua cabeça: move-se em todas as dimensões, 3; prefere um lado, 2; apenas movimento para 1 lado, 1; flexionado para lado unilateral, 0.
   2. Coloque o rato sobre a mesa (50 cm de comprimento × 35 cm de largura) e deixe que ele se mova por cinco minutos. A atividade é definida como: totalmente responsiva, 3; moderadamente responsivo, 2; minimamente responsivo, 1; coma, 0.
   3. Observe o círculo craniocaudal: vira bilateralmente, 3; prefere 1 lado, 2; apenas para 1 lado, 1; caiu para um lado, 0.
   4. Avaliar o movimento dos membros dianteiros: movimento igual e bilateral, 3; assimetria leve, 2; grande assimetria, 1; paresis, 0.
   5. Avaliar o movimento de 4 membros: movimento igual e bilateral, 3; assimetria leve, 2; grande assimetria, 1; paresis, 0.
   6. Quando o rato estiver parado, realize uma pitada de ouvido para estimular as aurículas e teste o reflexo da dor: afasta-se rapidamente e simetricamente do estímulo, 3; afasta-se lentamente ou assimetricamente do estímulo, 2; mostra algum movimento em resposta à dor, 1; sem reação, 0.
   7. Quando o rato estiver parado, faça um barulho em ambos os lados do corpo do rato para testar a audição: dedos esfregando, 3; estalo de dedos, 2; palmas altas, 1 e nenhum surpreendente, 0.
   8. Para verificar a propriocepção, toque na vibrissae do rato em ambos os lados, respectivamente, com uma vara contundente e observe sua resposta ao estímulo: reaja ao toque, 3; reação diminuída de um lado, 2; diminuído em ambos os lados, 1; ausente, 0.
   9. Para avaliar a sensação axial do torso, coloque uma vara contundente em ambos os lados do corpo do rato e observe sua resposta ao estímulo: reação rápida e simétrica aos estímulos, 3; reação ligeiramente diminuída ou assimétrica, 2; reação muito diminuída e assimétrica, 1 e nenhuma reação, 0.
   10. Para testar o reflexo da córnea, segure o rato e toque rapidamente a córnea de ambos os lados com um cotonete: ambos os olhos se fecham rapidamente, 3; reflexo diminuído de um lado, 2; diminuído em ambos os lados, 1; ausente, 0.
   11. Para verificar a sensação do pescoço, segure o rato e use uma vara contundente para tocar o pescoço: reage ao toque ativamente, 3; reação lenta ao toque, 2; reação muito diminuída, 1; sem reação, 0.
   12. Para observar a exploração, use uma caixa escura clara.
       NOTA: Dois terços da caixa devem estar abertas e acesas, enquanto o resto está coberto e escuro. Uma porta de 7 cm conecta os dois compartimentos.
   13. Coloque o rato no compartimento de luz por 5 minutos e, em seguida, o compartimento escuro por mais 5 minutos, permita que ele se mova e regise as atividades do rato. Quando 4 membros forem colocados em uma sala, grave-o como uma entrada. Pontuações recordes da seguinte forma: atinge os compartimentos claro e escuro ativamente, 3; atinge 1 compartimento, 2; move-se lentamente apenas após estímulo, 1; e nenhum movimento, 0.
   14. Para verificar a capacidade de escalada, coloque o rato na parte inferior de um plano de 20 cm de largura e 70 cm de comprimento com um ângulo de 30 graus para o solo horizontal. Recorde de pontuações da seguinte forma: capaz de subir para o topo, 3; escalada prejudicada, 2; aderência estacionária, 1; e cai imediatamente, 0.
   15. Para examinar a caminhada do feixe, coloque o rato em uma extremidade de um feixe de 3 cm de largura, 70 cm de comprimento que está 20 cm acima do solo, registrando pontuações como a seguir: explora todo o feixe, 3; explora parte da viga, 2; algum movimento e quedas, 1; sem movimento, 0.
   16. Calcule os pontos.

4. Confirmação de hemorragia por ressonância magnética

1. Faça a ressonância magnética às 24h após a cirurgia.
2. Anestesiar o rato com isoflurane (5% para indução, 1% a 1,5% para manutenção).
3. Fixar a cabeça do rato na bobina do cérebro de rato combinada com uma bobina de volume somente de transmissão.
4. Coloque a bobina junto com o rato no scanner de ressonância magnética. Fixar o rato dentro do berço através das barras de dente e ouvido.
5. Use uma jaqueta térmica de circuito fechado para manter a temperatura corporal do rato a 37 ± 0,5 °C durante a ressonância magnética.
6. Execute uma sequência piloto para garantir a geometria correta.
7. Aplique uma sequência de eco de giro rápido para coletar varreduras ponderadas por T2. Definir os parâmetros da seguinte forma: tempo de eco (TE), 132 ms; tempo de repetição (TR), 2.500 ms; matriz de aquisição, 148 × 148; campo de visão, 100 mm × 100 mm; 12 fatias; 1,5 mm de espessura.
8. Devolva o rato para a jaula.

5. Confirmação da hemorragia por anatomia grosseira

NOTA: Sacrifique os ratos no ponto de tempo designado, 24h e 14 d após a cirurgia(Figura 1D).

1. Anestesiar o rato com 5% de isoflurane até a perda de consciência. Em seguida, eutanize-o com dióxido de carbono (CO₂) (20-30% do volume da gaiola por minuto).
2. Confirme a morte usando os seguintes sinais: sem aumento e queda do peito, sem batimentos cardíacos palpáveis, sem resposta ao dedo do dedo do dedo, cor da mucosa pobre, mudança de cor ou opacidade nos olhos.
3. Faça deslocamento cervical.
4. Segure o rato gravando as patas em uma plataforma estéril. Crie uma incisão midline do colo uterino para expor o hipogástrium ao tórax e fígado. Faça uma incisão lateral da margem popal superior ao longo da clavícula para a extrema esquerda e outro corte lateral do xiphoide ao longo do diafragma para a extrema esquerda, para expor o coração. Levante a aba da caixa torácica e fixe-a na plataforma com um alfinete.
5. Conecte a extremidade de uma agulha (27 G) a uma bomba de perfusão contendo soro fisiológico de 4 °C. Avance a ponta da agulha para o coração ao longo da borda esquerda do ventrículo esquerdo para evitar entrar no átrio. Ligue a bomba de perfusão para garantir que a ponta esteja no ventrículo esquerdo e faça um corte no átrio direito.
6. Desligue a bomba de perfusão quando o líquido drenado do átrio direito ficar incolor e o fígado ficar branco. Este procedimento precisa de aproximadamente 100 mL 4 °C salino.
7. Decapite o rato e colhe todo o cérebro usando tesouras e fórceps. Remova qualquer umidade da superfície cerebral com papel manchado.
8. Mantenha o cérebro inteiro a -80 °C por 1 min.
   NOTA: Este passo pode ser pulado se o cérebro puder ser cortado sem congelamento.
9. Coloque o cérebro na matriz cerebral de ratos coronais com o lado dorsal para cima.
10. Insira uma lâmina de aço inoxidável de 0,21 mm de espessura no centro de hemorragia de acordo com o orifício na superfície do cérebro.
11. Insira outras lâminas no cérebro em um intervalo de 2 mm.
12. Mergulhe as seções cerebrais em 10 mL de solução de paraformaldeído (PFA) de 4% por 24 h a 4 °C. Enxágüe-os com salina tamponada de 0,01 mmol/L (PBS).
13. Organize as seções de rostral a caudal e imagem-los.

6. Seção de parafina e hematoxilina e eosina (HE) coloração

1. Conserte o cérebro com 4% de solução PFA por pelo menos 24 h em temperatura ambiente. O volume de PFA deve ser de 5 a 10 vezes de volume cerebral.
2. Corte o cérebro do centro de hemorragia em dois pedaços através de lâmina e matriz cerebral de rato coronal.
3. Faça blocos de tecido embutidos em parafina.
4. Se se section o bloco de tecido embutido em parafina coronally em 40 μm de espessura desliza em um microtome, corte 4 seções em sucessão, começando do centro de hemorragia, e flutue-os em um banho de água de 40 °C.
5. Monte as seções de 40 μm (8 slides no total para um cérebro) em lâminas de vidro limpas e ar seco durante a noite à temperatura ambiente.
6. Asse os slides a 56 °C por 1h.
7. Lave por 3 minutos em xileno, 3 vezes.
8. A queda é 30 vezes maior em 100% etanol, 30 vezes mais em 100% etanol, 30 vezes em 95% etanol e 30 vezes mais em 95% etanol.
9. Enxágüe na água da torneira até ficar limpa.
10. Mergulhe as seções em Hematoxilina por cerca de 10 minutos.
11. Enxágüe na água da torneira até ficar limpa.
12. Mergulhe seções na mancha de eosina por 30 s.
13. A desidratação desliza com 3-4 quedas de 95% de etanol, 3-4 quedas em 100% etanol, 100% etanol por 1 minuto e 10 quedas em 100% etanol + xileno (1:1).
14. Limpe seções com xileno por 1 min, 2 vezes.
15. Monte usando meio de montagem não aquoso e uma mancha de cobertura.
16. Seque as seções no ar durante a noite à temperatura ambiente, depois san-los.

7. Estatísticas

1. Use o GraphPad Prism 6.0 para calcular o teste t do Student ou o teste U de Mann Whitney.
   NOTA: Todos os dados devem ser expressos como ± SE. As diferenças entre dois grupos são determinadas com um teste t-test de duas caudas ou teste U de Mann Whitney. P<0,05 é definido como significância estatística.

Resultados

Foram utilizados 25 animais, 3 para controle, 6 para 30 μL, 6 para 60 μL e 10 para injeções de sangue de 100 μL. Um rato que recebeu uma injeção de 100 μL de sangue autólogo (1/10) morreu dentro de 24 horas após a cirurgia.

Os exames comportamentais foram realizados no dia 1º, dia 3, dia 7 e dia 14 após a cirurgia. As pontuações para o grupo controle e grupos de injeção de sangue em diferentes pontos de tempo ap?...

Discussão

No presente estudo, fornecemos um protocolo para gerar um modelo maciço de rato de hemorragia pontina. Este modelo pode ser usado para a pesquisa sobre o mecanismo fisioterásio e prognóstico de hemorragia pontina maciça.

Ao longo do experimento, foram usados 25 ratos, dos quais apenas um morreu. A verificação da ressonância magnética, da anatomia bruta e da coloração do HE indicaram que este método tinha uma taxa de mortalidade muito baixa e uma alta taxa de sucesso. Para estabelece...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100ml Saline solution	Guangdong yixiang	191222201 C1	Preparing heparin diluent
100μl Microinjector	Shanghai Gaoge		Injection of autologous blood
1ml Syringe	Jiangsu Zhiyu	20191014	Withdraw autologous blood from the tail vein
75% Alcohol	Shandong Lierkang		Disinfection of rat tail
Adhesive tape	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Animal anesthesia system	RWD	R510-31S-6	Inducing and maintaining anesthesia
Balance beam	Jiangsu Saiangsi		For neurological deficit scores
Blades	Shanghai Feiying	74-C	For gross anatomy
Bone cement	Shanghai Xinshiji	20180306	Surgicl instruments
Brain tank	Shenzhen LEIYEA		For gross anatomy
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		For pain management
Electric cranial drill	Nanjing  Darwin biotechnology	20180090018	Making a burr hole on the skull
EP tube	Nantong Surui		Transfer autologous blood
Erythromycin eye cream	Yunnan pharmacy		Eyes protection
HE dye liquor	Solarbio	G1120	For HE staining
Heating pad	Dangerous Jungle	JR01	Keeping warm
Heparin sodium injection	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	Preparing heparin diluent
IndoPhors	Guoyao of China		Sterilization
Isoflurane	RWD	20080701	Inducing and maintaining anesthesia
Light dark box	Jiangsu Saiangsi		For neurological deficit scores
Micro-injection pump	Baoding Leifu	TFD03-01-C	Injection of autologous blood
MRI system	Philips		Confirmation of infarction in vivo
Needle holder	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Q-tips	Jiangxi Songhe		Surgicl instruments
Scalp heedle	Jiangxi Hongda	20200313	Withdraw autologous blood from the tail vein
Scalpel	Shanghai Kaiyuan	170902	Surgicl instruments
Shearing scissors	Shanghai Jinzhong	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus	RWD	900-00001-00	for surgical positioning
Surgical towel	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Surgicl instruments
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Suture scissors	Shanghai Jinzhong	J25041	Surgicl instruments
Tissue holding forcepts	Shanghai Jinzhong	J31080	Surgicl instruments