自家血液の二重注射による巨大なポンチン出血

要約

我々は、自己の血液の二重注入を介してラットに大規模なポンチン出血モデルを確立するためのプロトコルを提示する。

要約

ラットに大規模なポンチン出血モデルを確立するためのプロトコルを提供します。体重約250グラムのラットをこの研究で使用した。100マイクロリットルの自家血液が尾静脈から採取され、立体的にポンに注入された。注射プロセスは2つのステップに分けられた:最初に、10μLの血液を特定の場所に注入し、後部(AP)-9.0 mm;横 (Lat) 0 mm;垂直(Vert)-9.2mm、AP -9.0 mmに位置する残留血液の2回目の注射が続きます。ラット0ミリメートル;20分間隔で-9.0 mmをvert。バランスビーム試験、四肢配置試験、および修飾Voestch神経スコアを使用して神経機能を評価した。磁気共鳴画像法(MRI)を用いて、生体内出血量を評価した。このモデルの症状は、大量のポンチン出血患者と一致していた。

概要

脳内出血は脳卒中患者の5分の1を占める。脳内出血の予後は、出血の速度、体積、および位置に依存する^1,2.脳出血と比較すると、脳幹出血は死亡率と罹患率^が高い3.脳幹出血の約40%がポン⁴に生じる。ポンチン出血の病因と病態生理は、前脳出血⁵とは全く異なり、研究が少ない。

ポンチン出血動物モデルには2種類あります。一つは、ポン^6、7、8における細菌コラゲナーゼの注入によって誘発される自発性出血モデル^である。このモデルの最大の利点は、出血が自発的であるということです.しかし、コラゲナーゼは少量のポンチン出血を誘発することしかできない。また、コラゲザーゼは脳に他の傷害を引き起こす可能性があります。他のモデルは、ポン9に自家血の定位的注入によって^{誘発される。}このモデルの利点は、高い成功率で習得しやすいということです。理論的には、研究者はポンの任意の場所に血液の任意のボリュームを注入することができます。しかし、針路を通る逆漏れのため、注入された容積は限られている。近年、逆漏れ⁹を低減する二重注入法が推進されている。この方法は、注射の間に20分間隔で自家血液を2回注入する。二重注入法は、軽度(30μL)および中程度の(60μL)ポンチン出血を誘発するために適用されるが、大規模なポンチン出血ではない。クリニックでは、予後不良の大部分のポンチン出血患者は大量出血(10mL以上)を有する。

前の研究では、ラット¹⁰にポンチン虚血性脳卒中モデルを確立するためのプロトコルを提供した。本研究では、既存の二重注入法を改変し、ポンの2つの異なる場所で100μLの自家血を二重に注入することによりラットに大量のポンチン出血を誘導する詳細なプロトコルを提供する。

プロトコル

この議定書は、広州医科大学第2付属病院の施設動物管理・使用委員会によって審査され、承認された。ラットは、南部医科大学動物センターによって提供されました.実験計画を 図 1に示します。

1. 動物と器具

1. 体重250±10gの8週齢の雄のスプレイグ・ドーリーラットを使用してください。
2. 25°Cの周囲温度、相対湿度65%、および12/12-hの明暗サイクルで、制御された環境条件下で手術前に少なくとも7日間ラットを収容します。
3. 制限のない食料と水を提供する。
4. インストゥルメントを準備します (図 2A-E)。

2. ポンに血液を注入する

1. 実験に適した体重のラットを選択するために手術の3日前に再びラットを計量する。
2. モデリング前の3日間、ラットを1日3回バランスビームで歩くように訓練し、通常のラットが一時停止せずにバランスビームを通過できるようにします。
3. 麻酔前に加熱パッドを37°Cに予熱します。
4. ステレオタックスフレームのホルダーにマイクロドリルを取り付けます。
5. ラットに50mg/kgケタミンと5mg/kgのキシラジン腹腔内注射を行う。つま先ピンチ応答がなくなるまで待ちます。
6. ラットを立体的な位置に移動させます。耳の棒を外耳道の上に置いて頭を固定します。射出の歪みを避けるために、頭蓋骨を水平位置に固定します(図2F)。
7. イオブルラン(酸素97.5%、イオブルラン2.5%)による麻酔を、入口と出口ポートを備えた立体性の鼻コーンで維持します。
8. 角膜を湿らせた保つために目の軟膏を使用してください。
9. マイクロシャバーで頭蓋骨の上の髪を剃ります。
10. 図2Fに示すように、両側側カンサスの線から後部フォンタネルの後ろに0.5cmまで頭蓋骨にマーカーペンを入れた3cmの中間線を描く。
11. エントイオダイン外科スクラブを円形に適用し、マークされたミッドラインの真ん中から始まり、外側に回転します。
12. 外科用ドレープを置きます。
13. マークされた中間線に沿ってメスで切開を行います。
14. 綿棒を使用して潜在的な血液を除去します。
15. 頭皮のフラップの両側に鉗子を置き、頭蓋骨を露出させる(図2G)。
16. 綿棒を0.9%生理布に浸し、頭蓋骨から結合組織を静かに取り除き、結合組織がマイクロドリルに巻き込まれるのを避けます。
17. ブレグマの中心点をマーカー ペンを使用して原点としてマークします。
18. AP-9.0 mm、Lat 0mm(図1Bおよび表1)でマイクロドリルを使用して、開頭術(直径1mm)を行う。この点は静脈静脈に非常に近いので慎重に進めます(図2G)。
19. ステレオタックス フレームからマイクロドリルを取り外します。
20. 100 μL のハミルトン注射器をステレオタキシックホルダーに入れます (図 2K)。注入ポンプスイッチをオンにし、 急速吸入 ボタンをクリックし、吸引ヘパリン溶液(12500 Uは生理食塩水の100 mLで希釈)を100 μLにして、血液凝固が速すぎないように完全に排水します。
21. 皮膚を消毒し、角質を柔らかくし、尾静脈を拡張して注射の成功率を高めるために、根から先端まで全体の尾にクロルヘキシジンと75%のアルコール外科スクラブを塗布する。
22. 頭皮の鍼を1mLの注射器に取り付けます。
23. 頭皮の鍼を尾端から3cmの側面尾静脈に挿入し、血液150μLを取ります(図2H)。
24. 頭皮の鍼治療を1 mLの注射器から取り出します。
25. 血液をチューブに移す(図2I)。
    注:血液凝固を防ぐために迅速に転送します。
26. 手術用手袋を交換します。
27. 取り出しモードを選択し、音量を100 μLに設定し、速度を200 μL/minに設定し、RUNボタンをクリックして、100μLの血液をハミルトン・シリンジに吸い込みます(図2J)。
28. [インフューズモード]を選択し、速度を 1 μL/分に設定します。
29. 先端が脳の表面の下9.2mmに達するまで注射器を進める(図1Cおよび図2L)。
30. [実行]ボタンをクリックし、最初の10μLの血液を1μL/minの速度で注入する(表1)。
31. 注射を停止し、血液がくも膜下腔に流れ込むのを防ぐために、注射器を20分間放置します。
32. 先端が脳の表面の下9.0mmに到着するまで注射器を引き込みます。
33. 残りの血液が完全に注入されるまで、1 μL/分の同じ速度で注入を再開します。
34. 血流を避けるために10分間、シリンジをそのままにしておきます。
35. ゆっくりと脳から注射器を取り除く。
36. 骨セメントを使用して開頭口を覆います。
37. セメントが乾燥すると、創傷を4-0ポリアミド縫合糸フィラメントで縫合する。3または4のスチを縫った後、2-1-1標準的な外科結び目を結ぶ。
38. 感染を防ぐために、ペニシリン(0.25 mL、80 IUを4 mL生理食塩水に希釈)を腹腔内に注射する。
39. ラットをブトルファンノール酒で皮下注射し(2.5mg/kg)、術後の痛みを緩和するために2時間ごとに注射を手術後24時間まで繰り返します。
40. 麻酔から完全に回復するまで、15分ごとにラットを観察します。ケージの下に暖房パッドを置いて、元のケージに戻します。犠牲になるまで、ネズミに食料と水への自由なアクセスを提供します。

3. 行動テスト

注: バランスビームテスト、四肢配置テスト、および変更されたVoetschのニューロスコアを含む、モデリング後の1日目、3日目、7日目、14日目に行動テストを実行します。

1. バランスビーム試験^11.
   注意:これは、特に後肢の感覚運動機能を調べるテストです。
   1. ビーム(長さ70cmの3cm幅 ×)が床面から20cm上にあることを確認するために装置を用意しました。
   2. 梁の後ろの端に狭い入口を持つ暗い箱を置きます。
   3. ビームのヘッドエンドに、ビームを横断し、ゴールボックスに入るためにラットを動機づけるために使用されるホワイトノイズ発生器と明るい光源を配置します。
   4. 動物がゴールボックスに入ると、騒音と光を止めます。ヘッドエンドからゴールボックスまでの待ち時間(秒)と、ビームの通過中の後肢のパフォーマンスを記録します。
   5. パフォーマンススコアを次のように記録します: 0、安定した姿勢でバランスを取ります。1、梁のグリップ側。2、1後肢が落ちてビームを寄り添う。3、2つの手足が落ちるビームを寄り添うか、60以上のビームの周りを回転させる。4、ビーム>40 sのバランスを取ろうとしますが、落ちる。5、ビーム>20 sのバランスを取ろうとしますが、落ちる。6は、ビーム<20 sでバランスを取ったりバランスを取ったりしようとしない、落ちる。
2. 四肢配置試験
   注意:四肢配置試験は、ラットの感覚運動機能を評価するために、6つのパラメータを有する視力、タッチ、およびプロプリオセプションの3つの独立した刺激を検査する。神経機能の全スコアは0から12の範囲でした。テストの前に、ラットは取り扱いに慣れているはずです。
   1. 後ろにネズミを持ち、10cmの高さからゆっくりとテーブルの上に置きます。通常、ラットは前肢を伸ばし、テーブルの上に置きます。
   2. 後ろでネズミをつかみ、テーブルの端に向かってそれを保持します。前肢の反応が観察される。普通のネズミは前肢をテーブルの上に置くだろう。
   3. ネズミにテーブルの端をつかませます。通常のラットは、鼻と鼻毛がテーブルの端に触れるのを防ぐために顎を使用します。
   4. テーブルの上にラットを置き、ラットの肩の後ろの穏やかな横圧力でラットをテーブルの端に向かって押し、前肢と後肢の配置を観察します。正常なラットは、前肢と後肢で縁をつかんでいるだろう。
   5. テーブルの上にネズミを置き、顔を端に向かって置き、後ろから端までそっと押します。正常なラットは前肢で縁をつかんでいるだろう。
   6. ラットをテーブルの上に置き、その後をエッジに置き、テーブルの端に戻ってそれを押します。後肢の反応を観察する。通常のラットは後肢で縁をつかむだろう。
   7. テーブルのエッジに前肢または後肢の配置を評価します。スコアを次のように記録します: 0、配置なし。1、未完成および/または遅延配置。2、即時、完全な配置。
3. 改変されたVoetschニューロスコア⁸
   注:修正されたVoetschニューロスコアは、14のパラメータを含む感覚運動能力の脊椎体スケールスコアです:頭の動き、活動、聴覚、痛み反射、角膜反射、プロプリオセプション、首感覚、探査、旋回、軸胴感覚、4四肢運動、前肢運動、登山、ビームウォーク。各パラメータのスコアは、0(完全な神経障害)から3(神経学的欠陥なし)の範囲です。神経機能の合計スコアは0から42の範囲です。
   1. テーブルの上にネズミ(長さ50cm×幅35cm)を置き、5分間動き回ります。その頭の自発的な動きを観察する:すべての次元で移動、3。片側、2を好む;1側、1への移動のみ。一方的な側に屈曲, 0.
   2. テーブルの上にネズミ(長さ50cm×幅35cm)を置き、5分間動き回ります。アクティビティは、次のように定義されます: 完全応答性、3;適度に応答性, 2;最小応答性, 1;昏睡状態、0.
   3. 頭蓋骨の回りを観察する:両側に回る、3;1つの側面、2を好む;1側にのみ、1;1側、0に落ちた。
   4. 前肢運動を評価する:等しく、二国間運動、3;わずかな非対称性、2;偉大な非対称性、1;パレシス、0.
   5. 4肢運動を評価する:等しく、両側運動、3;わずかな非対称性、2;偉大な非対称性、1;パレシス、0.
   6. ラットが静止しているとき、耳のピンチを実行して耳のピンチを行い、耳のピンチを行って耳の便を刺激し、痛みの反射をテストする:刺激から迅速かつ対称的に離れて移動、3;刺激からゆっくりとまたは非対称的に離れて移動します, 2;痛みに反応していくつかの動きを示しています, 1;反応なし、0。
   7. ラットが静止しているときは、ラットの体の両側で音を立て、聴覚をテストします:指の擦れ、3;指のスナップ, 2;大きな拍手、1と驚くべき、0。
   8. プロプリオセプションを確認するには、鈍い棒で両側のラットのビブリッサエをタッチし、刺激に対する反応を観察する:タッチで反応、3;片側の反応が減少しました, 2;両側に減少, 1;存在しない、0。
   9. 胴体軸感覚を評価するには、ラットの体の両側に鈍い棒を置き、刺激に対するその反応を観察する:刺激に対する活発で対称的な反応、3;わずかに減少または非対称反応, 2;大幅に減少し、非対称反応、1と反応なし、0。
   10. 角膜反射をテストするには、ラットを保持し、すぐに綿棒で両側の角膜に触れる:両方の目はすぐに閉じる、3。片側の反射が減少した、2;両側に減少, 1;存在しない、0。
   11. 首の感覚を確認するには、ラットを保持し、首に触れる鈍いスティックを使用して:積極的にタッチに反応し、3。タッチに遅い反応, 2;大幅に減少した反応, 1;反応なし、0。
   12. 探検を観察するには、明るい暗いボックスを使用します。
       メモ:ボックスの3分の2は開いて点灯し、残りの部分は覆われて暗くなります。7 cmのドアは2つのコンパートメントを接続する。
   13. ラットを軽いコンパートメントに5分間置き、さらに5分間暗いコンパートメントを入れ、動き回ってラットの活動を記録します。四肢を1つの部屋に置いた時は、入り口として記録します。次のようにスコアを記録: 積極的に明暗コンパートメントに到達, 3;1コンパートメント、2に達します。刺激後にのみゆっくりと動く, 1;そして動きなし、0。
   14. クライミング能力を確認するには、ラットを幅20cm、長さ70cmの平面の底に置き、水平地面に30度の角度を持たします。次のようにスコアを記録: トップに登ることができる, 3;登山障害, 2;静止グリップ、1;そしてすぐに落ちる、0。
   15. ビームウォークを調べるために、ラットを幅3cm、地上20cmの長さ70cmの長さのビームの一方の端に置き、次のようにスコアを記録します:ビーム全体を探索します。ビームの一部を探索します, 2;いくつかの動きと滝、1;動きなし、0。
   16. 点を計算します。

4. MRIによる出血の確認

1. 手術後24時間でMRIスキャンを行います。
2. イオブルランでラットを麻酔します(誘導の場合は5%、メンテナンスの場合は1%-1.5%)。
3. ラットの頭部を、送信専用のボリュームコイルと組み合わせたラット脳アレイコイルに固定します。
4. MRIスキャナーに、ラットと一緒にコイルを置きます。歯と耳の棒を介してクレードル内のラットを固定します。
5. MRIスキャン中にラットの体温を37±0.5 °Cに保つために閉回路サーマルジャケットを使用してください。
6. 正しいジオメトリを確保するためにパイロットシーケンスを実行します。
7. 高速スピンエコーシーケンスを適用して、T2重み付けスキャンを収集します。次のようにパラメーターを設定します: エコー時間 (TE)、132 ミリ秒;繰り返し時間(TR)、2,500ミリ秒;取得マトリックス, 148 × 148;視野、100のmm×100のmm;12スライス。厚さ1.5mm。
8. ネズミをケージに戻します。

5. 総解剖による出血の確認

注:手術後に指定された時点、24時間と14dでラットを犠牲にしてください(図1D)。

1. 5%のイオブルランでラットを意識喪失まで麻酔する。次いで、二酸化炭素(CO2)(1分間のケージの体積の20〜30%)でそれを安楽死させる。
2. 次の兆候を使用して死亡を確認する:胸の上昇と落下、触知可能な心拍なし、つま先ピンチへの応答なし、貧しい粘膜の色、色の変化、または目の不透明度。
3. 子宮頸部脱臼を行う。
4. 無菌プラットフォーム上の足をテーピングすることによって、ラットを固定します。子宮頸部から中線切開を作成し、低気管を胸郭および肝臓に露出させる。鎖骨に沿って上側頭蓋のマージンから左端への横切り、横隔膜に沿ったxiphoidから左端への別の横切りを行い、心臓を露出させる。胸部フラップを持ち上げて、ピンでプラットフォームに固定します。
5. 針の端部(27G)を4°Cの生理食糸を含む灌流ポンプに接続します。針の先端を左心室の左端に沿って心臓に進め、心房に入らないようにします。灌流ポンプをオンにして、先端が左心室にあることを確認し、右心房でカットします。
6. 右心房から排出された液体が無色になり、肝臓が白くなったら、灌流ポンプをオフにします。この手順は約100 mL 4 °C生理液を必要とします。
7. ラットを切断し、はさみや鉗子を使用して脳全体を収穫します。ブロッティングペーパーで脳表面から水分を取り除きます。
8. 脳全体を-80°Cで1分間保ちます。
   注:このステップは、脳を凍結せずに切断できる場合にスキップすることができます。
9. 後側を上にして、コロナラットの脳マトリックスに脳を置きます。
10. 脳の表面の穴に応じて、0.21mmの厚さのステンレス製の刃を出血中心に挿入します。
11. 2 mm 間隔で他のブレードを脳に挿入します。
12. 脳切片を4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液の10 mLに4°Cで24時間浸漬する。 0.01 mmol/L リン酸緩衝生理食塩分(PBS)でリンスします。
13. ロストラルからカウダルまでのセクションを整理し、それらをイメージします。

6. パラフィン部とヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色

1. 室温で少なくとも24時間4%PFA溶液で脳を固定します。PFAの体積は脳容積の5〜10倍であるべきである。
2. 出血センターから脳をブレードとコロナラットの脳マトリックスを介して2つにカットします。
3. パラフィン埋め込み組織ブロックを作成します。
4. パラフィン埋め込まれた組織ブロックをミクロトーム上の40μmの厚さのスライドにコロナリーに切り、出血中心から始めて4つのセクションを連続して切断し、40°Cの水浴に浮かべる。
5. 40 μmのセクション(1つの脳の合計8枚のスライド)をきれいなガラススライドに取り付け、空気は室温で一晩乾燥します。
6. スライドを56°Cで1時間焼きます。
7. キシレンで3分間、3回洗浄します。
8. 浸出液は100%エタノールで30回、エタノール100%で30回、エタノール95%で30回、さらに95%エタノールで30回、さらに95%エタノールで30回浸す。
9. 水道水を透明になるまですすいでください。
10. ヘマトキシリンに約10分間浸します。
11. 水道水をすすいで透明になるまですすいでください。
12. 30 sのエオシン染色にセクションを浸します。
13. 脱水スライドは、95%エタノール、100%エタノールに3〜4ディップ、100%エタノール1分間100%エタノール、100%エタノール+キシレン(1:1)で10ディップで脱水します。
14. 1分間、2回、キシレンでセクションをきれいにしてください。
15. 非水性取り付け媒体とカバースリップを使用して取り付けます。
16. 空気中の切片を室温で一晩乾燥させ、次に衛生します。

7. 統計

1. グラフパッドプリズム6.0を使用して、学生のt検定またはマンホイットニーUテストを計算します。
   注: すべてのデータは、SE±平均として表現する必要があります。P<0.05は統計的有意性として定義されます。

結果

合計25匹、コントロール用3匹、30μL用6匹、60μL用6匹、100μLの血液注射に10匹を使用した。自家用血液(1/10)の100μL注射を受けた1ラットは、手術後24時間以内に死亡した。

行動検査は、手術後1日目、3日目、7日目、14日目に行われました。手術後の異なるタイムポイントにおける対照群と血液注射群のスコアを表2?...

ディスカッション

本研究では、大規模なポンチン出血ラットモデルを生成するプロトコルを提供した。このモデルは、巨大なポンチン出血の病態生理学的メカニズムおよび予後の研究に使用することができる。

実験を通じて25匹のラットが使用され、そのうち1匹しか死ななかった。MRIの検証、総解剖学、およびHE染色は、この方法が非常に低い死亡率と高い成功率を持っていることを示し...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100ml Saline solution	Guangdong yixiang	191222201 C1	Preparing heparin diluent
100μl Microinjector	Shanghai Gaoge		Injection of autologous blood
1ml Syringe	Jiangsu Zhiyu	20191014	Withdraw autologous blood from the tail vein
75% Alcohol	Shandong Lierkang		Disinfection of rat tail
Adhesive tape	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Animal anesthesia system	RWD	R510-31S-6	Inducing and maintaining anesthesia
Balance beam	Jiangsu Saiangsi		For neurological deficit scores
Blades	Shanghai Feiying	74-C	For gross anatomy
Bone cement	Shanghai Xinshiji	20180306	Surgicl instruments
Brain tank	Shenzhen LEIYEA		For gross anatomy
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		For pain management
Electric cranial drill	Nanjing  Darwin biotechnology	20180090018	Making a burr hole on the skull
EP tube	Nantong Surui		Transfer autologous blood
Erythromycin eye cream	Yunnan pharmacy		Eyes protection
HE dye liquor	Solarbio	G1120	For HE staining
Heating pad	Dangerous Jungle	JR01	Keeping warm
Heparin sodium injection	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	Preparing heparin diluent
IndoPhors	Guoyao of China		Sterilization
Isoflurane	RWD	20080701	Inducing and maintaining anesthesia
Light dark box	Jiangsu Saiangsi		For neurological deficit scores
Micro-injection pump	Baoding Leifu	TFD03-01-C	Injection of autologous blood
MRI system	Philips		Confirmation of infarction in vivo
Needle holder	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Q-tips	Jiangxi Songhe		Surgicl instruments
Scalp heedle	Jiangxi Hongda	20200313	Withdraw autologous blood from the tail vein
Scalpel	Shanghai Kaiyuan	170902	Surgicl instruments
Shearing scissors	Shanghai Jinzhong	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus	RWD	900-00001-00	for surgical positioning
Surgical towel	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Surgicl instruments
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Suture scissors	Shanghai Jinzhong	J25041	Surgicl instruments
Tissue holding forcepts	Shanghai Jinzhong	J31080	Surgicl instruments