일시적인 양측 신장 동맥 폐색에 의한 급성 신장 손상에 대한 대형 동물 모델

요약

이 연구는 60 분 동안 신장 동맥의 일시적인 경피 양자 풍선 카테터 폐색과 24 시간 동안 재관류를 사용하여 돼지에 있는 신장 허혈 -침전 손상의 높게 재현 가능한 큰 동물 모형을 제시합니다.

초록

급성 신장 손상 (AKI) 이환율과 수술 후 사망률에 대 한 높은 위험과 관련 된. 허혈 재관전 부상 (IRI)은 AKI의 가장 흔한 원인입니다. 이 임상 시나리오를 모방하기 위해, 이 연구는 신장 동맥의 일시적인 경피적인 양자 간 풍선 카테터 폐색을 사용하여 돼지에 신장 IRI의 매우 재현 가능한 큰 동물 모델을 제시합니다. 신장 동맥은 대퇴동맥과 경동맥을 통해 풍선 카테터를 도입하고 동맥의 근위 부분으로 발전시킴으로써 60분 동안 가려져 있습니다. 요이뇨 대비는 대동맥에 주입되어 신장 혈관의 어떤 소형성을 평가하고 동맥 폐색의 성공을 확인합니다. 이것은 풍선 카테터의 끝에서 펄스 파형의 평탄화에 의해 더욱 확인된다. 풍선은 수축되고 양측 신장 동맥 폐색의 60 분 후에 제거되고, 동물은 24 시간 동안 복구할 수 있습니다. 연구의 끝에서, 혈장 크레아티닌과 혈액 요소 질소 크게 증가, eGFR 및 소변 출력 크게 감소 하는 동안. 요분 조정의 필요성은 최소화되며 신장 기능에영향을 미치지 않습니다. 양측 신장 동맥 폐색은 회향 성 신부 전혈의 임상 시나리오를 더 잘 모방하고 경피적 접근법은 염증 반응의 영향과 복강경과 같은 개방적인 접근법으로 볼 수 있는 감염의 위험을 최소화합니다. 이 임상적으로 관련된 돼지 모델을 만들고 재현하는 기능은 인간에게 임상 번역을 용이하게합니다.

서문

급성 신장 손상(AKI)은 유의한 이환율 및 사망률^1,2와관련된 외과 환자 중 일반적으로 진단된 상태입니다. 사용 가능한 데이터는 AKI가 전 세계 모든 입원 환자의 절반에도 영향을 미칠 수 있으며 중환자실^1,3에서환자에서 50 %의 사망률을 유발할 수 있음을 보여줍니다. 그것의 높은 보급에도 불구하고, 현재 AKI 치료는 액체 관리 및 투석과 같은 예방 전략에 국한된 남아 있습니다. 따라서AKI^4,5,6에 대한 대체 요법을 탐구하는 데 지속적인 관심이^{있습니다.}

AKI는 전형적으로 신장 전, 내재, 및 신장 후^4,5,6로분류된다. AKI를 가진 외과 환자의 대다수는 신장 의 허혈-재퍼퓨전 상해 (IRI)의 결과로 저혈당때문에 전 신장 원인과 연관됩니다^2. 임상적으로, 소변 출력감소, 신장 기능 감소로 인해 크레아티닌 수치가 증가. 신장은 고신진대사 비율 기관이고 허혈에 영향을 받기 쉽습니다. 신장 IRI의 매우 재현 가능한 큰 동물 모델은 AKI의 병리생리학및 잠재적 치료 접근법^5에대한 더 나은 통찰력을 얻기 위해 필요하다.

신장 저구혈 의 임상 시나리오를 모방하기 위해 회심 동맥 폐색의 모형은 적당한 것으로 간주됩니다. 이전에 기술된 모델은 반자 신장의 절제술 유무에 관계없이 일방적인 신장 동맥 폐색을 수반하여 충분한 임상 적용성을 제공하지 않는다^7,8. 이 모형은 AKI를 일으키는 원인이 되기에 충분하더라도, 그(것)들은 상해의 모형 또는 기간의 관점에서 실제 임상 시나리오와 유사하지 않습니다.

이 논문의 목적은 혈관 조영술 하에서 풍선 카테터 폐색에 의해 신장 동맥의 경피 양자 임시 폐색의 돼지 모델을 제시하는 것입니다. 양측 신장 동맥 폐색은 신장 저구혈의 임상 시나리오를 모방하고, 이어서 레퍼퓨전용 풍선의 후속^{제거(9,10)를}한다. 카테터삽입, 카테터 안내, 혈관조영술 및 혈역학 모니터링을 포함한 기술 적인 단계가 설명됩니다. 이 방법은 신장 동맥의 고도로 통제되고 복제 가능한 폐색을 허용할 뿐만 아니라, 경피적인 접근법은 개방적인 접근법에 비해 신체에 대한 모욕의 양을 제한함으로써 염증 반응의 영향을 최소화합니다.

프로토콜

모든 생체 내 연구는 동물 관리 및 사용에 대한 국립 보건원의 지침에 따라 수행되었으며 보스턴 아동 병원의 동물 관리 및 사용 위원회 (의정서 18-06-3715)에 의해 승인되었습니다. 모든 동물은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 인도적 치료를 받았습니다. 도 1은 마취, 수술 준비 및 이 연구의 1차 결과 측정을 위한 시간점을 포함하는 타임라인을 보여줍니다.

1. 유도, 마취 및 삽관

1. 불필요한 스트레스와 불편함을 방지하기 위해, 스타일마민/졸라제팜 4-6 mg/kg과 자일라진 1.1-2.2 mg/kg의 혼합물과 이소플루란 3%의 근육 주입에 의해 돼지를 진정시킵니다.
2. 95%의 에탄올로 영역을 소독한 후 20 G IV 캐뉼라로 정맥접근을 얻기 위해 귀 정맥을 꾸미는 다. 유지 보수 주입을 시작합니다 (5 mL / kg / h에서 0.9 % NaCl).
3. 마취 적 수분이 확인되면 내막 관 (40-50kg의 돼지의 경우 크기 7)으로 돼지를 삽관하십시오. 12 호흡 / 분의 주파수로 풍선 환기를 수행하고 수술 극장에 돼지를 수송.
4. 동물을 수술대에 놓습니다. FiO₂ 0.50, 10mL/kg 조수 부피, 연속 카포그래피 하에서 12호흡/분 의 주파수로 기계적 양압 환기를 즉시 시작합니다.
5. 연속 모니터링을 위해 귀 또는 아래입술에 펄스 산소계를 놓습니다.
6. 공기 가열 패드를 사용하여 normothermia (37 °C)를 유지합니다.
7. 전신 마취를 유지하기 위해, 내막관을 통해 0.5-4 %에서 이소플루란 투여를 유지하십시오. 절차 전반에 걸쳐 심전도, 동맥 혈압, 온도 및 카포노그래피를 지속적으로 모니터링하여 마취의 깊이를 측정합니다.
8. 폴리 카테터를 삽입하여 동물의 유체 상태를 확인하고 배수 백에서 소변을 수집하여 소변 출력을 모니터링합니다.
   참고: 여성 돼지는 쉽게 카테터화를 허용하는 요도의 해부학적 특징으로 인해 남성보다 선호됩니다.

2. 외과 준비 및 혈관 접근

1. 멸균 방식으로 동물을 드레이프.
2. 베타딘을 적용한 다음 95% 에탄올을 3회 동안 적용하여 목의 오른쪽 측면 부위를 소독합니다.
3. 오른쪽 경동맥과 오른쪽 경정맥의 카테터화에 대한 컷다운을 수행한다. 흉골 근육을 측면으로 철회하고 오른쪽 경동맥과 오른쪽 경정맥으로 해부하십시오.
4. 동맥과 정맥 모두에 5F 혈관 조영술 칼집을 삽입합니다. 실크 2-0 봉합사로 고정하십시오.
5. 셀딩거 기술을 사용하여 5F 혈관조영소 덮개를 왼쪽 대퇴동맥에 삽입합니다.
   1. 셀딩거 기술을 수행하려면 중공 바늘을 사용하여 대퇴 동맥을 펑크. 루멘을 통해 부드러운 팁 가이드 와이어를 삽입하고 대퇴 동맥으로 진행합니다.
   2. 바늘을 제거하는 동안 손으로 가이드 와이어를 고정합니다. 혈관 조영술 칼집을 대퇴 동맥에 전달하여 가이드 와이어를 철회하십시오. 필요한 경우 초음파 지침을 사용합니다.

3. 신장 허혈 -재관성 부상의 유도

1. 전신 항응고(표적 활성 응고 시간(ACT) > 300s)를 달성하기 위해 정맥내 200IU/kg 나트륨 헤파린을 투여한다.
2. 신장 동맥을 식별하기 위해 형광체 아래에 요도 조영제를 주입하여 혈관 조영술을 수행하십시오.
   참고: 대조적으로 유발된 신증후군에 대한 위험을 줄이려면 요오드 조영제를 정상 식염수로 1:1 용액으로 희석합니다. 동등한 투약을 보장하기 위해 모든 동물에 대한 복용량을 타부레이팅.
3. 신장 동맥을 식별하고 가이드 카테터에서 가이드 와이어를 수동으로 진행합니다.
4. 오른쪽 경동맥(도1A)을통해 좌측 신장 동맥에 5F JL4 가이딩 카테터를 배치한다.
5. 좌측 대퇴동맥(도1A)을통해 오른쪽 신장 동맥에 두 번째 5F JL4 가이딩 카테터를 배치한다.
6. 가이드와이어를 사용하여 각 신장 동맥에서 5F 경피성 경피성 혈관 성형술(PTA) 팽창 카테터를 연출합니다.
   참고: 풍선을 열기구 인플레이션 후 신장 동맥의 가지 나 담보가 특허를 남기지 않도록 근위 신장 동맥에 풍선을 배치하는 것이 바람직하다.
7. 각 풍선 카테터를 제자리에 배치하고 압력 라인을 각 카테터에 연결합니다.
8. 압력 모니터에 동맥 펄스 파형의 존재를 확인하여 카테터의 올바른 위치를 확인하십시오.
9. 각 풍선을 팽창시키고 풍선 내부약 2.5 atm의 압력을 목표로(그림 1B).
10. 신장에 혈류의 중단을 확인하기 위해 풍선 카테터의 끝에서 펄스 파형의 평탄화를 관찰한다.
11. 요오드 조영 매체(1:1 희석)를 주입하고 신장 혈관의 어떤 소동을 확인합니다.
    참고: 팽창된 풍선의 시각화를 위해 팽창된 조영제로 풍선을 채울 수도 있습니다. 그러나, 이 방법은 신장 동맥의 폐색을 확인하기 위하여 평탄화하는 펄스 파형만큼 민감하지 않습니다.
12. 60분 동안 폐색한 후, 신장 동맥에서 풍선 카테터를 조심스럽게 수축하고 제거합니다.
13. 혈관 조영술 (1:1 희석 된 콘트라스트 배지 사용)을 수행하여 신장 동맥 가관성 및 신장 침전(도 1C)의확립을 확인합니다.
14. 왼쪽 대퇴 동맥에서 5F 혈관 조영술 칼집을 제거합니다.
15. 카테터라이제이션 부위에 30분 간 단단한 압력을 가하십시오.
16. ACT가 정상화 될 때까지 프로타민 (3 mg / kg)의 투여에 의해 헤파린의 효과를 반전시면 됩니다.
17. 수술 후 기간 동안 소변을 샘플링하려면 피부에 중단된 스티치를 사용하여 실크 2-0 봉합사로 폴리 카테터에 튜브를 고정하십시오.
18. 오른쪽 경동맥에 혈관 조영술 칼집과 오른쪽 경정맥을 제자리에 두고 연구 전반에 걸쳐 혈액 샘플링을 허용하기 위해 중단된 스티치를 사용하여 실크 2-0 봉합사로 고정하십시오.
19. 2층 연속 스티치를 사용하여 실크 2-0 봉합사로 목 절개를 닫습니다.
20. 통증을 최소화하기 위해 절개 부위에 부피바카인(3 mg/kg)을 투여한다.
21. 허혈이 끝난 후 총 2시간 동안 5mL/kg/h에서 0.9%의 NaCl으로 동물에게 수분을 공급합니다.
22. 수술 후 통증을 최소화하기 위해 동물의 뒷면에 펜타닐 패치(25-50 μg/h)를 놓습니다.
23. 수술 후 통증을 최소화하기 위해 부프레노르핀(0.005-0.1 mg/kg)의 근육 내 주사를 투여하십시오.
24. 동물을 모니터링하고 깨어날 때까지 기계적 환기에 유지합니다.

4. 동물 회복

1. 깨어난 후 온도 조절실에서 동물을 수용하십시오.
2. 동물을 한 쪽에서 다른 쪽으로 계속 돌리면 완전한 의식과 앰비트 능력을 되찾습니다.
3. 물과 음식 광고 리비툼을 제공합니다.

5. 기능 평가

1. 원하는 프로토콜에 따라 혈액과 소변 샘플을 수집합니다.
   참고: 본 연구에서, 다음과 같은 시간 포인트가 지정되었다: 기준선 (1 h 다음 수화 프로토콜의 개시 및 신장 동맥의 폐색 전), 허혈의 끝, 및 재관류 (2 h, 6 h, 24 h).
2. 동맥과 정맥 혈액 샘플을 수집합니다. 후속 분석을 위해 리튬 헤파린 또는 EDTA 코팅 된 vacutainers에 보관하십시오.
   참고: 경동맥과 경정맥의 카테터에서 직접 혈액을 그립니다.
3. 폴리 카테터에서 소변 샘플을 수집하고 분석을 위해 15 mL 튜브에 저장합니다.
   참고: 폴리 카테터에 연결된 배수 봉투에서 소변을 수집합니다.
4. 소변 출력을 확인하기 위해 배수 백을 비우고 소변을 1 시간 동안 수집하십시오.
   참고: 배수 백이 폴리 카테터에 연결되지 않은 6 h 시간 지점에서 폴리 카테터에 연결된 튜브를 30 분 동안 닫은 다음 60 mL 주사기로 소변을 수집하여 소변 출력을 결정합니다.

6. 안락사

1. 재관류 기간이 끝나면, 전술한 바와 같이 마취및 모니터를 수행한다.
2. 5mL/kg/h에서 0.9% NaCl로 수분을 계속 공급하십시오.
3. 혈액 샘플링과 폴리 카테터를 위해 동맥과 정맥 카테터를 사용하여 소변 출력을 결정합니다. 최종 혈액 및 소변 샘플을 수집하고 소변 출력을 계산합니다.
4. 심포니에서 중간 골반까지 크기 10 블레이드를 사용하여 15cm 미드라인 복강경 절개를 수행합니다.
5. 직선 측면 리트랙터를 사용하여 복부 피부를 후퇴시킵니다.
6. 좌우 레트로페리톤을 노출하기 위해 복벽의 측면 복막 부착물을 해부한다.
7. 신장 동맥과 정맥을 식별하고 무뚝뚝하게 해부합니다.
8. 신장 동맥과 정맥을 2-0 실크 봉합사를 사용하여 리게이트하고 조직학적 및 대사 분석을 위한 전체 조직 표본을 수집하기 위해 양측 신장절제술을 수행합니다.
9. 안락사의 바람직한 방법으로 동물을 안락사 (예를 들어, 황전, 펜토바르비탈)

결과

기능 분석
이 연구의 대표적인 결과는 6마리의 동물에서 발생하며, 표시된 데이터는 평균의 표준 오차± 의미입니다. 신장 기능은 소변 출력, 추정 된 사구 여과 율 (eGFR), 플라즈마 크레아틴 및 혈액 우레아 질소 (BUN)를 결정함으로써 평가됩니다. 신장 기능의 바이오마커는 휴대용 화학 분석기를 사용하여 평가됩니다. eGFR은 다음 공식에 따라 계산됩니다: eGFR =1.879 × BW^1.092/P

토론

AKI는 전 세계^6,12의입원 성인 환자의 최대 50%에 영향을 미치는 일반적인 임상 장애이다. 임상적으로 관련있는 동물 모형은 질병의 병리생리학 및 잠재적인 치료 표적을 추가로 조사하기 위하여 필요합니다. AKI를 복제하는 몇몇 뮤린 모형이 있더라도, 이들은 완전히 그들의 각각의 임상 시나리오 및 인간 신장의 해부학을 모방하지 않습니다. 이 연구는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container	Baxter	2B1302	For animal hydration
Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74%	CARDINAL HEALTH	133311	For visualizing the vasculature
Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag	BARD Inc	802001	For urine collection
BD Vacutainer K2 EDTA	BD	367841	For blood sample storage
BD Vacutainer Lithium Heparin	BD	366667	For blood sample storage
Betadine	Henry Schein	6906950	For skin disinfection
Bookwalker retractor	Codman		For skin retraction
Bupivacaine 0.25%	Hospira		Administer at incision site for analgesia
Buprenorphine SR	Zoo Pharm		10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC
Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	7523-21	For identification of the renal arteries
Cuffed endotracheal tube	Emdamed		To establish a secure airway for the duration of the operation
EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor	GE Healthcare Madison WI		For oxygen saturation monitoring
Encore 26 inflator	BOSTON SCIENTIFIC	710113	For inflating the balloon catheters
Ethanol 95% (Ethyl alcohol)	Henry Schein		For skin disinfection
Fentanyl patch	Mylan		Dose: 25-50mcg/hr, TD
Gold silicone coated Foley	TELEFLEX MEDICAL INC	180730160	For urine collection
Heparin sodium	LEO Pharma A/S		Dose: 200 IU/kg IV
i33 ultrasound machine	Phillips		Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary
Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	6609-33	For guiding the balloon catheters to the renal arteries
Intravenous catheter, size 20 gauge	Santa Cruz Biotechnology	Inc SC-360097	For fluid administration
Isoflurane	Patterson Veterinary Supply, Inc.	21283620	Dose: 3%, INH
Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)"	Rudolf Medical	RU-1311-14M	For tissue dissection and cutting
Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring	Argon Medical	041588505A	For pressure measurement
Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm)	CARDINAL HEALTH	4400602X	For occlusion of the renal arteries
Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll	Smiths Medical	B1571/MX571	For pressure measurement
Procedure pack	Molnlycke Health Care	97027809	Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc
Protamine	Henry Schein	1044148	For heparin reversal
Scalpel blade - size #10	Cardinal Health (Allegiance)	32295-010	For the skin incisions
Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl	Peoplesoft	1550	For connecting tubings
Straight lateral retractor	Codman		For skin retraction
Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk	CARDINAL HEALTH 1	A185H	For suturing incision site and securing catheters
Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	MSS111-R	To administer the contrast agent
Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp	CARDINAL HEALTH 1	BF309653	For urine collection and flushing of the angiocath
Tilzolan (tiletamine/zolazepam)	Patterson Veterinary Supply, Inc.	07-893-1467	Dose: 4-6 mg/kg, IM
Xylazine	Putney, INC		Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM