JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه المقالة طريقة موثوقة وبسيطة للحصول على شرائح عرضية حادة للحصين خارج الجسم الحي من الفئران والجرذان باستخدام مروحية الأنسجة. يمكن تقديم الشرائح التي تم الحصول عليها من الحصين المقطوعة لتحليل امتصاص الغلوتامات الوظيفي للتحقيق في توازن نظام الجلوتاماتيرج.

Abstract

تعد إزالة الغلوتامات من الفضاء خارج الخلية بواسطة الناقلات المعتمدة على Na + عالية التقارب أمرا ضروريا لضمان عمل آليات الاتصال الجوهرية للدماغ بشكل صحيح والحفاظ على التوازن. الحصين هو بنية دماغية فريدة تدير الوظائف المعرفية العليا ، وهي موضوع العديد من الدراسات المتعلقة بالأمراض العصبية. يمكن أن يستفيد التحقيق في الآليات الفسيولوجية والمرضية في نماذج القوارض من مستحضرات شريحة الحصين الحادة (AHS). تتميز AHS بتوفير معلومات موثوقة عن وظيفة الخلية حيث يتم الحفاظ على الهندسة الخلوية والدوائر المشبكية. على الرغم من أن مستحضرات AHS شائعة الاستخدام في مختبرات الكيمياء العصبية ، إلا أنه من الممكن العثور على بعض الاختلافات المنهجية في الأدبيات. بالنظر إلى أن بروتوكولات تحضير الشريحة المميزة قد تغير مناطق الحصين التي تم تحليلها ، يقترح هذا البروتوكول الحالي تقنية قياسية للحصول على AHS عرضية من الحصين المقطوعة. يمكن استخدام هذا البروتوكول سهل الأداء في النماذج التجريبية للفئران والجرذان ويسمح بالعديد من الأساليب خارج الجسم الحي للتحقيق في الديناميكيات الكيميائية العصبية (في الحصين الظهري والمتوسط والبطني) في خلفيات مختلفة (على سبيل المثال ، التلاعب المعدلة وراثيا) أو بعد التلاعب في الجسم الحي (على سبيل المثال ، العلاجات الدوائية أو نماذج القوارض المناسبة لدراسة الاضطرابات السريرية). بعد تشريح الحصين من دماغ القوارض ، تم الحصول على شرائح عرضية على طول المحور الحاجز الصدغي (بسمك 300 ميكرومتر). تحتوي AHS هذه على أجزاء مميزة من الحصين وتعرضت لفحص كيميائي عصبي فردي (على سبيل المثال: ناقلات الناقل العصبي باستخدام ركائزها الخاصة). نظرا لأن الحصين يقدم كثافة عالية من المشابك المثيرة ، والغلوتامات هي أهم ناقل عصبي في الدماغ ، فإن نظام الجلوتاماتيرجيك هو هدف مثير للاهتمام للظواهر المرصودة في الجسم الحي. وبالتالي ، يوفر البروتوكول الحالي خطوات مفصلة لاستكشاف امتصاص الغلوتامات في AHS خارج الجسم الحي باستخدام L-[3H]-Glutamate. قد يساعد استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في وظيفة الحصين على فهم أفضل لتأثير استقلاب الغلوتامات على آليات الحماية العصبية أو السمية العصبية.

Introduction

الحصين ، وهو هيكل دماغي مدفون بعمق في الفص الصدغي الإنسي لكل نصف كرة ، حيث توجد الوظائف المعرفية العالية ، هو أحد أكثر الكيانات التي تمت دراستها في الجهاز العصبي المركزي (CNS). ترتبط وظيفة الحصين ارتباطا وثيقا بالذاكرة التصريحية والمكانية. يلعب هذا الهيكل أيضا دورا في السلوك العاطفي وفي تنظيم وظائف ما تحت المهاد1،2،3،4. منذ أن تم تأكيده ، تحدث آليات مهمة لتكوين الذاكرة وتخزينها في هذه المنطقة وبدأ المجال في التحقيق بعمق في منطقة الحصين. وفقا لذلك ، يستمر استخدام النماذج الحيوانية التي تشبه الاضطرابات الدماغية البشرية المتعلقة بوظائف الحصين ، مثل مرض الزهايمر والصرع والاكتئاب الشديد والإجهاد.

في القوارض ، الحصين عبارة عن هيكل منحني الشكل يبدأ من بالقرب من الحاجز الإنسي باتجاه القشرة الصدغية البطنية. على طول محوره الطولي ، يمكن تقسيم الحصين إلى ثلاث مناطق مختلفة ، كل منها مرتبط بدائرة معينة1. يشكل الجزء العلوي الحصين الظهري / الحاجز ، ويشكل الجزء السفلي الحصين البطني / الصدغي ، وتعتبر المنطقة بينهما الحصين الوسيط. هناك أدبيات واسعة تغطي الاختلافات في الإسقاطات الخلوية لكل جزء ، بالإضافة إلى تقارير عن الجوانب المعرفية المحددة التي تمت معالجتها بواسطة كل5،6. فيما يتعلق بتنظيمها الداخلي ، يمكن فصل مناطق الحصين عن طريق مناطقها الوظيفية. تنقسم منطقة Cornu ammonis (CA) إلى CA1 و CA2 و CA3 وتمتد عبر الجزء العلوي من الحصين ، فوق التلفيف المسنن (DG) والجزء الفرعي ، وهما أكثر أجزاء الحصين الداخلية (الشكل 1). تخضع نقاط الاشتباك العصبي الموجودة في هذه المناطق لإعادة ترتيب مستمرة ، مما يدل على عمليات عصبية وبلاستيكية طوال الحياة3. أظهرت العديد من الدراسات بالفعل أن التلاعب التجريبي المتميز في الحصين يؤدي إلى إعاقة معرفية7. فيما يتعلق بتقييم التعديلات البيوكيميائية والجزيئية ، تعد التقنيات التي تستخدم شرائح الدماغ الحادة أداة ممتازة لتحسين المعرفة المتعلقة بالجوانب المختلفة للحصين.

نظرا لدقتها وقابليتها للتكاثر ، استخدمت العديد من الدراسات التي استكشفت جوانب الظواهر المتعلقة بالنقل العصبي (نشاط الإنزيم أو امتصاصه أو إطلاقه) AHS عرضيا من الحصين المقطوعة الذي تم الحصول عليه بواسطة مروحية الأنسجة8،9،10،11،12. تقنية التقطيع هذه متبوعة بتقييم الامتصاص مناسبة للتجارب الكيميائية العصبية المعقدة التي تتطلب الحفاظ على نشاط الناقل من أنسجة الحصين. لذلك ، يفضل استخدام مروحية الأنسجة ، لأنها أسرع من الاهتزاز وتوفر AHS في الوقت المناسب للاستخدام التجريبي بدقة مناسبة.

يتم تحقيق النقل العصبي الاستثاري في الدماغ بواسطة الغلوتامات ، وهو الناقل العصبي الأكثر وفرة ، بما في ذلك الحصين ، والذي يعتمد على إشارات الغلوتامات إلى حد كبير13،14. يتم التحكم في وفرة الناقل العصبي بإحكام في البيئة خارج الخلية. ومع ذلك ، يمكن أن تصل إلى 100 ملي مولار15 داخل الحويصلات داخل الخلايا. بمجرد إطلاقه في الشق المشبكي ، لا يتم استقلاب الغلوتامات ويحتاج إلى إزالته لتجنب السمية المثيرة ، وعادة ما يتم تشغيله استجابة للحمل الزائد من الغلوتامات14،16. الآلية الوحيدة التي تفصل السمية عن الإشارات العادية هي النقل المعتمد على الصوديوم من خلال نشاط البروتينات الموجودة في أغشية البلازما للخلايا الدبقية14،17،18،19. تنظم هذه الناقلات [GLAST (EAAT1) و GLT-1 (EAAT2)] مستويات الغلوتامات خارج الخلية بإحكام ويمكن تعديلها بواسطة مجموعة واسعة من العوامل ، مثل نسخ الحمض النووي ، وتضفير الحمض النووي الريبي المرسال وتدهوره ، وتخليق البروتين واستهدافه ، ونشاط نقل الأحماض الأمينية ، وأنشطة القناة الأيونية20،21،22،23. وفقا لذلك ، يمكن قياس نشاطها عن طريق نقل الركيزة ذات العلامات الإشعاعية ، مثل الغلوتامات.

يمثل استخدام الركائز ذات العلامات الإشعاعية طريقة مفضلة لقياس نشاط الناقل لأنها تسمح بتتبع الآليات الديناميكية مثل النقل عبر أغشية الخلايا. إلى جانب حساسيتها العالية وخصوصيتها ، تشمل مزايا تجارب التتبع الإشعاعي بساطتها ونفقاتها الصغيرة مقارنة بالتقنيات المنافسة مثل قياس الطيفالكتلي 24. أيضا ، باستخدام كميات صغيرة فقط من التتبع ، لا يتم تغيير المستويات الفسيولوجية للركائز ، مما يوفر صورة أكثر تمثيلا لسيناريو النشاط الأيضي الحقيقي.

يعد توافر الأساليب التجريبية خارج الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية لدعم البحث الأساسي حول تحديد الأهداف الجزيئية الجديدة وأنشطة اكتشاف الأدوية. وبالتالي ، بالنظر إلى أهمية امتصاص الغلوتامات لتوازن نظام الجلوتامات والغلبة العالية للمشابك الجلوتاميتية في الحصين ، يوضح هذا البروتوكول كيفية تقييم نشاط امتصاص الغلوتامات بطريقة سريعة وسهلة التكاثر باستخدام AHS عرضية من الحصين المقطوعة. يستخدم هذا الاختبار L- [3H]-Glutamate المسمى بالإشعاع ، والذي يسمح بإجراء مقارنات كمية وتصور واضح للنتائج ، ويمكن تعديله للاستخدام مع ركائز محددة أو مخصصة ، على نطاق واسع من ظروف التفاعل25.

تقدم شرائح الدماغ الحادة العديد من المزايا وقد تم استخدامها لدعم تغيير الوظيفة في ظل التلاعب الدوائي والجيني26،27،28. يستفيد استخدامها مما يلي: (أنا) الحفاظ على الوظائف الكيميائية العصبية والتفاعلات من خلية إلى خلية. (2) إمكانية إجراء العديد من التلاعبات الدوائية والوراثية للتحقيق في المسارات الكامنة وراء وظائف الخلايا العصبية والدبقية ؛ (3) التحكم الدقيق في البيئة خارج الخلية. و (رابعا) الوصول التجريبي الجيد إلى مناطق الحصين المختلفة (مثل CA1 أو CA3 أو DG) ، والتي يتم الاحتفاظ بها في نفس الشريحة اعتمادا على طريقة التقطيع. بالنظر إلى أن بروتوكولات تحضير الشريحة المميزة قد تغير مناطق الحصين المكشوفة ، يقترح هذا البروتوكول تقنية قياسية للحصول على AHS عرضي من الحصين المقطوع. يمكن استخدام هذا البروتوكول سهل الأداء في نماذج القوارض وقد يسمح بالعديد من مناهج خارج الجسم الحي للتحقيق في الديناميكيات الكيميائية العصبية في خلفيات مختلفة أو بعد التلاعب في الجسم الحي29،30 (الشكل 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (موافقة المشروع # 33732 / CEUA-UFRGS). تم بذل كل الجهود لتقليل الانزعاج وعدد المستخدمة في التجارب.

1. تحضير محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS)

  1. في دورق سعة 1 لتر ، أضف ما يقرب من 0.5 لتر من الماء المعقم أو المقطر المزدوج وابدأ في التقليب بقوة على محرك مغناطيسي. أضف مكونات HBSS التالية (بالملليمتر): 137 كلوريد الصوديوم ، 0.63 Na2HPO4 ، 4.17 NaHCO3 ، 5.36 KCl ، 0.44 KH2PO4 ، 0.41 MgSO4 ، 0.49 MgCl2 ، 5.55 D-Glucose (انظر الجدول 1).
  2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك قبل إضافة 1.26 ملي مولار CaCl2 لتجنب هطول الأمطار. أضف هذا الملح ببطء شديد وتحت التحريض. ارفع حجمه إلى 1 لتر بالماء المعقم أو المقطر المزدوج. سيتم استخدام هذا المخزن المؤقت لغسل الأنسجة والحفاظ على AHS في حالة قابلة للحياة أثناء التجربة. سيوفر أيونات غير عضوية مع الحفاظ على درجة الحموضة الفسيولوجية والضغط الاسموزي.
    ملاحظة: تتم إضافة الكاتيونات ثنائية التكافؤ بعد معايرة الأس الهيدروجيني لتجنب هطول الأمطار.
  3. افصل بين جزأين مختلفين من HBSS: أحدهما سيبقى في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ويستخدم أثناء نموذج الامتصاص ، بينما سيبقى الآخر باردا (4 درجات مئوية) ويستخدم للغسيل قبل التجربة وبعدها.
    ملاحظة: من الممكن تحضير محاليل المرق من كل ملح وإبقائها مجمدة حتى الاستخدام ، وتخزينها في الفريزر (-20 درجة مئوية) واستخدامها في غضون أسابيع قليلة.

2. تحضير HBSS خالية من الصوديوم

  1. قبل خلط مكونات HBSS الخالي من الصوديوم ، قم بإعداد حلين آخرين مسبقا: الجلوكامين - حمض الهيدروكلوريك (137 ملم) والجلوكامين - هيبس (4.17 ملليمتر). امزج تركيزات متساوية المولار من قاعدة NMDG و HCl للحصول على محلول الجلوكامين-HCl. قم بنفس الإجراء مع حمض 2.0 M HEPES الخالي للحصول على محلول NMDG-HEPES (انظر الجدول 2).
  2. في دورق سعة 0.5 لتر ، أضف حوالي 0.2 لتر من الماء المعقم أو المقطر المزدوج وابدأ في التقليب بقوة في محرك مغناطيسي. أضف المكونات العازلة التالية (بالمللي مولار): 137 الجلوكامين-حمض الهيدروكلوريك ، 4.17 الجلوكامين-هيبس ، 5.36 كيلوكلوريد اللور، 0.44 كيلو ساتلون2PO4 ، 1.26 MgSO4 ، 0.41 MgCl2 ، و 5.55 D-Glucose (انظر الجدول 2).
  3. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام KOH أو HCl واستمر في التقليب. أضف 1.26 ملي CaCl2 ببطء شديد وتحت التحريض. ارفع حجم المحلول إلى 0.3 لتر بالماء المعقم أو المقطر المزدوج.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذا المخزن المؤقت لقياس امتصاص الغلوتامات غير المعتمد على الصوديوم ، مما سيسمح بقياس امتصاص الغلوتامات السلبي / غير النوعي. بعد التجربة ، يتم طرح هذه المعلمة من إجمالي امتصاص الغلوتامات لتحديد امتصاص الصوديوم.
  4. بعد التحضير ، يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت في الفريزر (-20 درجة مئوية) واستخدامه بعد ذلك في التجارب اللاحقة. الشيء نفسه ينطبق على حلول NMDG.
  5. أثناء التجربة ، حافظ دائما على ثلج HBSS الخالي من الصوديوم.

3. تنظيم المواد لتشريح الحصين من الفئران

  1. قم بتنظيم منطقة التشريح بجوار الحوض قبل بدء التجربة. ضع مقصلة محددة للفئران (بالنسبة للفئران ، سيكون من الممكن استخدام مقص حاد) في الحوض للحفاظ على نظافة المقعد.
  2. رتب الأدوات الجراحية والمواد الأخرى لإزالة الدماغ وتسلخ الحصين بترتيب الاستخدام وفي أقرب مكان ممكن من المكان المطلوب (انظر جدول المواد). ضع طبق بتري في دلو ثلج. احتفظ أيضا بكيس بلاستيكي في مكان قريب للتخلص من الذبيحة.
  3. تحضير كل من محلولي HBSS بالتركيز الموصى به للاستخدام. يمكن تجميد HBSS الخالي من الصوديوم وإذابته قبل التجربة.
    1. افصل HBSS المحتوي على الصوديوم إلى جزأين متميزين ، كما أوصى به سابقا: أحدهما يسخن عند 37 درجة مئوية والآخر عند 4 درجات مئوية يستخدم للتشريح. قم بإذابة HBSS الخالي من الصوديوم واحتفظ به عند 4 درجات مئوية.
  4. للحث على التخدير ، استخدم 3٪ إيزوفلوران31. قبل البدء في التجربة ، تأكد من التحقق من عدم وجود منعكس القرنية والتحفيز المسبب للألم في المخلب الخلفي.
    ملاحظة: كن حذرا في اختيار دواء التخدير المناسب ، لأنه لا ينبغي أن يتداخل مع أي معايير ستكون قيد التحقيق. وبالنسبة لهذا البروتوكول، يوصى باستخدام مخدر مستنشق (مثل الأيزوفلوران)32.

4. القتل الرحيم للفئران

  1. القتل الرحيم للقوارض باستخدام الطرق المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) ، وكذلك من قبل دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 8023 ، تمت مراجعتها عام 1978).
  2. باستخدام المقصلة ، اقطع رأس الجرذ مباشرة قبل فقرة عنق الرحم الأولى.
  3. ضع الرأس على منشفة ورقية نظيفة مبللة بمحلول ملحي بارد. قم بإزالة فروة الرأس تماما باستخدام حجم المقص الجراحي S ، وكذلك العضلات الجلدية التي تهدف إلى تعريض الغرز بالكامل على السطح العلوي للجمجمة. ابدأ هذا الإجراء بعناية ، بدءا من العظم القذالي والجري للخلف إلى عظم الأنف.
    ملاحظة: في حال كان النموذج التجريبي عبارة عن فئران ، استخدم مقصا حادا لإزالة الرأس. تأكد من قطع خلف الجمجمة مباشرة لاستبعاد الأنسجة الزائدة.

5. إزالة دماغ الفئران

  1. قم بإجراء إزالة الدماغ في أسرع وقت ممكن. باستخدام ذو طيات عظمية مناسبة ، قم بعمل قطع واحد بين كلا الفتحين اللذين ينصلان إلى كلتا الفتحتين في جمجمة الفئران. بعد ذلك ، ضع طرفا واحدا من حجم المقص الجراحي S في الثقبة الماغنوم وقم بعمل قطع واحد بشكل جانبي في الجمجمة. كرر للجانب الآخر.
  2. قطع صفائح الجمجمة من الصفيحة القذالية ، ثم على طول خياطة خط الوسط للصفائح الجدارية ، وأخيرا إلى الصفيحة الأمامية باتجاه الأنف. تأكد من أن رأس القوارض مثبت بإحكام وأن الضغط موجه بعيدا عن الدماغ لمنع إتلاف الأنسجة الموجودة تحتها.
    ملاحظة: من المهم للغاية أن يتم توجيه الضغط بعيدا عن الدماغ لمنع إتلاف الأنسجة الموجودة تحتها. في الفئران والفئران الصغيرة ، من الممكن قطع الجمجمة بمقص جراحي صغير.
  3. قم بإزالة الصفائح القذالية والجدارية برفق من نصفي الكرة الأرضية باستخدام ملعقة أو ملقط. افحص بعناية بحثا عن أي مادة جافية قد تكون مرتبطة بعظام الجمجمة وتمتد عبر سطح الدماغ.
  4. قم بإزالة الدماغ على الفور باستخدام الملعقة الرفيعة ذات النهايات المزدوجة وضع الدماغ كله برفق على طبق بتري مثلج مغطى بورق الترشيح. باستخدام ماصة باستور البلاستيكية ، قم بترطيبها بمحلول ملحي مثلج. ابدأ على الفور في تشريح الحصين من نصفي الكرة المخية كما هو موضح أدناه.
  5. قم باستئصال المخيخ بعناية من الدماغ كله باستخدام شفرة المشرط # 11. من أجل فصل نصفي الكرة المخية تماما ، قم بتشغيل شفرة مشرط في جميع أنحاء الشق داخل نصف الكرة الأرضية. باستخدام ماصة باستور البلاستيكية، قم بترطيبها باستخدام عازلة HBSS المثلجة بشكل متكرر للحفاظ على الأنسجة رطبة ومحفوظة.
  6. خذ كل نصف كرة على حدة ، وقم باستئصال جذع الدماغ والدماغ المتوسط من القشرة العلوية بمقص القزحية. بعناية ، باستخدام المقص الجراحي ، قم بقطع جذع الدماغ / الدماغ المتوسط / المهاد ، بينما باستخدام فرشاة رفيعة ادفع لأسفل واسحب هياكل الدماغ هذه. أدناه سيكون من الممكن مراقبة الحصين (السطح الإنسي) والبطين الجانبي. يجب أن تكون القشرة مع الحصين الآن خالية من جذع الدماغ.

6. تشريح الحصين من الفئران

  1. لاستئصال الحصين ، ضع نصف الكرة المخية في المستوى الإكليلي مع توجيه القشرة الجدارية لأسفل. في هذه اللحظة ، من الممكن ملاحظة ألياف الفيمبريا البيضاء التي تشكل قطع زائد ضحل في الجزء السفلي من الحصين.
  2. بحذر شديد ، باليد غير المهيمنة ، قم بتثبيت أنسجة المخ بملاقط رقيقة. بيدك المهيمنة ، ضع ملاقط أخرى تحت الطرف الذيلي للحصين.
  3. قم بتثبيت مسالك المادة البيضاء الإنسية ، ووضع الملقط تماما تحت الحصين لفصله عن بقية الدماغ برفق. اضغط أثناء تحريك الطرف الثاني قليلا للأمام والجانب. إذا تم القيام به بشكل صحيح ، يجب أن يهبط الحصين على ورق الترشيح.
  4. لإنهاء تشريح الحصين ، قم بإزالة الأنسجة الاحتياطية بنفس الملقط (عادة أي قشرة متبقية وأوعية دموية ومادة بيضاء). كرر نفس المنهجية لنصف الكرة الثاني.
  5. بمجرد إزالة كل من الحصين ، انقله إلى طبق بتري مع وضع HBSS على دلو الثلج ونقله إلى منطقة طاولة التقطيع فوق الشفرة في مفرمة الأنسجة. تأكد من تحديد المناطق الظهرية والبطنية بشكل صحيح إذا تطلب التحقيق تحليلها بشكل منفصل.
    ملاحظة: من المهم دائما التمييز بين الأجزاء البطنية والظهرية من الحصين أثناء التشريح. من خلال القيام بذلك ، ستواجه النهاية الأمامية لأعلى33. هذا الجزء من الحصين أرق قليلا من الطرف الخلفي.

7. تحضير الشرائح

ملاحظة: أثناء ترتيب المادة الجراحية على المقعد (الجلسة 2) ، قم بإعداد مفرمة الأنسجة للحصول على الشريحة المستعرضة من الحصين المقطوعة.

  1. اضبط المعلمات في مفرمة المناديل قبل استخدامها. يمكن للمفرمة تقطيع الشرائح من 100 إلى 400 ميكرومتر ؛ اضبطه على 300 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بمجموعة من 60-80 ضربة في الدقيقة ، لأنها تحافظ على سلامة الأنسجة أثناء إجراء التقطيع.
  2. بعد جميع الإجراءات التي تم إجراؤها في الجلسة 2 ، بمجرد استئصال الحصين من الدماغ ووضعه على ورق الترشيح المرطب بمحلول ملحي بارد فوق دعامة ناعمة من مادة البولي بروبيلين ، قم بمحاذاة كل حصين على ورق الترشيح قبل تقديمه إلى إجراء التقطيع.
  3. ضع الحصين في وقت واحد على طاولة القطع الدائرية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ من مروحية المناديل ، بشكل عمودي على شفرات القطع للحصول على شرائح الحصين المستعرضة على طول المحور الحاجز الزمني. قبل البدء في عملية التقطيع ، قم بترطيب الشفرة برفق باستخدام كحول الأيزوبروبيل. يمنع هذا الإجراء الأنسجة من الالتصاق بالشفرة ، مما يسمح بتقطيع أكثر سلاسة ودقة.
  4. بعد تشغيل الجهاز ، سيتم رفع الشفرة الموجودة في ذراع التقطيع وإسقاطها ، مما يؤدي إلى تقطيع الأنسجة بالسمك المحدد. هذه عملية سريعة ، وعادة ما يتم تقطيع الأنسجة بشكل صحيح بعد دقيقة. من الممكن تقطيع أكثر من حصين واحد في نفس الوقت إذا تم فصلهما بشكل صحيح على طاولة التقطيع.
  5. لفصل الشرائح ، خذ كل عينة مقطعة من مفرمة المناديل بعناية باستخدام الملعقة ذات النهايات المزدوجة واغمسها في طبق بتري بمحلول ملحي مثلج. باستخدام فرشتين رفيعتين ، اضغط برفق على الحصين وافصل الشرائح. احرص على الحفاظ على سلامة الشريحة من خلال هذه العملية.
    1. قم بإجراء هذه التجربة في ثلاث نسخ ، وبالتالي حدد 6 شرائح من كل عينة: 3 شرائح لامتصاص الغلوتامات الكلي و 3 للامتصاص غير المحدد.
  6. باستخدام الفرشاة ، انقل كل شريحة برفق من طبق بتري إلى طبق مكون من 24 بئرا يحتوي على: (ط) 1 مل من HBSS ؛ و (ثانيا) 1 مل من HBSS خال من الصوديوم. حدد البئر / الصفيحة مع المجموعات التجريبية المراسلة وقم بإجراء التحليل على الأقل في ثلاث نسخ.
    ملاحظة: نظرا لمشكلة محدودة زمنيا ، إذا تم إجراء التجربة في ثلاث نسخ ، فإنها تحد من عدد / المجموعات إلى 6 فقط في المرة الواحدة (حصين واحد لكل في 5 دقائق امتصاص). هذا يعني أنه سيتم إعطاء L-[3H]-Glutamate كل 15 ثانية حتى يتم تحضين جميع الشرائح. لإيقاف التفاعل ، يجب مراعاة نفس الفاصل الزمني لضمان تعرض جميع العينات لفترة حضانة مدتها 5 دقائق.

8. فحص امتصاص الغلوتامات

  1. أثناء تثبيت الشرائح في المخزن المؤقت المعني (HBSS أو HBSS الخالي من الصوديوم) ، قم بإعداد المحلول المحتوي على الإشعاع عن طريق تخفيف L-[3H] -Glutamate في ماء معقم إلى تركيز نهائي قدره 4.5 μCi / mL في حجم نهائي يسمح ب 20 ميكرولتر لكل شريحة بالإضافة إلى بعض الفائض ، مما يمنع نقص المدخلات المشعة في نهاية الدفعة ، لأنه سيكون من الضروري تحديد عدد التفككات في الدقيقة (DPM) التي تم تقديمها لكل شريحة في البداية.
    ملاحظة: لكل صفيحة 24 بئرا ، يوصى بتحضير 500 ميكرولتر من 4.5 ميكرو Ci / مل L- [3H] - الغلوتامات بسبب إجمالي وقت الحضانة اللازم لامتصاص L- [3H] - الغلوتامات (5 دقائق) ووقت ماصة كل 20 ميكرولتر (0.33 ميكرو Ci في كل بئر) ، كما هو موضح أدناه. عادة ما يكون تركيز مخزون L- [3H] -Glutamate 1.0 mCi / mL ، وبالتالي قم بإعداد تخفيف 1: 200 لتطبيقه على الشرائح.
  2. بعد 15 دقيقة من الحضانة المسبقة في HBSS، قم بإزالة المخزن المؤقت تماما بماصة باستور واستبدلها بإضافة 280 ميكرولتر من أحد الأجزاء التالية إلى الشرائح: (1) HBSS العادي (37 درجة مئوية) للامتصاص الكلي؛ أو (ii) HBSS خال من الصوديوم (4 درجات مئوية) لامتصاص غير محدد. من المهم ملاحظة أنه يجب إجراء الامتصاص الكلي على لوحة تسخين عند 37 درجة مئوية ، بينما يتم إجراء الامتصاص غير المحدد على الجليد.
  3. قم بإعداد مؤقت واحد واضبط بداية التجربة عند إضافة 20 ميكرولتر من المدخلات في البئر الأول الذي يحتوي على شريحة. انتظر لمدة 15 - 20 ثانية (حسب عدد الشرائح في اللوحة) وأضف المدخلات المشعة إلى البئر التالي وهكذا حتى نهاية الآبار المحتوية على الشريحة. توزيع 20 ميكرولتر من المدخلات في جميع الآبار مع مراعاة إجمالي وقت الحضانة (5 دقائق).
  4. بمجرد ملء كل بئر تحتوي على شرائح في الطبق ، انتظر حتى تكتمل الشريحة الأولى لمدة 5 دقائق من الحضانة باستخدام L- [3H]-Glutamate. بعد ذلك ، قم بإزالة وسائط الحضانة على الفور إلى قارورة مناسبة للنفايات المشعة.
  5. مباشرة بعد الإزالة ، أضف بسرعة 300 ميكرولتر من HBSS المثلج وقم بإزالته برفق. كرر هذا الإجراء مرتين أخريين في كل بئر ، واستكمل ثلاث غسلات لكل شريحة. تأكد من استخدام HBSS الخالي من الصوديوم لغسل الشرائح المخصصة لقياس الامتصاص غير المحدد. بعد غسل جميع الشرائح في الطبق ، أضف 300 ميكرولتر 0.5 م هيدروكسيد الصوديوم إلى كل بئر وقم بتخزين اللوحة المحمية بالبارافيلم عند 4 درجات مئوية طوال الليل.

9. عد الغلوتامات المشعة L- [3H]

  1. في اليوم التالي ، قم بتسمية أكبر عدد ممكن من الأنابيب مثل الشرائح في التجربة واجمع محتوى البئر لكل أنبوب. تأكد من أن الشرائح قابلة للذوبان تماما في محلول التحلل. إذا لزم الأمر ، قم بتجانس العينة باستخدام إبرة قياس 26 مقترنة بحقنة سعة 1 مل.
  2. أضف 1.2 مل من سائل التلألؤ إلى الحجم النهائي البالغ حوالي 1.5 مل وقم بتجانس جميع العينات في دوامة قبل قراءتها في عداد التلألؤ لمدة 60 ثانية لكل منها.
    ملاحظة: تأكد من ضبط معلمات الكشف على التريتيوم وسيتم تسليم النتيجة في DPM.

10. الحسابات

  1. قم بتحويل النتائج التي يقدمها عداد التلألؤ إلى النشاط الإشعاعي المنبعث من الكاشف المحاصر داخل الشريحة ويمثل كمية الغلوتامات المأخوذة. خصم القيمة التي تم الحصول عليها من الامتصاص غير المحدد من النتيجة التي تم الحصول عليها باستخدام HBSS العادي. واحد μCi يعادل 2.22×106 DPM.
  2. من خلال معرفة كمية μCi والتركيز الأصلي ل [3H] L-Glutamate (المعلومات المقدمة عادة في قارورة الكاشف أو ورقة البيانات) ، احسب L- [3H] -Glutamate التي تم التقاطها بواسطة كل شريحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

امتصاص الغلوتامات هو واحد من أهم الآليات التي تتحكم في النقل العصبي في الدماغ. الحصين ، على وجه التحديد ، هو مكان مهم في إشارات الغلوتامات ، كونه مركزا مهما يربط الذاكرة والإدراك والعواطف في الدماغ. باتباع البروتوكول ، تم استخدام ذكور فئران الويستار البالغة لتوليد نتائج...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يظهر البروتوكول المقدم تقييما سهل الإجراء لامتصاص الغلوتامات باستخدام شرائح الحصين. تظهر النتائج أن AHS يأخذ بانتظام حوالي 60 fmol من L- [3H]-Gloutamate ، وأن سمك الشريحة (كمية البروتين) لم يؤثر على امتصاص L- [3H] -Glutamate (البيانات غير معروضة) ، وأن الأجزاء الظهرية والمتوسطة و?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يتلقى المؤلفون دعما ماليا من المعهد الوطني البرازيلي للعلوم والتكنولوجيا في السمية المثيرة والحماية العصبية [465671 / 2014-4] ، CNPq [438500 / 2018-0] ، و [152189 / 2020-3] ، FAPERGS / CAPES / DOCFIX [18 / 2551-0000504-5] ، CAPES [88881.141186 / 2017-01] ، CNPq [460172 / 2014-0] ، PRONEX ، FAPERGS / CNPq [16 / 2551-0000475-7] ، FAPERGS / MS / CNPq / SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#11 scalpel bladeSwann-Morton525
100 mm glass petri dishCommon suppliers
110 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001110
42.5 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001042
24-well cell culture plateFalcon353047
BeckerCommon suppliers
Blades for the tissue chopperWilkinson3241
Bone rongeurErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-Aspartic acidPerkinElmerNET581001MC11.3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-GlucoseSigma AldrichG8270
N-Methyl-D- GlucamineSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Iris scissorsErwin Guth8,00,040
IsofluraneCristalia (São Paulo, Brazil)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-Glutamic AcidPerkinElmerNET490005MC49.7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Plastic Pasteur pipetteCommon suppliers
Scintillation liquidPerkinElmer1200.437 for 1 x 5 LiterOptiphase HiSafe 3
Small surgical scissorsErwin Guth8,00,040
Small tweezersErwin Guth6,00,131
Spare chopping discs for the chopperCommon suppliers
Standard scissorsErwin Guth8,00,010
Thin brushes (size 0 or 2)Common suppliers
Thin double-ended spatulaErwin Guth470.260E
Tissue ChopperTed Pella, Inc.10180

References

  1. Knierim, J. J. The hippocampus. Current Biology. 25 (23), 1116-1121 (2015).
  2. Stella, F., Cerasti, E., Si, B., Jezek, K., Treves, A. Self-organization of multiple spatial and context memories in the hippocampus. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (7), 1609-1625 (2012).
  3. Toyoda, H., et al. Interplay of amygdala and cingulate plasticity in emotional fear. Neural Plasticity. 2011, 813749(2011).
  4. Koehl, M., Abrous, D. N. A new chapter in the field of memory: adult hippocampal neurogenesis. European Journal of Neuroscience. 33 (6), 1101-1114 (2011).
  5. Bannerman, D. M., et al. Regional dissociations within the hippocampus--memory and anxiety. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 28 (3), 273-283 (2004).
  6. Moser, E., Moser, M. B., Andersen, P. Spatial learning impairment parallels the magnitude of dorsal hippocampal lesions, but is hardly present following ventral lesions. Journal of Neuroscience. 13 (9), 3916-3925 (1993).
  7. Spiers, H. J., Bendor, D. Enhance, delete, incept: manipulating hippocampus-dependent memories. Brain Research Bulletin. 105, 2-7 (2014).
  8. Gubert, P., et al. Low concentrations of methamidophos do not alter AChE activity but modulate neurotransmitters uptake in hippocampus and striatum in vitro. Life Sciences. 88 (1-2), 89-95 (2011).
  9. Andersen, J. V., et al. Extensive astrocyte metabolism of gamma-aminobutyric acid (GABA) sustains glutamine synthesis in the mammalian cerebral cortex. Glia. 68 (12), 2601-2612 (2020).
  10. Nonose, Y., et al. Guanosine enhances glutamate uptake and oxidation, preventing oxidative stress in mouse hippocampal slices submitted to high glutamate levels. Brain Research. 1748, 147080(2020).
  11. Rambo, L. M., et al. Creatine increases hippocampal Na(+),K(+)-ATPase activity via NMDA-calcineurin pathway. Brain Research Bulletin. 88 (6), 553-559 (2012).
  12. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  13. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  14. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Progress in Neurobiology. 65 (1), 1(2001).
  15. Featherstone, D. E. Intercellular glutamate signaling in the nervous system and beyond. ACS Chem Neurosci. 1 (1), 4-12 (2010).
  16. Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
  17. Grewer, C., Rauen, T. Electrogenic glutamate transporters in the CNS: molecular mechanism, pre-steady-state kinetics, and their impact on synaptic signaling. Journal of Membrane Biology. 203 (1), 1-20 (2005).
  18. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8 (12), 935-947 (2007).
  19. Vandenberg, R. J., Ryan, R. M. Mechanisms of glutamate transport. Physiological Reviews. 93 (4), 1621-1657 (2013).
  20. Peterson, A. R., Binder, D. K. Post-translational Regulation of GLT-1 in Neurological Diseases and Its Potential as an Effective Therapeutic Target. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 164(2019).
  21. Martinez-Lozada, Z., Guillem, A. M., Robinson, M. B. Transcriptional Regulation of Glutamate Transporters: From Extracellular Signals to Transcription Factors. Advances in Pharmacology. 76, 103-145 (2016).
  22. Carbone, M., Duty, S., Rattray, M. Riluzole elevates GLT-1 activity and levels in striatal astrocytes. Neurochemistry International. 60 (1), 31-38 (2012).
  23. Jimenez, E., et al. Differential regulation of the glutamate transporters GLT-1 and GLAST by GSK3beta. Neurochemistry International. 79, 33-43 (2014).
  24. Wang, C. H., et al. Radiotracer Methodology in the Biological, Environmental and Physical Sciences. , Prentice-hall. (1975).
  25. Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. Journal of Visualized Experiments. (123), e55504(2017).
  26. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309(2014).
  27. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  28. Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Wilde, G. J., Williams, L. R., Iannotti, F. Brain-derived neurotrophic factor, but not neurotrophin-3, prevents ischaemia-induced neuronal cell death in organotypic rat hippocampal slice cultures. Neuroscience Letters. 211 (3), 203-206 (1996).
  29. Paniz, L. G., et al. Neuroprotective effects of guanosine administration on behavioral, brain activity, neurochemical and redox parameters in a rat model of chronic hepatic encephalopathy. Metabolic Brain Disease. 29 (3), 645-654 (2014).
  30. Hansel, G., et al. The potential therapeutic effect of guanosine after cortical focal ischemia in rats. PLoS One. 9 (2), 90693(2014).
  31. Cittolin-Santos, G. F., et al. Neurochemical and Brain Oscillation Abnormalities in an Experimental Model of Acute Liver Failure. Neuroscience. 401, 117-129 (2019).
  32. Westphalen, R. I., Hemmings, H. C. Effects of isoflurane and propofol on glutamate and GABA transporters in isolated cortical nerve terminals. Anesthesiology. 98 (2), 364-372 (2003).
  33. Lee, A. R., Kim, J. H., Cho, E., Kim, M., Park, M. Dorsal and Ventral Hippocampus Differentiate in Functional Pathways and Differentially Associate with Neurological Disease-Related Genes during Postnatal Development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 331(2017).
  34. Thomazi, A. P., et al. Ontogenetic profile of glutamate uptake in brain structures slices from rats: sensitivity to guanosine. Mechanisms of Ageing and Development. 125 (7), 475-481 (2004).
  35. Nonose, Y., et al. Cortical Bilateral Adaptations in Rats Submitted to Focal Cerebral Ischemia: Emphasis on Glial Metabolism. Molecular Neurobiology. 55 (3), 2025-2041 (2018).
  36. Arriza, J. L., et al. Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5559-5569 (1994).
  37. Aggarwal, S., Mortensen, O. V. In Vitro Assays for the Functional Characterization of the Dopamine Transporter (DAT). Current Protocols in Pharmacology. 79, 12(2017).
  38. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  39. Moreira, J. D., et al. Dietary omega-3 fatty acids prevent neonatal seizure-induced early alterations in the hippocampal glutamatergic system and memory deficits in adulthood. Nutritional Neuroscience. , 1-12 (2020).
  40. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  41. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12 (5), 1077-1080 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

L 3H Na Ex vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved