Ein Großtiermodell für akute Nierenverletzungen durch vorübergehenden bilateralen Nierenarterienverschluss

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert ein hochreproduzierbares Großtiermodell für renale Ischämie-Reperfusionsverletzungen bei Schweinen unter Verwendung eines vorübergehenden perkutanen bilateralen Ballonkatheterverschlusses der Nierenarterien für 60 min und einer Reperfusion für 24 h.

Zusammenfassung

Akute Nierenschäden (AKI) sind postoperativ mit einem höheren Risiko für Morbidität und Mortalität verbunden. Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist die häufigste Ursache für AKI. Um dieses klinische Szenario nachzuahmen, präsentiert diese Studie ein hochreproduzierbares Großtiermodell der nierenlichen IRI bei Schweinen unter Verwendung eines vorübergehenden perkutanen bilateralen Ballonkatheterverschlusses der Nierenarterien. Die Nierenarterien werden für 60 Minuten verschlossen, indem die Ballonkatheter durch die Oberschenkel- und Halsschlagader eingeführt und in den proximalen Teil der Arterien vorgerückt werden. Jodinierter Kontrast wird in die Aorta injiziert, um eine Trübung der Nierengefäße zu beurteilen und den Erfolg des Arterienverschlusses zu bestätigen. Dies wird zusätzlich durch die Abflachung der Pulswellenform an der Spitze der Ballonkatheter bestätigt. Die Ballons werden nach 60 Minuten bilateralem Nierenarterienverschluss entleert und entfernt, und die Tiere dürfen sich 24 Stunden lang erholen. Am Ende der Studie nehmen Plasmakreatinin und Blutharnstoffstickstoff signifikant zu, während eGFR und Urinausscheidung signifikant abnehmen. Der Bedarf an jodiertem Kontrast ist minimal und beeinträchtigt die Nierenfunktion nicht. Der bilaterale Nierenarterienverschluss ahmt das klinische Szenario der perioperativen Nierenhypoperfusion besser nach, und der perkutane Ansatz minimiert die Auswirkungen der Entzündungsreaktion und das Infektionsrisiko, das mit einem offenen Ansatz wie einer Laparotomie beobachtet wird. Die Fähigkeit, dieses klinisch relevante Schweinemodell zu erstellen und zu reproduzieren, erleichtert die klinische Translation auf den Menschen.

Einleitung

Akute Nierenschädigung (AKI) ist eine häufig diagnostizierte Erkrankung bei chirurgischen Patienten, die mit signifikanter Morbidität und Mortalität verbunden ist^1,2. Verfügbare Daten zeigen, dass AKI sogar die Hälfte aller hospitalisierten Patienten weltweit betreffen kann und zu einer Sterblichkeitsrate von 50% bei Patienten auf der Intensivstation^1,3führt. Trotz ihrer hohen Prävalenz beschränkt sich die derzeitige AKI-Therapie weiterhin auf präventive Strategien wie Flüssigkeitsmanagement und Dialyse. Daher besteht ein anhaltendes Interesse an der Erforschung alternativer Therapien für AKI^4,5,6.

AKI wird typischerweise in prärenal, intrinsisch und post-renal basierend auf seiner Ätiologie^4,5,6klassifiziert. Die Mehrheit der chirurgischen Patienten mit AKI ist mit prärennalen Ursachen aufgrund von Hypovolämie assoziiert, was zu einer Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) der Nieren führt². Klinisch nimmt die Urinproduktion ab und der Kreatininspiegel steigt aufgrund einer verminderten Nierenfunktion. Die Niere ist ein Organ mit hoher Stoffwechselrate und anfällig für Ischämie. Ein hochreproduzierbares Großtiermodell der renalen IRI ist notwendig, um einen besseren Einblick in die Pathophysiologie von AKI und ihre potenziellen Therapieansätze zu erhalten⁵.

Um das klinische Szenario der Nierenhyperfusion perioperativ nachzuahmen, wird ein Modell des bilateralen Nierenarterienverschlusses als geeignet erachtet. Zuvor beschriebene Modelle, die einen einseitigen Nierenarterienverschluss mit oder ohne Resektion der kontralateralen Niere beinhalten, bieten keine ausreichende klinische Anwendbarkeit^7,8. Obwohl diese Modelle ausreichen, um AKI zu verursachen, ähneln sie weder in Bezug auf die Art noch die Dauer der Verletzung realen klinischen Szenarien.

Ziel dieser Arbeit ist es, ein Porcine-Modell des perkutanen bilateralen vorübergehenden Verschlusses der Nierenarterien durch Ballon-Katheter-Okklusion unter Angiographie zu präsentieren. Bilateraler Nierenarterienverschluss ahmt das klinische Szenario der Nierenhyperfusion nach, gefolgt von der anschließenden Entfernung des Ballons zur Reperfusion^9,10. Die technischen Schritte werden beschrieben, einschließlich Katheterisierung, Katheterführung, Angiographie und hämodynamische Überwachung. Diese Methode ermöglicht nicht nur einen hoch kontrollierten und replizierbaren Verschluss der Nierenarterien, sondern der perkutane Ansatz minimiert auch die Auswirkungen der Entzündungsreaktion, indem er die Menge an Beleidigung des Körpers im Vergleich zu einem offenen Ansatz begrenzt.

Protokoll

Alle In-vivo-Studien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health zur Tierpflege und -verwendung durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee des Boston Children's Hospital genehmigt (Protokoll 18-06-3715). Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren human gepflegt. Abbildung 1 zeigt die Zeitleiste einschließlich Anästhesie, chirurgische Vorbereitung und Zeitpunkte für primäre Endpunktmessungen dieser Studie.

1. Induktion, Anästhesie und Intubation

1. Um unnötigen Stress und Beschwerden zu vermeiden, sedieren Sie das Schwein durch intramuskuläre Injektion einer Mischung aus Tiletamin / Zolazepam 4-6 mg / kg und Xylazin 1,1-2,2 mg / kg sowie Isofluran 3% mit einer Gesichtsmaske.
2. Kanülieren Sie die Ohrvene, um einen venösen Zugang mit einer 20 G IV-Kanüle zu erhalten, nachdem Sie den Bereich mit 95% Ethanol desinfiziert haben. Beginnen Sie eine Erhaltungsinfusion (0,9% NaCl bei 5 ml/kg/h).
3. Intubieren Sie das Schwein mit einem Endotrachealtubus (Größe 7 für Schweine mit einem Gewicht von 40-50 kg), sobald die Angemessenheit der Anästhesie bestätigt ist. Führen Sie eine Ballonbelüftung mit einer Frequenz von 12 Atemzügen/min durch und transportieren Sie das Schwein in den Operationssaal.
4. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf den Operationstisch. Starten Sie sofort die mechanische Überdruckbeatmung mit FiO₂ 0,50, 10 ml/kg Gezeitenvolumen und einer Frequenz von 12 Atemzügen/min unter kontinuierlicher Kapnographie.
5. Legen Sie zur kontinuierlichen Überwachung ein Pulsoximeter auf das Ohr oder die Unterlippe.
6. Halten Sie die Normothermie (37 °C) mit einem luftbeheizten Pad aufrecht.
7. Um die Vollnarkose aufrechtzuerhalten, halten Sie die Isofluran-Verabreichung bei 0,5-4% durch den Endotrachealtubus. Überwachen Sie während des gesamten Verfahrens kontinuierlich EKG, arteriellen Blutdruck, Temperatur und Kapnographie, um die Tiefe der Anästhesie zu messen.
8. Setzen Sie einen Foley-Katheter ein, um den Flüssigkeitsstatus des Tieres zu überprüfen und die Urinproduktion zu überwachen, indem Sie Urin in einem Drainagebeutel sammeln.
   HINWEIS: Weibliche Schweine werden aufgrund der anatomischen Merkmale ihrer Harnröhre gegenüber Männchen bevorzugt, was eine einfachere Katheterisierung ermöglicht.

2. Operationsvorbereitung und Gefäßzugang

1. Drapieren Sie das Tier auf sterile Weise.
2. Desinfizieren Sie den rechten seitlichen Bereich des Halses, indem Sie Betadin und dann 95% Ethanol für 3 mal auftragen.
3. Führen Sie eine Kürzung für die Katheterisierung der rechten Halsschlagader und der rechten Jugularvene durch. Ziehen Sie den Musculus sternocleidomastoidis seitlich zurück und sezieren Sie ihn bis zur rechten Halsschlagader und zur rechten Vena jugularis.
4. Führen Sie eine 5F-Angiographiescheide sowohl in die Arterie als auch in die Vene ein. Sichern Sie es mit einer Seidennäht von 2-0.
5. Führen Sie eine 5F-Angiographiescheide mit der Seldinger-Technik in die linke Oberschenkelarterie ein.
   1. Um die Seldinger-Technik durchzuführen, punktiert man die Oberschenkelarterie mit einer Hohlnadel. Führen Sie einen weichen Führungsdraht durch das Lumen ein und dringen Sie ihn in die Oberschenkelarterie vor.
   2. Halten Sie den Führungsdraht sicher mit der Hand, während Sie die Nadel entfernen. Führen Sie die Angiographiescheide über den Führungsdraht in die Oberschenkelarterie und ziehen Sie den Führungsdraht zurück. Verwenden Sie bei Bedarf eine Ultraschallführung.

3. Induktion einer renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung

1. 200 IE/kg Natriumheparin intravenös verabreichen, um eine systemische Antikoagulation zu erreichen (Target Activated Clotting Time (ACT) > 300 s).
2. Führen Sie eine Angiographie durch, indem Sie ein jodiertes Kontrastmittel unter Fluoroskopie injizieren, um die Nierenarterien zu identifizieren.
   HINWEIS: Um das Risiko einer kontrastinduzierten Nephrotoxizität zu reduzieren, verdünnen Sie das jodierte Kontrastmittel in einer 1:1-Lösung mit normaler Kochsalzlösung. Tabellarisch die Dosierung für alle Tiere, um eine gleichwertige Dosierung zu gewährleisten.
3. Identifizieren Sie die Nierenarterien, führen Sie den Führungsdraht im Führungskatheter manuell vor.
4. Positionieren Sie den 5F JL4-Führungskatheter in der linken Nierenarterie durch die rechte Halsschlagader (Abbildung 1A).
5. Positionieren Sie den zweiten 5F JL4-Leitkatheter in der rechten Nierenarterie durch die linke Oberschenkelarterie (Abbildung 1A).
6. Verwenden Sie die Führungsdrähte, um einen perkutanen transluminalen Angioplastiekatheter (PTA) mit 5F in jeder Nierenarterie zu steuern.
   HINWEIS: Es ist vorzuziehen, den Ballon an der proximalen Nierenarterie so zu positionieren, dass nach dem Aufblasen des Ballons keine Äste oder Kollateralen der Nierenarterie patentiert bleiben.
7. Positionieren Sie jeden Ballonkatheter an Ort und Stelle und verbinden Sie eine Druckleitung mit jedem Katheter.
8. Überprüfen Sie das Vorhandensein arterier Pulswellenformen im Druckmonitor, um die korrekte Positionierung des Katheters sicherzustellen.
9. Blasen Sie jeden Ballon auf und streben Sie einen Druck von ca. 2,5 atm im Ballon an (Abbildung 1B).
10. Um die Beendigung des Blutflusses zu den Nieren zu bestätigen, beobachten Sie die Abflachung der Pulswellenform an der Spitze des Ballonkatheters.
11. Jodhaltiges Kontrastmittel (1:1 Verdünnung) injizieren und auf Trübung der Nierengefäße prüfen.
    HINWEIS: Es ist auch möglich, den Ballon mit einem jodierten Kontrastmittel zur Visualisierung des aufgeblasenen Ballons zu füllen. Diese Methode ist jedoch nicht so empfindlich wie die Abflachung der Pulswellenform, um den Verschluss der Nierenarterien zu bestätigen.
12. Nach 60 Minuten Okklusion vorsichtig entleeren und entfernen Sie die Ballonkatheter aus den Nierenarterien.
13. Führen Sie eine Angiographie durch (unter Verwendung eines 1:1 verdünnten Kontrastmittels), um die Durchgängigkeit der Nierenarterie und die Etablierung einer Nierenreprofusion zu bestätigen (Abbildung 1C).
14. Entfernen Sie die 5F-Angiographiescheide von der linken Oberschenkelarterie.
15. Wenden Sie 30 Minuten lang festen Druck an der Katheterstelle an.
16. Kehren Sie die Wirkung von Heparin durch die Verabreichung von Protamin (3 mg / kg) um, bis sich ACT normalisiert.
17. Um während der postoperativen Phase Urin zu entnehmen, befestigen Sie einen Schlauch mit einer Seidennaht von 2-0 mit einem unterbrochenen Stich auf der Haut am Foley-Katheter.
18. Lassen Sie die Angiographiescheiden in der rechten Halsschlagader und der rechten Jugularvene an Ort und Stelle und sichern Sie sie mit einer Seidennaht von 2-0 mit einem unterbrochenen Stich, um die Blutentnahme während der gesamten Studie zu ermöglichen.
19. Schließen Sie den Halsschnitt mit einer Seidennaht von 2-0 mit einem durchgehenden Stich in 2 Schichten.
20. Verabreichen Sie Bupivacain (3 mg/kg) an der Schnittstelle, um Schmerzen zu minimieren.
21. Hydratisieren Sie das Tier weiterhin mit 0,9% NaCl bei 5 ml / kg / h für insgesamt 2 h nach dem Ende der Ischämie.
22. Legen Sie ein Fentanylpflaster (25-50 μg/h) auf den Rücken des Tieres, um postoperative Schmerzen zu minimieren.
23. Verabreichen Sie eine intramuskuläre Injektion von Buprenorphin (0,005-0,1 mg/kg), um postoperative Schmerzen zu minimieren.
24. Überwachen Sie das Tier und halten Sie es bis zum Erwachen mechanisch belüften.

4. Tiergewinnung

1. Nach dem Erwachen unterbringen Sie das Tier in einem temperaturkontrollierten Raum.
2. Drehen Sie das Tier weiterhin von einer seitlichen Seite zur anderen, bis es das volle Bewusstsein und die Fähigkeit zum Gehen wiedererlangt.
3. Stellen Sie Wasser und Nahrung ad libitum zur Verfügung.

5. Funktionsbewertung

1. Sammeln Sie das Blut und die Urinproben nach dem gewünschten Protokoll.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden die folgenden Zeitpunkte festgelegt: Ausgangswert (1 h nach Beginn des Hydratationsprotokolls und vor Verschluss der Nierenarterien), Ende der Ischämie und Reperfusion (2 h, 6 h, 24 h).
2. Sammeln Sie die arteriellen und venösen Blutproben. Lagern Sie sie in Lithium-Heparin- oder EDTA-beschichteten Vakutainern zur anschließenden Analyse.
   HINWEIS: Entnahme von Blut direkt aus den Kathetern in der Halsschlagader und Jugularvene.
3. Sammeln Sie die Urinproben aus dem Foley-Katheter und lagern Sie sie zur Analyse in 15 ml Röhrchen.
   HINWEIS:Sammeln Sie den Urin aus dem Drainagebeutel, der mit dem Foley-Katheter verbunden ist.
4. Um die Urinproduktion zu bestimmen, leeren Sie den Drainagebeutel und sammeln Sie Urin für 1 h.
   HINWEIS:Für den 6-Stunden-Zeitpunkt, an dem ein Drainagebeutel nicht mit dem Foley-Katheter verbunden ist, schließen Sie das mit dem Foley-Katheter verbundene Röhrchen für 30 Minuten und sammeln Sie dann den Urin mit einer 60-ml-Spritze, um die Urinproduktion zu bestimmen.

6. Euthanasie

1. Führen Sie nach dem Ende der Reperfusionsphase eine Anästhesie durch und überwachen Sie sie wie oben beschrieben.
2. Setzen Sie die Hydratation mit 0,9% NaCl bei 5 ml/kg/h fort.
3. Verwenden Sie die arteriellen und venösen Katheter für die Blutentnahme und den Foley-Katheter, um die Urinproduktion zu bestimmen. Sammeln Sie die endgültigen Blut- und Urinproben und berechnen Sie die Urinproduktion.
4. Führen Sie einen 15-cm-Midline-Laparotomieschnitt mit einer Klinge der Größe 10 vom Xiphoid bis zum mittleren Becken durch.
5. Verwenden Sie einen geraden seitlichen Retraktor, um die Bauchhaut zurückzuziehen.
6. Sezieren Sie die seitlichen Peritonealansätze der Bauchdecke, um das rechte und linke Retroperitoneum freizulegen.
7. Identifizieren und sezieren Sie unverblümt sowohl Nierenarterien als auch Venen.
8. Ligatieren Sie sowohl Nierenarterien als auch Venen mit einer 2-0-Seidennähte und führen Sie bilaterale Nephrektomien durch, um ganze Gewebeproben für die histologische und metabolische Analyse zu sammeln.
9. Euthanasie das Tier mit der bevorzugten Methode der Euthanasie (z.B. Exsanguination, Pentobarbital)

Ergebnisse

Funktionalanalysis
Die repräsentativen Ergebnisse dieser Studie stammen von 6 Tieren und die gezeigten Daten sind mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Die Nierenfunktion wird durch Bestimmung der Urinausscheidung, der geschätzten glomerulären Filtrationsrate (eGFR), des Plasmakreatins und des Blutharnstoffstickstoffs (BUN) beurteilt. Die Biomarker der Nierenfunktion werden mit einem tragbaren chemischen Analysator bewertet. eGFR wird nach folgender Formel berechnet: eGFR =1,879 × BW^1...

Diskussion

AKI ist eine häufige klinische Erkrankung, von der bis zu 50% der hospitalisierten erwachsenen Patienten weltweit betroffen^{sind 6,12}. Ein klinisch relevantes Tiermodell wird benötigt, um die Pathophysiologie der Krankheit und mögliche therapeutische Ziele weiter zu untersuchen. Obwohl es mehrere murine Modelle gibt, die AKI replizieren, ahmen diese ihre jeweiligen klinischen Szenarien und die Anatomie der menschlichen Niere nicht vollständig nach. Diese Studi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container	Baxter	2B1302	For animal hydration
Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74%	CARDINAL HEALTH	133311	For visualizing the vasculature
Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag	BARD Inc	802001	For urine collection
BD Vacutainer K2 EDTA	BD	367841	For blood sample storage
BD Vacutainer Lithium Heparin	BD	366667	For blood sample storage
Betadine	Henry Schein	6906950	For skin disinfection
Bookwalker retractor	Codman		For skin retraction
Bupivacaine 0.25%	Hospira		Administer at incision site for analgesia
Buprenorphine SR	Zoo Pharm		10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC
Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	7523-21	For identification of the renal arteries
Cuffed endotracheal tube	Emdamed		To establish a secure airway for the duration of the operation
EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor	GE Healthcare Madison WI		For oxygen saturation monitoring
Encore 26 inflator	BOSTON SCIENTIFIC	710113	For inflating the balloon catheters
Ethanol 95% (Ethyl alcohol)	Henry Schein		For skin disinfection
Fentanyl patch	Mylan		Dose: 25-50mcg/hr, TD
Gold silicone coated Foley	TELEFLEX MEDICAL INC	180730160	For urine collection
Heparin sodium	LEO Pharma A/S		Dose: 200 IU/kg IV
i33 ultrasound machine	Phillips		Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary
Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	6609-33	For guiding the balloon catheters to the renal arteries
Intravenous catheter, size 20 gauge	Santa Cruz Biotechnology	Inc SC-360097	For fluid administration
Isoflurane	Patterson Veterinary Supply, Inc.	21283620	Dose: 3%, INH
Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)"	Rudolf Medical	RU-1311-14M	For tissue dissection and cutting
Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring	Argon Medical	041588505A	For pressure measurement
Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm)	CARDINAL HEALTH	4400602X	For occlusion of the renal arteries
Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll	Smiths Medical	B1571/MX571	For pressure measurement
Procedure pack	Molnlycke Health Care	97027809	Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc
Protamine	Henry Schein	1044148	For heparin reversal
Scalpel blade - size #10	Cardinal Health (Allegiance)	32295-010	For the skin incisions
Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl	Peoplesoft	1550	For connecting tubings
Straight lateral retractor	Codman		For skin retraction
Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk	CARDINAL HEALTH 1	A185H	For suturing incision site and securing catheters
Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	MSS111-R	To administer the contrast agent
Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp	CARDINAL HEALTH 1	BF309653	For urine collection and flushing of the angiocath
Tilzolan (tiletamine/zolazepam)	Patterson Veterinary Supply, Inc.	07-893-1467	Dose: 4-6 mg/kg, IM
Xylazine	Putney, INC		Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM