نموذج حيواني كبير لإصابة الكلى الحادة عن طريق انسداد الشريان الكلوي الثنائي المؤقت

Summary

تقدم هذه الدراسة نموذجا حيوانيا كبيرا قابلا للاستنساخ للغاية لإصابة نقص التروية الكلوية في الخنازير باستخدام انسداد ثنائي ثنائي مؤقت للقسطرة بالون عن طريق الجلد للشرايين الكلوية لمدة 60 دقيقة وإعادة التروية لمدة 24 ساعة.

Abstract

ترتبط الإصابات الكلوية الحادة بارتفاع خطر الإصابة بالمراضة والوفيات بعد الجراحة. إصابة الإسكيمية والتشويش (IRI) هي السبب الأكثر شيوعا ل AKI. لمحاكاة هذا السيناريو السريري، تقدم هذه الدراسة نموذجا حيواني كبير قابل للاستنساخ للغاية من IRI الكلوي في الخنازير باستخدام انسداد ثنائي ثنائي عن طريق الجلد مؤقت للقسطرة بالون من الشرايين الكلوية. يتم انسداد الشرايين الكلوية لمدة 60 دقيقة عن طريق إدخال قسطرات البالون عبر الشريان الفخذي وال السباتي ودفعها إلى الجزء القريب من الشرايين. يتم حقن التباين Iodinated في الشريان الأورطي لتقييم أي عتامة في الأوعية الكلوية وتأكيد نجاح انسداد الشريان. ويؤكد ذلك كذلك من خلال تسطيح شكل الموجات النبضية في طرف قسطرة البالون. يتم تفريغ البالونات وإزالتها بعد 60 دقيقة من انسداد الشريان الكلوي الثنائي ، ويسمح للحيوانات بالتعافي لمدة 24 ساعة. في نهاية الدراسة ، يزداد الكرياتينين البلازما ونيتروجين اليوريا في الدم بشكل كبير ، في حين ينخفض إنتاج eGFR والبول بشكل كبير. الحاجة إلى التباين iodinated هو الحد الأدنى ولا يؤثر على وظيفة الكلى. الانسداد الشريان الكلوي الثنائي يحاكي بشكل أفضل السيناريو السريري لنقص التروية الكلوية في العراء ، ويقلل النهج عن طريق الجلد من تأثير الاستجابة الالتهابية وخطر العدوى التي ينظر إليها بنهج مفتوح ، مثل استئصال البطن. القدرة على إنشاء وإعادة إنتاج هذا النموذج الخنازير ذات الصلة سريريا يخفف من الترجمة السريرية للبشر.

Introduction

إصابة الكلى الحادة (AKI) هي حالة يتم تشخيصها عادة بين المرضى الجراحيين المرتبطين بالمراضة والوفيات الكبيرة^1،2. وتظهر البيانات المتاحة أن AKI يمكن أن تؤثر حتى على نصف جميع المرضى في المستشفيات في جميع أنحاء العالم ويؤدي إلى 50٪ معدل الوفيات في المرضى في وحدة العناية المركزة^1،3. على الرغم من انتشاره المرتفع، لا يزال العلاج الحالي ب AKI يقتصر على الاستراتيجيات الوقائية، مثل إدارة السوائل وغسيل الكلى. لذلك ، هناك اهتمام مستمر باستكشاف العلاجات البديلة ل AKI^4و5و6.

AKI تصنف عادة إلى ما قبل الكلوي، الجوهرية، وبعد الكلوية على أساس المسببات^{لها 4،5،6}. ترتبط غالبية المرضى الجراحيين الذين يعانون من AKI بأسباب ما قبل الكلى بسبب نقص الدم ، مما يؤدي إلى إصابة نقص التروية -reperfusion (IRI) للكلى². سريريا, انخفاض انتاج البول, وزيادة مستويات الكرياتينين بسبب انخفاض وظيفة الكلى. الكلى هي عضو عالي معدل الأيض وعرضة للكيمياء. نموذج حيواني كبير قابل للاستنساخ للغاية من IRI الكلوي ضروري للحصول على رؤية أفضل في الفيزيولوجيا المرضية ل AKI ونهجها العلاجية المحتملة⁵.

لمحاكاة السيناريو السريري لنقص التروية الكلوية في الفترة المحيطة بال المنطوق ، يعتبر نموذج انسداد الشريان الكلوي الثنائي مناسبا. النماذج الموصوفة سابقا التي تنطوي على انسداد الشريان الكلوي من جانب واحد مع أو بدون استئصال الكلى الكونترالاتال لا توفر ما يكفي من التطبيق السريري^7،8. على الرغم من أن هذه النماذج كافية للتسبب في AKI، فإنها لا تشبه سيناريوهات الحياة الحقيقية السريرية لا من حيث نوع ولا مدة الإصابة.

الهدف من هذه الورقة هو تقديم نموذج porcine من انسداد مؤقت ثنائي عن طريق الجلد من الشرايين الكلوية عن طريق انسداد بالون القسطرة تحت تصوير الأوعية. انسداد الشريان الكلوي الثنائي يحاكي السيناريو السريري لنقص التروية الكلوية ، يليه الإزالة اللاحقة للبالون لإعادة التروية^9،10. يتم وصف الخطوات التقنية، بما في ذلك القسطرة، وتوجيه القسطرة، وتصوير الأوعية، ورصد الدورة الدموية. هذا الأسلوب لا يسمح فقط لانسداد الشرايين الكلوية التي تسيطر عليها للغاية ويمكن تكرارها، ولكن النهج عن طريق الجلد يقلل من تأثير الاستجابة الالتهابية عن طريق الحد من كمية من إهانة للجسم مقارنة بنهج مفتوح.

Protocol

أجريت جميع الدراسات الحية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة بشأن رعاية الحيوانات واستخدامها ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى بوسطن للأطفال (البروتوكول 18-06-3715). وتلقى جميع الحيوانات رعاية إنسانية امتثالا لدليل رعاية واستخدام المختبر. يوضح الشكل 1 الجدول الزمني بما في ذلك التخدير والتحضير الجراحي والنقاط الزمنية لقياسات النتائج الأولية لهذه الدراسة.

1. الحث والتخدير والتنبيب

1. لمنع الإجهاد وعدم الراحة لا لزوم لها، وتخدير الخنازير عن طريق الحقن العضلي من خليط من tiletamine / zolazepam 4-6 ملغ / كغ وxylazine 1.1-2.2 ملغ / كغ، فضلا عن isoflurane 3٪ باستخدام قناع الوجه.
2. كانول الوريد الأذن للحصول على الوصول الوريدي مع قنية 20 G IV بعد تطهير المنطقة مع الإيثانول 95٪. بدء ضخ الصيانة (0.9٪ NaCl في 5 مل / كجم / ساعة).
3. قم بتنبيب الخنزير بأنبوب القصبة الهوائية (مقاس 7 للخنازير التي تزن 40-50 كجم) بمجرد التأكد من كفاية التخدير. أداء بالون التهوية مع تردد 12 نفسا / دقيقة ونقل الخنزير إلى غرفة العمليات.
4. ضع الحيوان على طاولة العمليات في وضعية النهم. ابدأ فورا تهوية الضغط الإيجابي الميكانيكية مع FiO₂ 0.50، 10 مل/كجم حجم المد والجزر، وتردد 12 نفسا / دقيقة تحت capnography المستمر.
5. ضع مقياس أكسدة النبض على الأذن أو الشفة السفلية لمراقبة مستمرة.
6. الحفاظ على normothermia (37 درجة مئوية) باستخدام وسادة الهواء ساخنة.
7. للحفاظ على التخدير العام، حافظ على إدارة الأيزوفلوران عند 0.5-4٪ من خلال أنبوب القصبة الهوائية. طوال العملية، مراقبة تخطيط القلب باستمرار، ضغط الدم الشرياني، درجة الحرارة، والكابنوغرافيا لقياس عمق التخدير.
8. أدخل قسطرة فولي للتحقق من حالة السائل للحيوان ومراقبة إخراج البول عن طريق جمع البول في كيس الصرف الصحي.
   ملاحظة: يفضل الخنازير الإناث على الذكور بسبب السمات التشريحية لمجرى البول الذي يسمح أسهل القسطرة.

2. التحضير الجراحي والوصول إلى الأوعية الدموية

1. ستارة الحيوان بطريقة عقيمة.
2. تطهير المنطقة الجانبية اليمنى من الرقبة عن طريق تطبيق بيتادين ثم 95٪ الإيثانول لمدة 3 مرات.
3. إجراء خفض القسطرة الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي الأيمن. تراجع عن العضلة القصية الجانبية وتشريحها وصولا إلى الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي الأيمن.
4. أدخل غمد تصوير الأوعية 5F في كل من الشريان والوريد. تأمينه مع خياطة الحرير 2-0.
5. أدخل غمد تصوير الأوعية 5F باستخدام تقنية Seldinger في الشريان الفخذي الأيسر.
   1. لإجراء تقنية Seldinger ثقب الشريان الفخذي باستخدام إبرة جوفاء. أدخل سلكا إرشاديا ناعما من خلال التجويف وتقدمه إلى الشريان الفخذي.
   2. عقد الدليل آمنة مع اليد أثناء إزالة الإبرة. تمرير غمد تصوير الأوعية عبر الدليل في الشريان الفخذي وسحب الدليل. استخدام التوجيه بالموجات فوق الصوتية، إذا لزم الأمر.

3. تحريض إصابة نقص التروية الكلوية

1. إعطاء 200 وحدة IU/kg هيبارين الصوديوم عن طريق الوريد لتحقيق تخثر الجهازية (الهدف تنشيط وقت التخثر (ACT) > 300 ثانية).
2. إجراء تصوير الأوعية عن طريق حقن عامل تباين يوديناتيد تحت تنظير الفلور لتحديد الشرايين الكلوية.
   ملاحظة:لتقليل خطر السمية الكلوية الناجمة عن التباين، قم بتخفيف عامل التباين iodinated في محلول 1:1 مع المالحة العادية. جدولة الجرعة لجميع الحيوانات لضمان الجرعات المكافئة.
3. تحديد الشرايين الكلوية، وتقدم يدويا في الدليل القسطرة التوجيهية.
4. ضع القسطرة التوجيهية 5F JL4 في الشريان الكلوي الأيسر عبر الشريان السباتي الأيمن (الشكل 1A).
5. وضع القسطرة التوجيهية الثانية 5F JL4 في الشريان الكلوي الأيمن من خلال الشريان الفخذي الأيسر (الشكل 1A).
6. استخدم الأسلاك الإرشادية لتوجيه قسطرة تزلطية 5F عن طريق الجلد (PTA) في كل شريان كلوي.
   ملاحظة: من الأفضل وضع البالون في الشريان الكلوي القريب بحيث لا تترك فروع أو ضمانات الشريان الكلوي براءة اختراع بعد تضخم البالون.
7. ضع كل قسطرة بالون في مكانها وربط خط ضغط بكل قسطرة.
8. تحقق من وجود أشكال موجية للنبض الشرياني في شاشة الضغط لضمان تحديد الموضع الصحيح للقسطرة.
9. تضخيم كل بالون وتهدف لضغط ما يقرب من 2.5 أجهزة الصراف الآلي داخل البالون(الشكل 1B).
10. لتأكيد توقف تدفق الدم إلى الكلى مراقبة تسطيح الموجي نبض في غيض من قسطرة البالون.
11. حقن المتوسطة التباين iodinated (1:1 التخفيف) والتحقق من أي عتامة الأوعية الكلوية.
    ملاحظة: من الممكن أيضا ملء البالون بعامل تباين iodinated لتصور البالون المتضخم. ومع ذلك، هذه الطريقة ليست حساسة مثل تسطيح شكل الموجات النبضية لتأكيد انسداد الشرايين الكلوية.
12. بعد 60 دقيقة من انسداد، تفريغ بعناية وإزالة القسطرة بالون من الشرايين الكلوية.
13. إجراء تصوير الأوعية (باستخدام 1:1 المتوسطة النقيض المخفف) لتأكيد الشبع الشريان الكلوي وإنشاء التروية الكلوية(الشكل 1C).
14. إزالة غمد تصوير الأوعية 5F من الشريان الفخذي الأيسر.
15. تطبيق ضغط ثابت في موقع القسطرة لمدة 30 دقيقة.
16. عكس تأثير الهيبارين عن طريق إدارة البروتامين (3 ملغم / كغ) حتى تطبيع ACT.
17. لعينة البول خلال فترة ما بعد الجراحة، قم بتأمين أنبوب إلى قسطرة فولي مع خياطة حريرية 2-0 باستخدام غرزة متقطعة على الجلد.
18. اترك أغماد تصوير الأوعية في الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي الأيمن في مكانه وآمنها بخياطة حريرية 2-0 باستخدام غرزة متقطعة للسماح بأخذ عينات الدم طوال الدراسة.
19. أغلق شق الرقبة بخياطة حرير 2-0 باستخدام غرزة مستمرة في طبقتين.
20. قم بإعطاء bupivacaine (3 ملغم/كغ) في موقع الشق لتقليل الألم.
21. استمر في ترطيب الحيوان بنسبة 0.9٪ من NaCl بمعدل 5 مل/كجم/ساعة لما مجموعه 2 ساعة بعد نهاية الإقفارية.
22. ضع رقعة الفنتانيل (25-50 ميكروغرام / ساعة) على الجزء الخلفي من الحيوان لتقليل الألم بعد الجراحة.
23. إعطاء حقنة عضلية من البوبرينورفين (0.005-0.1 ملغم /كغ) لتقليل الألم بعد العملية الجراحية.
24. مراقبة الحيوان والحفاظ عليه على التهوية الميكانيكية حتى الاستيقاظ.

4. استعادة الحيوان

1. بعد الاستيقاظ، استيعاب الحيوان في غرفة التحكم في درجة الحرارة.
2. الاستمرار في تحويل الحيوان من جانب جانبي واحد إلى آخر حتى يستعيد وعيه الكامل والقدرة على الالتهاب.
3. توفير المياه والغذاء الإعلانية libitum.

5. التقييم الوظيفي

1. جمع عينات الدم والبول وفقا للبروتوكول المطلوب.
   ملاحظة:في هذه الدراسة، تم تعيين النقاط الزمنية التالية: خط الأساس (1 ساعة بعد بدء بروتوكول الترطيب وقبل انسداد الشرايين الكلوية)، ونهاية نقص التروية، والتشويش (2 ساعة، 6 ح، 24 ساعة).
2. جمع عينات الدم الشرياني وال وريدي. تخزينها في الهيبارين الليثيوم أو EDTA vacutainers المغلفة للتحليل اللاحق.
   ملاحظة:ارسم الدم مباشرة من القسطرة في الشريان السباتي والوريد الوداجي.
3. جمع عينات البول من القسطرة فولي وتخزينها في أنابيب 15 مل للتحليل.
   ملاحظة:جمع البول من كيس الصرف الصحي متصلة القسطرة فولي.
4. لتحديد إخراج البول، إفراغ كيس الصرف وجمع البول لمدة ساعة واحدة.
   ملاحظة:بالنسبة للنقطة الزمنية 6 ساعة التي لا يتم فيها توصيل كيس الصرف بقسطرة فولي، أغلق الأنبوب المتصل بقسطرة فولي لمدة 30 دقيقة ثم اجمع البول بحقنة سعة 60 مل لتحديد إخراج البول.

6. القتل الرحيم

1. بعد نهاية فترة التروية، قم بإجراء التخدير والمراقبة كما هو موضح أعلاه.
2. استمر في الترطيب بنسبة 0.9٪ من الناقل عند 5 مل/كغ/ساعة.
3. استخدم القسطرة الشريانية وال وريدية لأخذ عينات الدم وقسطرة فولي لتحديد إخراج البول. جمع عينات الدم والبول النهائي وحساب انتاج البول.
4. إجراء شق استئصال البطن خط الوسط 15 سم باستخدام حجم 10 شفرة من xiphoid وصولا الى الحوض منتصف.
5. استخدم متراجعا الجانبي المستقيم لسحب جلد البطن.
6. تشريح المرفقات الصفاق الجانبية لجدار البطن لفضح الرجعية اليمنى واليسارية.
7. تحديد وتشريح بصراحة كل من الشرايين الكلوية والأوردة.
8. Ligate كل من الشرايين الكلوية والأوردة مع خياطة الحرير 2-0 وإجراء استئصال الكلية الثنائية لجمع عينات الأنسجة الكاملة للتحليل النسيجي والأيضي.
9. قتل الحيوان باستخدام الطريقة المفضلة للقتل الرحيم (على سبيل المثال، الإستئصال، البنتوباربيتال)

النتائج

التحليل الوظيفي
النتائج التمثيلية لهذه الدراسة تنشأ من 6 والبيانات المعروضة هي متوسط ± خطأ قياسي في المتوسط. يتم تقييم وظيفة الكلى عن طريق تحديد إخراج البول، ومعدل الترشيح الكبيبي المقدر (eGFR)، والكرياتين البلازما، ونيتروجين اليوريا في الدم (BUN). يتم تقييم المؤشرات الحيوية للوظي?...

Discussion

AKI هو اضطراب سريري شائع يؤثر على ما يصل إلى 50٪ من المرضى البالغين في المستشفى في جميع أنحاء العالم^6،12. وهناك حاجة إلى نموذج حيواني ذي صلة سريريا لمواصلة التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للمرض والأهداف العلاجية المحتملة. على الرغم من أن هناك العديد من نماذج مو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container	Baxter	2B1302	For animal hydration
Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74%	CARDINAL HEALTH	133311	For visualizing the vasculature
Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag	BARD Inc	802001	For urine collection
BD Vacutainer K2 EDTA	BD	367841	For blood sample storage
BD Vacutainer Lithium Heparin	BD	366667	For blood sample storage
Betadine	Henry Schein	6906950	For skin disinfection
Bookwalker retractor	Codman		For skin retraction
Bupivacaine 0.25%	Hospira		Administer at incision site for analgesia
Buprenorphine SR	Zoo Pharm		10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC
Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	7523-21	For identification of the renal arteries
Cuffed endotracheal tube	Emdamed		To establish a secure airway for the duration of the operation
EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor	GE Healthcare Madison WI		For oxygen saturation monitoring
Encore 26 inflator	BOSTON SCIENTIFIC	710113	For inflating the balloon catheters
Ethanol 95% (Ethyl alcohol)	Henry Schein		For skin disinfection
Fentanyl patch	Mylan		Dose: 25-50mcg/hr, TD
Gold silicone coated Foley	TELEFLEX MEDICAL INC	180730160	For urine collection
Heparin sodium	LEO Pharma A/S		Dose: 200 IU/kg IV
i33 ultrasound machine	Phillips		Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary
Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	6609-33	For guiding the balloon catheters to the renal arteries
Intravenous catheter, size 20 gauge	Santa Cruz Biotechnology	Inc SC-360097	For fluid administration
Isoflurane	Patterson Veterinary Supply, Inc.	21283620	Dose: 3%, INH
Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)"	Rudolf Medical	RU-1311-14M	For tissue dissection and cutting
Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring	Argon Medical	041588505A	For pressure measurement
Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm)	CARDINAL HEALTH	4400602X	For occlusion of the renal arteries
Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll	Smiths Medical	B1571/MX571	For pressure measurement
Procedure pack	Molnlycke Health Care	97027809	Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc
Protamine	Henry Schein	1044148	For heparin reversal
Scalpel blade - size #10	Cardinal Health (Allegiance)	32295-010	For the skin incisions
Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl	Peoplesoft	1550	For connecting tubings
Straight lateral retractor	Codman		For skin retraction
Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk	CARDINAL HEALTH 1	A185H	For suturing incision site and securing catheters
Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	MSS111-R	To administer the contrast agent
Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp	CARDINAL HEALTH 1	BF309653	For urine collection and flushing of the angiocath
Tilzolan (tiletamine/zolazepam)	Patterson Veterinary Supply, Inc.	07-893-1467	Dose: 4-6 mg/kg, IM
Xylazine	Putney, INC		Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM