Un modello animale di grandi dimensioni per lesioni renali acute da occlusione temporanea bilaterale dell'arteria renale

Riepilogo

Questo studio presenta un modello animale di grandi dimensioni altamente riproducibile di lesione renale ischemia-riperfusione nei suini utilizzando occlusione bilaterale percutanea percutanea palloncino-catetere delle arterie renali per 60 minuti e riperfusione per 24 ore.

Abstract

La lesione renale acuta (AKI) è associata a un rischio più elevato di morbilità e mortalità post-operatoria. La lesione da ischemia-riperfusione (IRI) è la causa più comune di AKI. Per imitare questo scenario clinico, questo studio presenta un modello animale di grandi dimensioni altamente riproducibile di IRI renale nei suini utilizzando un'occlusione bilaterale temporanea percutanea palloncino-catetere delle arterie renali. Le arterie renali sono occluse per 60 minuti introducendo i cateteri a palloncino attraverso l'arteria femorale e carotide e avanzandoli nella porzione prossimale delle arterie. Il contrasto iodinato viene iniettato nell'aorta per valutare eventuali opacifica dei vasi renali e confermare il successo dell'occlusione dell'arteria. Ciò è ulteriormente confermato dall'appiattimento della forma d'onda dell'impulso sulla punta dei cateteri a palloncino. I palloncini vengono sgonfiati e rimossi dopo 60 minuti di occlusione bilaterale dell'arteria renale e gli animali possono riprendersi per 24 ore. Alla fine dello studio, la creatinina plasmatica e l'azoto urea nel sangue aumentano significativamente, mentre l'eGFR e la produzione di urina diminuiscono significativamente. La necessità di contrasto iodinato è minima e non influisce sulla funzione renale. L'occlusione bilaterale dell'arteria renale imita meglio lo scenario clinico dell'ipoperfusione renale perioperatoria e l'approccio percutaneo riduce al minimo l'impatto della risposta infiammatoria e il rischio di infezione visto con un approccio aperto, come una laparotomia. La capacità di creare e riprodurre questo modello suino clinicamente rilevante facilita la traduzione clinica all'uomo.

Introduzione

La lesione renale acuta (AKI) è una condizione comunemente diagnosticata tra i pazienti chirurgici associati a morbilità^{e mortalità significative 1,2}. I dati disponibili mostrano che l'AKI può colpire anche la metà di tutti i pazienti ricoverati in tutto il mondo e porta al tasso di mortalità del 50% nei pazienti nell'unità di terapia^{intensiva 1,3}. Nonostante la sua elevata prevalenza, l'attuale terapia AKI rimane limitata alle strategie preventive, come la gestione dei fluidi e la dialisi. Pertanto, c'è un interesse costante nell'esplorare terapie alternative per AKI^4,5,6.

L'AKI è tipicamente classificato in pre-renale, intrinseco e post-renale in base alla sua^{eziologia 4,5,6}. La maggior parte dei pazienti chirurgici con AKI sono associati a cause pre-renali dovute all'ipovolemia, con conseguente lesione da ischemia-riperfusione (IRI) dei reni². Clinicamente, la produzione di urina diminuisce e i livelli di creatinina aumentano a causa della diminuzione della funzione renale. Il rene è un organo ad alto tasso metabolico e suscettibile all'ischemia. Un modello animale di grandi dimensioni altamente riproducibile di IRI renale è necessario per ottenere una migliore comprensione della fisiopatologia dell'AKI e dei suoi potenziali approcci terapeutici⁵.

Per imitare lo scenario clinico dell'ipoperfusione renale peri-operativamente, si ritiene opportuno un modello di occlusione bilaterale dell'arteria renale. I modelli precedentemente descritti che comportano un'occlusione unilaterale dell'arteria renale con o senza resezione del rene contralaterale non forniscono un'applicabilità^{clinica sufficiente 7,8}. Sebbene questi modelli siano sufficienti per causare L'AKI, non assomigliano a scenari clinici reali né in termini di tipo né di durata della lesione.

Lo scopo di questo documento è quello di presentare un modello porcino di occlusione temporanea bilaterale percutanea delle arterie renali mediante occlusione palloncino-catetere sotto angiografia. L'occlusione bilaterale dell'arteria renale imita lo scenario clinico dell'ipoperfusione renale, seguita dalla successiva rimozione del palloncino per la riperfusione^9,10. Vengono descritti i passaggi tecnici, tra cui cateterizzazione, guida del catetere, angiografia e monitoraggio emodinamico. Questo metodo non solo consente un'occlusione altamente controllata e replicabile delle arterie renali, ma l'approccio percutaneo riduce al minimo l'impatto della risposta infiammatoria limitando la quantità di insulto al corpo rispetto a un approccio aperto.

Protocollo

Tutti gli studi in vivo sono stati condotti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health sulla cura e l'uso degli animali e sono stati approvati dal Boston Children's Hospital's Animal Care and Use Committee (Protocol 18-06-3715). Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane nel rispetto della Guida alla cura e all'uso degli animali da laboratorio. La figura 1 mostra la sequenza temporale, tra cui anestesia, preparazione chirurgica e punti di tempo per le misurazioni dei risultati primari di questo studio.

1. Induzione, anestesia e intubazione

1. Per evitare stress e disagio inutili, sedare il maiale per iniezione intramuscolare di una miscela di tiletamina/zolazepam 4-6 mg/kg e xiazina 1,1-2,2 mg/kg, nonché isoflurane 3% con una maschera facciale.
2. Cannucolare la vena udita per ottenere l'accesso venoso con una cannula 20 G IV dopo aver disinfettato l'area con il 95% di etanolo. Avviare un'infusione di manutenzione (0,9% NaCl a 5 mL/kg/h).
3. Intubare il maiale con un tubo endotracheale (taglia 7 per suini del peso di 40-50 kg) una volta confermata l'adeguatezza anestetica. Eseguire la ventilazione a palloncino con una frequenza di 12 respiri / min e trasportare il maiale in sala operatoria.
4. Posizionare l'animale sul tavolo operatorio in posizione supina. Avviare immediatamente la ventilazione meccanica a pressione positiva con FiO₂ 0,50, 10 mL /kg di volume mareale e una frequenza di 12 respiri/min sotto capnografia continua.
5. Posizionare un pulsossimetro sull'orecchio o sul labbro inferiore per un monitoraggio continuo.
6. Mantenere la normotermia (37 °C) utilizzando un cuscinetto riscaldato ad aria.
7. Per mantenere l'anestesia generale, mantenere la somministrazione di isoflurane allo 0,5-4% attraverso il tubo endotracheale. Durante tutta la procedura, monitorare continuamente ECG, pressione arteriosa, temperatura e capnografia per misurare la profondità dell'anestesia.
8. Inserire un catetere Foley per controllare lo stato del fluido dell'animale e monitorare l'uscita delle urine raccogliendo l'urina in un sacchetto di drenaggio.
   NOTA: Le femmine di suini sono preferite ai maschi a causa delle caratteristiche anatomiche della loro uretra che consente una più facile cateterizzazione.

2. Preparazione chirurgica e accesso vascolare

1. Drappeggia l'animale in modo sterile.
2. Disinfettare l'area laterale destra del collo applicando betadina e quindi 95% di etanolo per 3 volte.
3. Eseguire un taglio per la cateterizzazione dell'arteria carotidea destra e della vena giugulare destra. Ritrarre lateralmente il muscolo sternocleidomastoide e sezionarlo fino all'arteria carotidea destra e alla vena giugulare destra.
4. Inserire una toria angioografica 5F sia nell'arteria che nella vena. Fissalo con una sutura 2-0 di seta.
5. Inserire una toria angioografica 5F utilizzando la tecnica Seldinger nell'arteria femorale sinistra.
   1. Per eseguire la tecnica Seldinger forare l'arteria femorale usando un ago cavo. Inserire una punta morbida guidare attraverso il lume e far avanzare nell'arteria femorale.
   2. Tenere il filo guida sicuro con la mano mentre si rimuove l'ago. Passa la torcia angiografia sopra il filo guida nell'arteria femorale e ritira il filo guida. Utilizzare la guida ecografiche, se necessario.

3. Induzione di ischemia renale-lesione da riperfusione

1. Somministrare 200 UI/kg di eparina di sodio per via endovenosa per ottenere l'anticoagulazione sistemica (tempo di coagulazione attivato dal bersaglio (ACT) > 300 s).
2. Eseguire un'angiografia iniettando un agente di contrasto iodinato sotto fluoroscopia per identificare le arterie renali.
   NOTA: Per ridurre il rischio di nefrotossicità indotta dal contrasto, diluire l'agente di contrasto iodinato in una soluzione 1:1 con soluzione salina normale. Tabulare il dosaggio per tutti gli animali per garantire un dosaggio equivalente.
3. Identificare le arterie renali, far avanzare manualmente il filo guida nel catetere guida.
4. Posizionare il catetere guida 5F JL4 nell'arteria renale sinistra attraverso l'arteria carotidea destra (Figura 1A).
5. Posizionare il secondo catetere guida 5F JL4 nell'arteria renale destra attraverso l'arteria femorale sinistra (Figura 1A).
6. Utilizzare i guidewires per dirigere un catetere di dilatazione dell'angioplastica transluminale percutanea 5F (PTA) in ogni arteria renale.
   NOTA: È preferibile posizionare il palloncino sull'arteria renale prossimale in modo che nessun ramo o collaterale dell'arteria renale sia lasciato brevetto dopo l'inflazione del palloncino.
7. Posizionare ogni catetere a palloncino in posizione e collegare una linea di pressione a ciascun catetere.
8. Controllare la presenza di forme d'onda dell'impulso arterioso nel monitor di pressione per garantire il corretto posizionamento del catetere.
9. Gonfiare ogni palloncino e mirare a una pressione di circa 2,5 atm all'interno del palloncino (Figura 1B).
10. Per confermare la cessazione del flusso sanguigno ai reni osservare l'appiattimento della forma d'onda del polso sulla punta del catetere a palloncino.
11. Iniettare un mezzo di contrasto iodinato (diluizione 1:1) e verificare la presenza di eventuali opacizzazioni dei vasi renali.
    NOTA: È anche possibile riempire il palloncino con un agente di contrasto iodinato per la visualizzazione del palloncino gonfiato. Tuttavia, questo metodo non è così sensibile come l'appiattimento della forma d'onda dell'impulso per confermare l'occlusione delle arterie renali.
12. Dopo 60 minuti di occlusione, sgonfiare e rimuovere accuratamente i cateteri a palloncino dalle arterie renali.
13. Eseguire un'angiografia (utilizzando un mezzo di contrasto diluito 1:1) per confermare la persistenza dell'arteria renale e la creazione di una riperfusione renale(Figura 1C).
14. Rimuovere la toria angioografica 5F dall'arteria femorale sinistra.
15. Applicare una pressione ferma nel sito di cateterizzazione per 30 minuti.
16. Invertire l'effetto dell'eparina mediante somministrazione di protamina (3 mg/kg) fino a quando ACT non si normalizza.
17. Per campionare l'urina durante il periodo post-operatorio, fissare un tubo al catetere Foley con una sutura di seta 2-0 usando un punto interrotto sulla pelle.
18. Lasciare le suonerie angioografiche nell'arteria carotidea destra e la vena giugulare destra in posizione e fissarle con una sutura di seta 2-0 utilizzando un punto interrotto per consentire il prelievo del sangue durante lo studio.
19. Chiudi l'incisione del collo con una sutura di seta 2-0 usando un punto continuo in 2 strati.
20. Somministrare bupivacaina (3 mg/kg) nel sito di incisione per ridurre al minimo il dolore.
21. Continuare a idratare l'animale con 0,9% nacl a 5 mL/kg/h per un totale di 2 ore dopo la fine dell'ischemia.
22. Posizionare una macchia di fentanil (25-50 μg/h) sul retro dell'animale per ridurre al minimo il dolore post-operatorio.
23. Somministrare un'iniezione intramuscolare di buprenorfina (0,005-0,1 mg/kg) per ridurre al minimo il dolore post-operatorio.
24. Monitorare l'animale e mantenerlo sulla ventilazione meccanica fino al risveglio.

4. Recupero degli animali

1. Dopo il risveglio, ospitare l'animale in una stanza a temperatura controllata.
2. Continua a trasformare l'animale da un lato laterale all'altro fino a quando non riacquista piena coscienza e capacità di ambulare.
3. Fornire acqua e cibo ad libitum.

5. Valutazione funzionale

1. Raccogliere il sangue e i campioni di urina secondo il protocollo desiderato.
   NOTA: In questo studio sono stati designati i seguenti punti di tempo: basale (1 h dopo l'inizio del protocollo di idratazione e prima dell'occlusione delle arterie renali), fine dell'ischemia e riperfusione (2 h, 6 h, 24 h).
2. Raccogliere i campioni di sangue arterioso e venoso. Conservarli in eparina di litio o vacutainer rivestiti con EDTA per un'analisi successiva.
   NOTA: Eleva il sangue direttamente dai cateteri nell'arteria carotide e nella vena giugulare.
3. Raccogliere i campioni di urina dal catetere Foley e conservarli in tubi da 15 ml per l'analisi.
   NOTA: Raccogliere l'urina dal sacchetto di drenaggio collegato al catetere Foley.
4. Per determinare la produzione di urina, svuotare il sacchetto di drenaggio e raccogliere l'urina per 1 h.
   NOTA: Per il momento di 6 ore in cui un sacchetto di drenaggio non è collegato al catetere Foley, chiudere il tubo collegato al catetere Foley per 30 minuti e quindi raccogliere l'urina con una siringa da 60 ml per determinare la produzione di urina.

6. Eutanasia

1. Dopo la fine del periodo di riperfusione, eseguire l'anestesia e monitorare come descritto sopra.
2. Continuare l'idratazione con 0,9% NaCl a 5 mL/kg/h.
3. Utilizzare i cateteri arterioso e venoso per il prelievo del sangue e il catetere Foley per determinare la produzione di urina. Raccogliere i campioni finali di sangue e urine e calcolare l'uscita delle urine.
4. Eseguire un'incisione di laparotomia della linea mediana di 15 cm utilizzando una lama di dimensioni 10 dallo xifoide fino al bacino medio.
5. Utilizzare un retrattile laterale dritto per ritrarre la pelle addominale.
6. Sezionare gli attacchi peritoneali laterale della parete addominale per esporre il retroperitoneo destro e sinistro.
7. Identificare e sezionare senza mezzi termini sia le arterie renali che le vene.
8. Ligate sia arterie renali che vene con una sutura di seta 2-0 ed eseguire nefromie bilaterali per raccogliere campioni di tessuto intero per l'analisi istologica e metabolica.
9. Eutanasia dell'animale con il metodo preferito di eutanasia (ad esempio, esanguinamento, pentobarbital)

Risultati

Analisi funzionale
I risultati rappresentativi di questo studio provengono da 6 animali e i dati mostrati sono ± errore standard della media. La funzione renale viene valutata determinando la produzione di urina, il tasso di filtrazione glomerulare stimato (eGFR), la creatina plasmatica e l'azoto urea nel sangue (BUN). I biomarcatori della funzione renale sono valutati utilizzando un analizzatore di chimica portatile. l'eGFR è calcolato secondo la seguente formula: eGFR =1,879 × BW^1,092/...

Discussione

L'AKI è un disturbo clinico comune che colpisce fino al 50% dei pazienti adulti ricoverati in tutto^{il mondo 6,12}. È necessario un modello animale clinicamente rilevante per indagare ulteriormente la fisiopatologia della malattia e potenziali obiettivi terapeutici. Sebbene ci siano diversi modelli murini che replicano l'AKI, questi non imitano completamente i rispettivi scenari clinici e l'anatomia del rene umano. Questo studio propone un modello suino clinicame...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride injection, usp, 100 ml viaflex plastic container	Baxter	2B1302	For animal hydration
Agent contrast 100.0ml injection media btl ioversal 74%	CARDINAL HEALTH	133311	For visualizing the vasculature
Bard Bardia Closed System Urinary Drainage Bag	BARD Inc	802001	For urine collection
BD Vacutainer K2 EDTA	BD	367841	For blood sample storage
BD Vacutainer Lithium Heparin	BD	366667	For blood sample storage
Betadine	Henry Schein	6906950	For skin disinfection
Bookwalker retractor	Codman		For skin retraction
Bupivacaine 0.25%	Hospira		Administer at incision site for analgesia
Buprenorphine SR	Zoo Pharm		10mg/ml bottle, Dose: 0.2mg/kg SC
Cath angio 5.0 Fr x100.0 cm 0.038 in JR4	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	7523-21	For identification of the renal arteries
Cuffed endotracheal tube	Emdamed		To establish a secure airway for the duration of the operation
EKG Medtronics- Physiocontrol LifePak 20 Oxygen saturation monitor	GE Healthcare Madison WI		For oxygen saturation monitoring
Encore 26 inflator	BOSTON SCIENTIFIC	710113	For inflating the balloon catheters
Ethanol 95% (Ethyl alcohol)	Henry Schein		For skin disinfection
Fentanyl patch	Mylan		Dose: 25-50mcg/hr, TD
Gold silicone coated Foley	TELEFLEX MEDICAL INC	180730160	For urine collection
Heparin sodium	LEO Pharma A/S		Dose: 200 IU/kg IV
i33 ultrasound machine	Phillips		Use ultrasonographic guidance for femoral catherization if necessary
Inqwire diagnostic guide wire - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm j-tip	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	6609-33	For guiding the balloon catheters to the renal arteries
Intravenous catheter, size 20 gauge	Santa Cruz Biotechnology	Inc SC-360097	For fluid administration
Isoflurane	Patterson Veterinary Supply, Inc.	21283620	Dose: 3%, INH
Metzenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)"	Rudolf Medical	RU-1311-14M	For tissue dissection and cutting
Neonatal disposable transducer kit with 30ml/hr flush device and double 4-way stopcocks for continuous monitoring	Argon Medical	041588505A	For pressure measurement
Powerflex pro PTA dilatation catheter 6 x 20 mm - shaft length (135cm)	CARDINAL HEALTH	4400602X	For occlusion of the renal arteries
Pressure monitoring lines mll/mll - 12" clear, mll/mll	Smiths Medical	B1571/MX571	For pressure measurement
Procedure pack	Molnlycke Health Care	97027809	Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc
Protamine	Henry Schein	1044148	For heparin reversal
Scalpel blade - size #10	Cardinal Health (Allegiance)	32295-010	For the skin incisions
Stopcock iv 4 way lrg bore rotg male ll adptr strl	Peoplesoft	1550	For connecting tubings
Straight lateral retractor	Codman		For skin retraction
Suture perma hnd 18in 2-0 braid silk blk	CARDINAL HEALTH 1	A185H	For suturing incision site and securing catheters
Syringe contrast injection 10ml fixed male luer red	MERIT MEDICAL SYSTEM INC	MSS111-R	To administer the contrast agent
Syringe medical 60ml ll plst strl ltx free disp	CARDINAL HEALTH 1	BF309653	For urine collection and flushing of the angiocath
Tilzolan (tiletamine/zolazepam)	Patterson Veterinary Supply, Inc.	07-893-1467	Dose: 4-6 mg/kg, IM
Xylazine	Putney, INC		Dose: 1.1-2.2 mg/kg, IM