一時的な両側性腎動脈閉塞による急性腎障害の大型動物モデル

要約

本研究は、60分間の腎動脈の一時的な経皮的両側性両側気球カテーテル閉塞および24時間の再灌流を用いた豚における腎虚血再灌流傷害の非常に再現性の高い大型動物モデルを提示する。

要約

急性腎障害(AKI)は、罹患率および死亡率のリスクが高いことに関連しています。虚血再灌流傷害(IRI)は、AKIの最も一般的な原因である。この臨床シナリオを模倣するために、本研究は、腎動脈の一時的な経皮的両側気球カテーテル閉塞を用いて豚中の腎IRIの非常に再現性の高い大型動物モデルを提示する。腎動脈は、大腿動脈および頸動脈を通してバルーンカテーテルを導入し、動脈の近位部分に進めることによって60分間閉塞される。大動脈にヨウ素化されたコントラストを注入して、腎臓血管の全振動を評価し、動脈閉塞の成功を確認する。これは、バルーンカテーテルの先端におけるパルス波形の平坦化によってさらに確認される。バルーンは、両側腎動脈閉塞の60分後に収縮して除去され、動物は24時間回復することが許可される。研究の最後に、血漿クレアチニンと血液尿素窒素が有意に増加し、eGFRおよび尿の出力が大幅に減少する。ヨードコントラストの必要性は最小限であり、腎機能に影響を与えません。両側性腎動脈閉塞は、周術期腎低灌流の臨床シナリオをよりよく模倣し、経皮的アプローチは、炎症性反応の影響および開いたアプローチ(腹腔内術)のような開放的なアプローチで見られる感染のリスクを最小限に抑える。この臨床的に関連する豚モデルを作成し、再現する能力は、人間への臨床翻訳を容易にします。

概要

急性腎障害(AKI)は、重大な罹患率および死亡率^1,2に関連する外科患者の間で一般的に診断された状態である。利用可能なデータによると、AKIは世界中の入院患者の半数にも影響を及ぼし、集中治療室^1,3の患者の死亡率は50%にまで及ぶ。その高い普及にもかかわらず、現在のAKI療法は、流体管理や透析などの予防戦略に限定されたままです。したがって、AKI^4、5、6の代替療法の探索に継続的な関心があります。

AKIは、典型的には、その病因^4、5、6に基づいて、腎前、組み込み、および腎後に分類^される。AKIを有する外科患者の大半は、低心血症による腎前原因と関連しており、腎臓²の虚血再灌流傷害(IRI)をもたらす。臨床的には、尿の出力が減少し、腎機能の低下によりクレアチニンレベルが増加する。腎臓は代謝率が高い臓器で、虚血の影響を受けやすい。腎IRIの非常に再現性の大きな動物モデルは、AKIの病態生理学とその潜在的な治療アプローチに関するより良い洞察を得るために必要である^5。

腎低灌流の周回手術の臨床シナリオを模倣するために、両側腎動脈閉塞のモデルが適していると考えられる。前述のモデルは、対側腎臓の切除の有無にかかわらず一方的な腎動脈閉塞を伴うモデルは、十分な臨床適用性を提供していない^7,8。これらのモデルはAKIを引き起こすには十分ですが、タイプや傷害の持続時間の面でも実際の臨床シナリオに似ていない。

本論文の目的は、血管造影の下で気球カテーテル閉塞による経皮的両側性腎動脈の一時的閉塞のブタモデルを提示することである。両側性腎動脈閉塞は、腎低灌流の臨床シナリオを模倣し、続いて再灌流用バルーンを除去した^9,10.技術的なステップは、カテーテル法、カテーテルガイダンス、血管造影、血行力学的モニタリングを含む。この方法は、腎動脈の高度に制御され、複製可能な閉塞を可能にするだけでなく、経皮的アプローチは、開放的なアプローチと比較して身体に対する侮辱の量を制限することによって炎症反応の影響を最小限に抑える。

プロトコル

すべてのin vivo研究は、国立衛生研究所の動物ケアと使用に関するガイドラインに従って行われ、ボストン小児病院の動物ケアおよび使用委員会によって承認されました(プロトコル18-06-3715)。すべての動物は、実験動物のケアと使用のためのガイドに従って人道的ケアを受けました。 図1 は、この研究の主要な結果測定のための麻酔、手術準備、およびタイムポイントを含むタイムラインを示しています。

1. 誘導、麻酔、挿管

1. 不必要なストレスや不快感を防ぐために、フェイスマスクを使用して、タイルタミン/ゾラゼパム4-6 mg/kgおよびキシラジン1.1-2.2mg/kgの混合物の筋肉内注射によって豚を鎮静させる。
2. 耳静脈をカニューレートし、95%エタノールで領域を消毒した後、20G IVカニューレで静脈アクセスを得る。メンテナンス注入を開始します(5 mL/kg/hで0.9%NaCl)。
3. 麻酔の妥当性が確認されると、気管内チューブ(体重40〜50kgの豚の場合はサイズ7)で豚を挿管します。12呼吸/分の頻度で気球換気を行い、手術室に豚を輸送します。
4. 動物を手術台の上に置きます。FiO₂ 0.50、10 mL/kgの潮量、および連続的なカポノグラフィーの下で12の呼吸/分の頻度ですぐに機械正圧換気を開始します。
5. 連続的な監視のために耳または下唇にパルスオキシメーターを置きます。
6. 空気加熱パッドを使用してノルメロザミア(37°C)を維持します。
7. 全身麻酔を維持するために、気管内管管を通してイソフルラン投与を0.5〜4%に保つ。処置を通して、継続的に心電図、動脈血圧、温度、およびカポノグラフィーを監視し、麻酔の深さを測定する。
8. フォーリーカテーテルを挿入して動物の体液状態を確認し、尿を排水袋に入れ、尿の出力を監視します。
   注:女性の豚は、より簡単にカテーテル化を可能にする尿道の解剖学的特徴のために男性よりも好ましい。

2. 手術準備と血管アクセス

1. 無菌の方法で動物をドレープ。
2. ベタジンを塗布し、その後95%エタノールを3回塗布することにより、首の右側領域を消毒します。
3. 右頸動脈と右頸静脈のカテーテル化のためのカットダウンを行う。胸骨腫筋を横に引き込み、右頸動脈と右頸静脈まで解剖する。
4. 動脈と静脈の両方に5F血管造影鞘を挿入する。シルク2-0縫合糸で固定します。
5. セルディンガー技術を使用して5F血管造影シースを左大腿動脈に挿入します。
   1. セルディンガー技術を行うために、中空の針を用いて大腿動脈を穿刺する。細管を通して柔らかい先端のガイドワイヤーを挿入し、大腿動脈にそれを進める。
   2. 針を外しながらガイドワイヤーを手でしっかり持ちます。ガイドワイヤーの上に血管造影シースを大腿動脈に渡し、ガイドワイヤーを引き出します。必要に応じて、超音波ガイダンスを使用してください。

3. 腎虚血再灌流傷害の誘導

1. 全身性抗凝固を達成するために200 IU /kgのヘパリンナトリウムを静脈内投与(標的活性化凝固時間(ACT)>300s)
2. 腎動脈を同定するために、蛍光法下でヨード造影剤を注入して血管造影を行う。
   注: コントラストによる腎毒性のリスクを低減するには、ヨウ化造液を通常の生理食塩水で1:1溶液で希釈します。同等の投薬を確実にするために、すべての動物のための投与量を集計します。
3. 腎動脈を特定し、ガイド線を導くカテーテルで手動で進める。
4. 5F JL4誘導カテーテルを左腎動脈に右頸動脈を通る位置を決めた(図1A)。
5. 左大腿動脈を通って右腎動脈に第2の5F JL4誘導カテーテルを配置する(図1A)。
6. ガイドワイヤーを使用して、各腎動脈に5F経皮性経芽形成術(PTA)拡張カテーテルを指示します。
   注意: バルーンの膨張後に腎動脈の枝や副木が特許を残さないように、バルーンを近位腎動脈に配置することが望ましい。
7. 各バルーンカテーテルを所定の位置に配置し、各カテーテルに圧力線を接続します。
8. 圧力モニタに動脈脈波が存在することを確認し、カテーテルの正しい位置を確認します。
9. 各バルーンを膨らませ、バルーン内の約2.5気圧の圧力を目指します(図1B)。
10. 腎臓への血流の停止を確認するために、バルーンカテーテルの先端における脈波波形の平坦化を観察する。
11. ヨード化された造影剤(1:1希釈)を注入し、腎血管の任意の振動を確認します。
    注: 膨張したバルーンを視覚化するために、バルーンをヨウ化造影剤で満たすことも可能です。しかし、この方法は、腎動脈の閉塞を確認するために平坦化する脈波波形ほど敏感ではない。
12. 60分後に閉塞を慎重に収縮させ、腎動脈からバルーンカテーテルを取り除きます。
13. 腎動脈の開血と腎再灌流の確立を確認するために(1:1希釈された造影培地を使用して)血管造影を行う(図1C)。
14. 5F血管造影鞘を左大腿動脈から取り除く。
15. カテーテル法の現場で30分間しっかりと圧力を加えます。
16. ACTが正常化するまでプロタミンの投与によるヘパリンの効果を逆にする(3mg/kg)。
17. 術後の期間中に尿をサンプリングするには、皮膚の中断されたステッチを使用してシルク2-0縫合糸でフォーリーカテーテルにチューブを固定します。
18. 右頸動脈と右頸静脈の血管を血管造影シースを所定の位置に残し、研究全体で血液サンプリングを可能にするために中断されたステッチを使用してシルク2-0縫合糸でそれらを確保する。
19. 2層の連続ステッチを使用してシルク2-0縫合糸で首切開を閉じます。
20. ブピバカイン(3mg/kg)を切開部位で投与して痛みを最小限に抑える。
21. 虚血の終わりに続いて合計2時間の5 mL /kg /hで0.9%NaClで動物を水和し続けます。
22. フェンタニルパッチ(25-50 μg/h)を動物の背面に置き、術後の痛みを最小限に抑えます。
23. 術後の痛みを最小限に抑えるために、ブプレノルフィン(0.005-0.1 mg/kg)の筋肉内注射を投与する。
24. 動物を監視し、目を覚ますまで機械的換気でそれを維持します。

4. 動物の回復

1. 目覚めの後、温度管理された部屋で動物を収容する。
2. 完全な意識とアンブレートする能力を取り戻すまで、動物を片側から他方に向け続けます。
3. 水と食品アドリビタムを提供します。

5. 機能評価

1. 目的のプロトコルに従って血液および尿サンプルを収集する。
   注:この研究では、ベースライン(水和プロトコルの開始後1時間、腎動脈の閉塞前)、虚血の終結、再灌流(2時間、6時間、24時間)の時点が指定されました。
2. 動脈と静脈血液サンプルを収集します。リチウムヘパリンまたはEDTAコーティングされたバクテイナーに保管し、その後の分析を行ってください。
   注意: 頸動脈と頸静脈のカテーテルから直接血液を引き出します。
3. フォーリーカテーテルから尿サンプルを収集し、分析のために15 mLチューブに保存します。
   メモ:フォーリーカテーテルに接続された排水袋から尿を収集します。
4. 尿の出力を決定するには、排水袋を空にし、1時間尿を収集します。
   注:排水袋がフォーリーカテーテルに接続されていない6時間のタイムポイントについては、フォーリーカテーテルに接続されたチューブを30分間閉じ、60 mLの注射器で尿を採取して尿の出力を決定します。

6. 安楽死

1. 再灌流期間の終了後、上記のように麻酔およびモニタを行う。
2. 5 mL/kg/hで0.9%NaClで水分補給を継続します。
3. 血液採取には動脈カテーテルと静脈カテーテルを使用し、フォーリーカテーテルを使用して尿の出力を決定します。最終的な血液と尿のサンプルを収集し、尿の出力を計算します。
4. シフォイドから中骨盤までのサイズ10ブレードを使用して、15cmの中腹腔切開を行います。
5. 腹部の皮膚を引っ込めるためにまっすぐな横のレトラクターを使用しなさい。
6. 腹壁の腹膜の横部の付着を解剖し、右および左の後腹膜を露出する。
7. 腎動脈と静脈の両方を識別し、ぶっきらぼうに解剖する。
8. 2-0シルク縫合糸で腎動脈と静脈の両方をリゲートし、組織学的および代謝分析のために組織全体の標本を収集するために両側腎切除を行う。
9. 安楽死の好ましい方法で動物を安楽死させる(例えば、排泄、ペントバルビタール)

結果

関数解析
この研究の代表的な結果は6匹の動物から生じ、示されたデータは平均±平均の標準誤差である。腎機能は、尿の出力、推定糸球体濾過率(eGFR)、血漿クレアチン、および血液尿素窒素(BUN)を決定することによって評価される。腎機能のバイオマーカーは、ポータブル化学分析装置を用いて評価される。eGFR は次の式に従って計算されます: eGFR =1.879 × BW^1.092/P_Cr<...

ディスカッション

AKIは、世界中の入院成人患者の最大50%に影響を及ぼす一般的な臨床障害^{である6,12}.臨床的に関連する動物モデルは、疾患の病態生理学および潜在的な治療標的をさらに調査するために必要である。AKIを複製するいくつかのマウスモデルがありますが、これらはそれぞれの臨床シナリオと人間の腎臓の解剖学を完全に模倣していません。本研究は、ヒ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container	Baxter	2B1302	For animal hydration
Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74%	CARDINAL HEALTH	133311	For visualizing the vasculature
Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag	BARD Inc	802001	For urine collection
BD Vacutainer K2 EDTA	BD	367841	For blood sample storage
BD Vacutainer Lithium Heparin	BD	366667	For blood sample storage
Betadine	Henry Schein	6906950	For skin disinfection
Bookwalker retractor	Codman		For skin retraction
Bupivacaine 0.25%	Hospira		Administer at incision site for analgesia
Buprenorphine SR	Zoo Pharm		10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC
Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	7523-21	For identification of the renal arteries
Cuffed endotracheal tube	Emdamed		To establish a secure airway for the duration of the operation
EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor	GE Healthcare Madison WI		For oxygen saturation monitoring
Encore 26 inflator	BOSTON SCIENTIFIC	710113	For inflating the balloon catheters
Ethanol 95% (Ethyl alcohol)	Henry Schein		For skin disinfection
Fentanyl patch	Mylan		Dose: 25-50mcg/hr, TD
Gold silicone coated Foley	TELEFLEX MEDICAL INC	180730160	For urine collection
Heparin sodium	LEO Pharma A/S		Dose: 200 IU/kg IV
i33 ultrasound machine	Phillips		Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary
Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	6609-33	For guiding the balloon catheters to the renal arteries
Intravenous catheter, size 20 gauge	Santa Cruz Biotechnology	Inc SC-360097	For fluid administration
Isoflurane	Patterson Veterinary Supply, Inc.	21283620	Dose: 3%, INH
Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)"	Rudolf Medical	RU-1311-14M	For tissue dissection and cutting
Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring	Argon Medical	041588505A	For pressure measurement
Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm)	CARDINAL HEALTH	4400602X	For occlusion of the renal arteries
Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll	Smiths Medical	B1571/MX571	For pressure measurement
Procedure pack	Molnlycke Health Care	97027809	Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc
Protamine	Henry Schein	1044148	For heparin reversal
Scalpel blade - size #10	Cardinal Health (Allegiance)	32295-010	For the skin incisions
Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl	Peoplesoft	1550	For connecting tubings
Straight lateral retractor	Codman		For skin retraction
Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk	CARDINAL HEALTH 1	A185H	For suturing incision site and securing catheters
Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	MSS111-R	To administer the contrast agent
Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp	CARDINAL HEALTH 1	BF309653	For urine collection and flushing of the angiocath
Tilzolan (tiletamine/zolazepam)	Patterson Veterinary Supply, Inc.	07-893-1467	Dose: 4-6 mg/kg, IM
Xylazine	Putney, INC		Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM