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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine zuverlässige und einfache Methode, um ex vivo akute Hippocampus-Querschnitte von Mäusen und Ratten mit einem Gewebehäcksler zu erhalten. Schnitte, die von resezierten Hippocampi gewonnen wurden, können für eine funktionelle Glutamataufnahmeanalyse eingereicht werden, um die Homöostase des glutamatergen Systems zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Entfernung von Glutamat aus dem extrazellulären Raum durch hochaffine Na+-abhängige Transporter ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass die intrinsischen Konnektivitätsmechanismen des Gehirns ordnungsgemäß funktionieren und die Homöostase aufrechterhalten wird. Der Hippocampus ist eine einzigartige Gehirnstruktur, die höhere kognitive Funktionen steuert und Gegenstand mehrerer Studien zu neurologischen Erkrankungen ist. Die Untersuchung physiologischer und pathologischer Mechanismen in Nagetiermodellen kann von akuten Hippocampus-Schnittpräparaten (AHS) profitieren. AHS hat den Vorteil, dass es zuverlässige Informationen über die Zellfunktion liefert, da die Zytoarchitektur und die synaptischen Schaltkreise erhalten bleiben. Obwohl AHS-Präparate häufig in neurochemischen Laboratorien verwendet werden, ist es möglich, einige methodische Unterschiede in der Literatur zu finden. In Anbetracht der Tatsache, dass unterschiedliche Schnittpräparationsprotokolle die analysierten Hippocampusregionen verändern können, schlägt dieses Protokoll eine Standardtechnik zur Gewinnung von transversalen AHS aus reseziertem Hippocampus vor. Dieses einfach durchzuführende Protokoll kann in experimentellen Modellen von Mäusen und Ratten verwendet werden und ermöglicht mehrere ex vivo-Ansätze zur Untersuchung der neurochemischen Dynamik (im dorsalen, intermediären und ventralen Hippocampus) unter verschiedenen Hintergründen (z. B. transgene Manipulationen) oder nach in vivo-Manipulationen (z. B. pharmakologische Behandlungen oder geeignete Nagetiermodelle zur Untersuchung klinischer Störungen). Nach der Präparierung des Hippocampus aus dem Nagetiergehirn wurden quer verlaufende Schnitte entlang der septo-temporalen Achse (300 μm dick) erhalten. Diese AHS enthalten unterschiedliche Teile des Hippocampus und wurden einer individuellen neurochemischen Untersuchung unterzogen (als Beispiel: Neurotransmittertransporter mit ihren jeweiligen Substraten). Da der Hippocampus eine hohe Dichte an exzitatorischen Synapsen aufweist und Glutamat der wichtigste Neurotransmitter im Gehirn ist, ist das glutamaterge System ein interessantes Ziel für in vivo beobachtete Phänomene. Daher bietet das aktuelle Protokoll detaillierte Schritte zur Untersuchung der Glutamataufnahme in ex vivo AHS unter Verwendung von L-[3H]-Glutamat. Die Verwendung dieses Protokolls zur Untersuchung der Funktion des Hippocampus kann dazu beitragen, den Einfluss des Glutamatstoffwechsels auf Mechanismen der Neuroprotektion oder Neurotoxizität besser zu verstehen.

Einleitung

Der Hippocampus, eine Gehirnstruktur, die tief im medialen Temporallappen jeder Hemisphäre vergraben ist und in der sich hohe kognitive Funktionen befinden, ist eine der am besten untersuchten Entitäten des Zentralnervensystems (ZNS). Die Funktion des Hippocampus hängt stark mit dem deklarativen und räumlichen Gedächtnis zusammen. Diese Struktur spielt auch eine Rolle im emotionalen Verhalten und bei der Regulierung der hypothalamischen Funktionen 1,2,3,4. Seit der Bestätigung finden in dieser Region wichtige Mechanismen der Gedächtnisbildung und -speicherung statt und das Feld begann, die Hippocampusregion eingehend zu untersuchen. Dementsprechend nimmt die Verwendung von Tiermodellen, die menschlichen Hirnerkrankungen im Zusammenhang mit hippokampalen Funktionen wie Alzheimer, Epilepsie, Depression und Stress ähneln, weiter zu.

Bei Nagetieren ist der Hippocampus eine gekrümmte Struktur, die in der Nähe des medialen Septums in Richtung des ventralen temporalen Kortex beginnt. Entlang seiner Längsachse kann der Hippocampus in drei verschiedene Regionen unterteilt werden, die jeweils mit einem spezifischen Schaltkreisverbunden sind 1. Der obere Teil bildet den dorsalen/septalen Hippocampus, der untere Teil den ventralen/temporalen Hippocampus und der Bereich zwischen ihnen wird als intermediärer Hippocampus bezeichnet. Es gibt umfangreiche Literatur, die sich mit den Unterschieden in den zellulären Projektionen zu den einzelnen Teilen befasst, sowie Berichte über spezifische kognitive Aspekte, die von jedem Teil verarbeitet werden 5,6. Hinsichtlich ihrer internen Organisation können die Hippocampusregionen nach ihren Funktionsbereichen unterschieden werden. Das Areal der Cornu ammonis (CA) ist in CA1, CA2 und CA3 unterteilt und erstreckt sich durch den oberen Teil des Hippocampus, oberhalb des Gyrus dentatus (DG) und des Subiculums, die die innersten Teile des Hippocampus darstellen (Abbildung 1). Die Synapsen, die sich in diesen Regionen befinden, durchlaufen eine kontinuierliche Umlagerung, die neurogene und plastische Prozesse während des gesamten Lebens zeigt3. Mehrere Studien haben bereits gezeigt, dass ausgeprägte experimentelle Manipulationen im Hippocampus zu kognitiver Behinderung führen7. Bei der Beurteilung biochemischer und molekularer Veränderungen sind Techniken mit akuten Hirnschnitten ein hervorragendes Werkzeug, um das Wissen über verschiedene Aspekte des Hippocampus zu verbessern.

Aufgrund seiner Präzision und Reproduzierbarkeit verwendeten viele Studien, die Aspekte von Neurotransmissionsphänomenen (Enzymaktivität, -aufnahme oder -freisetzung) untersuchten, transversale AHS aus reseziertem Hippocampus, der mit dem Gewebechopper 8,9,10,11,12 gewonnen wurde. Diese Slicing-Technik mit anschließender Aufnahmebewertung eignet sich für anspruchsvolle neurochemische Experimente, bei denen die Transporteraktivität aus dem Hippocampusgewebe erhalten bleiben muss. Hierfür ist der Einsatz eines Gewebe-Choppers vorzuziehen, da er schneller als das Vibratom ist und das AHS in einer geeigneten Zeit für den experimentellen Einsatz mit geeigneter Genauigkeit zur Verfügung stellt.

Die exzitatorische Neurotransmission im Gehirn wird durch Glutamat erreicht, den am häufigsten vorkommenden Neurotransmitter, einschließlich des Hippocampus, der in größerem Maße von der Glutamat-Signalübertragung abhängig ist13,14. Diese Häufigkeit von Neurotransmittern wird in der extrazellulären Umgebung streng kontrolliert. In intrazellulären Vesikeln kann es jedoch bis zu 100 mMerreichen 15. Sobald Glutamat im synaptischen Spalt freigesetzt wird, wird es nicht metabolisiert und muss entfernt werden, um Exzitotoxizität zu vermeiden, die normalerweise als Reaktion auf eine Überladung von Glutamat ausgelöst wird 14,16. Der einzige Mechanismus, der Toxizität von normaler Signalübertragung trennt, ist der natriumabhängige Transport durch die Aktivität von Proteinen, die sich in den Plasmamembranen hauptsächlich von Gliazellen befinden 14,17,18,19. Diese Transporter [GLAST (EAAT1) und GLT-1(EAAT2)] regulieren den extrazellulären Glutamatspiegel streng und können durch eine Vielzahl von Faktoren moduliert werden, wie z. B. DNA-Transkription, mRNA-Spleißen und -Abbau, Proteinsynthese und -targeting, Aminosäuretransportaktivität und Ionenkanalaktivitäten 20,21,22,23. Dementsprechend kann ihre Aktivität durch den Transport von radioaktiv markiertem Substrat, wie Glutamat, gemessen werden.

Die Verwendung von radioaktiv markierten Substraten stellt eine bevorzugte Methode zur Quantifizierung der Transporteraktivität dar, da sie die Verfolgung dynamischer Mechanismen wie des Transports durch Zellmembranen ermöglichen. Zu den Vorteilen von Radiotracer-Experimenten gehören neben ihrer hohen Sensitivität und Spezifität auch ihre Einfachheit und ihr geringer Aufwand im Vergleich zu konkurrierenden Technologien wie der Massenspektrometrie24. Durch die Verwendung von nur geringen Mengen an Tracer werden auch die physiologischen Konzentrationen der Substrate nicht verändert, was ein repräsentativeres Bild des realen Szenarios der metabolischen Aktivität liefert.

Die Verfügbarkeit von experimentellen Ex-vivo-Ansätzen ist von entscheidender Bedeutung, um die Grundlagenforschung zur Identifizierung neuartiger molekularer Ziele und Wirkstoffforschungsaktivitäten zu unterstützen. Unter Berücksichtigung der Relevanz der Glutamataufnahme für die Homöostase des glutamatergen Systems und der hohen Dominanz von glutamatergen Synapsen im Hippocampus zeigt dieses Protokoll, wie die Glutamataufnahmeaktivität in einer schnellen und einfach zu reproduzierenden Methode unter Verwendung von transversalen AHS aus dem resezierten Hippocampus bewertet werden kann. Dieser Assay verwendet radioaktiv markiertes L-[3H]-Glutamat, das quantitative Vergleiche und eine klare Visualisierung der Ergebnisse ermöglicht und für die Verwendung mit spezifischen oder kundenspezifischen Substraten über einen weiten Bereich von Reaktionsbedingungen modifiziert werden kann25.

Akute Hirnschnitte bieten viele Vorteile und wurden zur Unterstützung der Funktionsveränderung unter pharmakologischen und genetischen Manipulationen eingesetzt 26,27,28. Ihre Verwendung profitiert von folgenden Punkten: (i) der Erhaltung der neurochemischen Funktionalität und den Zell-zu-Zell-Interaktionen; (ii) die Möglichkeit, zahlreiche pharmakologische und genetische Manipulationen durchzuführen, um die Signalwege zu untersuchen, die den neuronalen und glialen Funktionen zugrunde liegen; (iii) präzise Kontrolle der extrazellulären Umgebung; und (iv) guter experimenteller Zugang zu verschiedenen Hippocampus-Bereichen (wie CA1, CA3 oder DG), die je nach Schneidemethode in derselben Scheibe gehalten werden. In Anbetracht der Tatsache, dass unterschiedliche Schnittpräparationsprotokolle die exponierten Hippocampusregionen verändern können, schlägt dieses Protokoll eine Standardtechnik zur Gewinnung von transversalen AHS aus dem resezierten Hippocampus vor. Dieses einfach durchzuführende Protokoll kann in Nagetiermodellen verwendet werden und ermöglicht möglicherweise mehrere ex vivo-Ansätze zur Untersuchung der neurochemischen Dynamik unter verschiedenen Hintergründen oder nach in vivo-Manipulationen29,30 (Abbildung 2).

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Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission genehmigt (Projektgenehmigung # 33732/CEUA-UFRGS). Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Beschwerden und die Anzahl der in den Versuchen verwendeten Tiere zu minimieren.

1. Zubereitung von Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)

  1. In ein 1-l-Becherglas ca. 0,5 l steriles oder doppelt destilliertes Wasser geben und unter einem Magnetrührer kräftig umrühren. Die folgenden HBSS-Komponenten (in mM) sind zuzugeben: 137 NaCl, 0,63Na2HPO4, 4,17 NaHCO3, 5,36 KCl, 0,44KH2PO4, 0,41 MgSO4, 0,49 MgCl2, 5,55 D-Glukose (siehe Tabelle 1).
  2. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH oder HCl auf 7,4 ein, bevor Sie 1,26 mM CaCl2 hinzufügen, um Ausfällungen zu vermeiden. Fügen Sie dieses Salz sehr langsam und unter Rühren hinzu. Bringen Sie es mit sterilem oder doppelt destilliertem Wasser auf ein Volumen von 1 l. Dieser Puffer wird verwendet, um das Gewebe zu waschen und das AHS während des Experiments in einem lebensfähigen Zustand zu halten. Es liefert anorganische Ionen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Werts und osmotischen Drucks.
    HINWEIS: Die Zugabe von zweiwertigen Kationen erfolgt nach Titration des pH-Werts, um eine Ausfällung zu vermeiden.
  3. Trennen Sie zwei verschiedene Fraktionen von HBSS: Eine wird in einem Wasserbad bei 37 °C aufbewahrt und während des Aufnahmeparadigmas verwendet, während die andere eiskalt (4 °C) gehalten und für Waschvorgänge vor und nach dem Experiment verwendet wird.
    HINWEIS: Es ist möglich, von jedem Salz Stammlösungen zuzubereiten und sie bis zur Verwendung eingefroren zu halten, im Gefrierschrank (-20 °C) zu lagern und innerhalb weniger Wochen zu verbrauchen.

2. Zubereitung von natriumfreiem HBSS

  1. Bevor Sie die Komponenten für natriumfreies HBSS mischen, bereiten Sie im Voraus zwei weitere Lösungen vor: Glucamin-HCl (137 mM) und Glucamin-HEPES (4,17 mM). Mischen Sie äquimolare Konzentrationen von NMDG-Base und HCl, um die Glucamin-HCl-Lösung zu erhalten. Führen Sie das gleiche Verfahren mit 2,0 M HEPES-freier Säure durch, um die NMDG-HEPES-Lösung zu erhalten (siehe Tabelle 2).
  2. In ein 0,5-l-Becherglas ca. 0,2 l steriles oder doppelt destilliertes Wasser geben und in einem Magnetrührer kräftig umrühren. Fügen Sie die folgenden Pufferkomponenten (in mM) hinzu: 137 Glucamin-HCl, 4,17 Glucamin-HEPES, 5,36 KCl, 0,44KH2PO4, 1,26 MgSO4, 0,41 MgCl2 und 5,55 D-Glucose (siehe Tabelle 2).
  3. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH oder HCl auf 7,4 ein und rühren Sie weiter. 1,26 mM CaCl2 sehr langsam und unter Rühren zugeben. Bringen Sie die Lösung mit sterilem oder doppelt destilliertem Wasser auf ein Volumen von 0,3 l.
    HINWEIS: Dieser Puffer wird zur Messung der nicht-natriumabhängigen Glutamataufnahme verwendet, was die Messung der passiven/unspezifischen Glutamataufnahme ermöglicht. Nach dem Experiment wird dieser Parameter von der Gesamtglutamataufnahme subtrahiert, um die natriumabhängige Aufnahme zu bestimmen.
  4. Nach der Aufbereitung kann dieser Puffer im Gefrierschrank (-20 °C) gelagert und anschließend in nachfolgenden Experimenten verwendet werden. Das Gleiche gilt für die NMDG-Lösungen.
  5. Halten Sie das natriumfreie HBSS während des Experiments immer eiskalt.

3. Organisation des Materials für die Hippocampus-Dissektion von Ratten

  1. Organisieren Sie den Präparierbereich neben der Spüle, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Positionieren Sie eine spezielle Guillotine für Ratten (für Mäuse ist es möglich, eine scharfe Schere zu verwenden) in das Waschbecken, um die Bank sauber zu halten.
  2. Ordnen Sie die chirurgischen Instrumente und andere Materialien für die Hirnentfernung und die Hippocampus-Dissektion in der Reihenfolge ihrer Verwendung und so nah wie möglich an den Stellen an, an denen sie benötigt werden (siehe Materialtabelle). Stelle die Petrischale in einen Eiskübel. Bewahren Sie außerdem eine Plastiktüte in der Nähe auf, um den Kadaver zu entsorgen.
  3. Bereiten Sie beide HBSS-Lösungen in der empfohlenen Konzentration für den Gebrauch vor. Das natriumfreie HBSS kann vor dem Experiment eingefroren und aufgetaut werden.
    1. Trennen Sie natriumhaltige HBSS in zwei verschiedene Portionen, wie zuvor empfohlen: eine auf 37 °C erhitzte und eine auf 4 °C erhitzte Portion, die zum Sezieren verwendet wird. Natriumfreies HBSS auftauen und bei 4 °C aufbewahren.
  4. Um eine Anästhesie einzuleiten, verwenden Sie 3% Isofluran31. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, stellen Sie sicher, dass es keinen Hornhautreflex und keine nozizeptive Stimulation der Hinterpfote gibt.
    HINWEIS: Achten Sie auf die Auswahl des geeigneten Anästhetikums, da es keine Parameter beeinträchtigen sollte, die untersucht werden. Für dieses Protokoll wird die Verwendung eines Inhalationsanästhetikums (z. B. Isofluran) empfohlen32.

4. Einschläferung der Ratte

  1. Euthanasieren Sie das Nagetier mit den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) sowie vom National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, überarbeitet 1978) genehmigten Methoden.
  2. Enthaupten Sie die Ratte mit einer Guillotine unmittelbar vor dem ersten Halswirbel.
  3. Legen Sie den Kopf auf ein sauberes Papiertuch, das mit kalter Kochsalzlösung angefeuchtet ist. Entfernen Sie die Kopfhaut vollständig mit der chirurgischen Schere Größe S sowie den Hautmuskel, um die Nähte auf der oberen Oberfläche des Schädels vollständig freizulegen. Beginnen Sie diesen Eingriff vorsichtig, beginnend in der Nähe des Hinterhauptbeins und verlaufen Sie nach hinten zum Nasenbein.
    HINWEIS: Falls es sich bei dem Versuchsmodell um Mäuse handelt, verwenden Sie eine scharfe Schere, um den Kopf zu entfernen. Achten Sie darauf, direkt hinter dem Schädel zu schneiden, um überschüssiges Gewebe auszuschließen.

5. Entfernung des Rattengehirns

  1. Führen Sie die Gehirnentfernung so schnell wie möglich durch. Machen Sie mit einer geeigneten Knochenzange einen Schnitt zwischen den beiden Augenlöchern, die beide Öffnungen im Schädel der Ratte verbinden. Setzen Sie danach eine Spitze der chirurgischen Schere Größe S in das Foramen magnum ein und machen Sie einen einzelnen Schnitt seitlich in den Schädel. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Seite.
  2. Schneiden Sie die Schädelplatten von der Hinterhauptplatte, dann entlang der Mittelnaht der Scheitelplatten und schließlich zur Frontplatte in Richtung Nase. Achten Sie darauf, dass der Kopf des Nagetiers fest gehalten wird und dass der Druck vom Gehirn weg gerichtet wird, um das darunter liegende Gewebe nicht zu beschädigen.
    HINWEIS: Es ist von entscheidender Bedeutung, dass der Druck vom Gehirn weg gerichtet wird, um eine Schädigung des darunter liegenden Gewebes zu verhindern. Bei jungen Ratten und Mäusen ist es möglich, den Schädel mit einer kleinen chirurgischen Schere zu schneiden.
  3. Entfernen Sie vorsichtig die Hinterhaupt- und Scheitelplatten mit einem Spatel oder einer Pinzette von beiden Hemisphären. Untersuche sorgfältig nach Dura-Substanzen, die an den Schädelknochen haften und über die Oberfläche des Gehirns gespannt sein könnten.
  4. Entfernen Sie das Gehirn sofort mit dem dünnen doppelseitigen Spatel und legen Sie das ganze Gehirn vorsichtig auf eine eiskalte, mit Filterpapier abgedeckte Petrischale. Mit der Pasteurpipette aus Kunststoff befeuchten Sie diese mit eiskalter Kochsalzlösung. Beginnen Sie sofort damit, die Hippocampi von beiden Gehirnhälften aus zu sezieren, wie unten beschrieben.
  5. Sezieren Sie vorsichtig das Kleinhirn vom gesamten Gehirn mit der Skalpellklinge #11. Um die Hirnhälften vollständig zu trennen, führt man mit einer Skalpellklinge durch die intrahemisphärische Fissur. Befeuchten Sie die Pasteur-Pipette aus Kunststoff häufig mit eiskaltem HBSS-Puffer, um das Gewebe feucht und konserviert zu halten.
  6. Nehmen Sie jede Hemisphäre einzeln, resezieren Sie den Hirnstamm und das Mittelhirn mit einer Irisschere aus der darüber liegenden Rinde. Vorsichtig mit der chirurgischen Schere den Hirnstamm/Mittelhirn/Thalamus durchtrennen, während Sie mit einer dünnen Bürste diese Hirnstrukturen nach unten drücken und ziehen. Unten wird es möglich sein, den Hippocampus (mediale Oberfläche) und den lateralen Ventrikel zu beobachten. Die Hirnrinde mit dem Hippocampus sollte nun frei vom Hirnstamm sein.

6. Hippocampi-Sektion von Ratten

  1. Um den Hippocampus zu resezieren, platzieren Sie eine Gehirnhälfte in der koronalen Ebene mit dem parietalen Kortex nach unten. In diesem Moment ist es möglich, die weißen Fimbrienfasern zu beobachten, die am unteren Ende des Hippocampus eine flache Hyperbel bilden.
  2. Verankern Sie das Hirngewebe sehr vorsichtig mit der nicht dominanten Hand mit einer dünnen Pinzette. Platzieren Sie mit Ihrer dominanten Hand eine andere Pinzette unter der kaudalen Spitze des Hippocampus.
  3. Verankern Sie die medialen Bahnen der weißen Substanz und positionieren Sie die Pinzette vollständig unter dem Hippocampus, um ihn sanft vom Rest des Gehirns zu trennen. Üben Sie Druck aus, während Sie die zweite Spitze leicht nach vorne und zur Seite bewegen. Wenn es richtig gemacht wird, sollte der Hippocampus auf dem Filterpapier landen.
  4. Um die Hippocampus-Dissektion zu beenden, entfernen Sie das überschüssige Gewebe mit derselben Pinzette (normalerweise alle verbleibenden Rindenrinden, Blutgefäße und weiße Substanz). Wiederholen Sie die gleiche Methode für die zweite Hemisphäre.
  5. Sobald beide Hippocampus entfernt sind, geben Sie es in eine Petrischale mit HBSS, das auf den Eiskübel gelegt wird, und übertragen Sie es auf den Schneidetischbereich über der Klinge im Gewebezerkleinerer. Achten Sie darauf, den dorsalen und ventralen Bereich richtig zu identifizieren, wenn die Untersuchung eine separate Analyse erfordert.
    HINWEIS: Es ist wichtig, während der Dissektion immer den ventralen und dorsalen Teil des Hippocampus zu unterscheiden. Auf diese Weise zeigt das vordere Ende nach oben33. Dieser Teil des Hippocampus ist etwas dünner als das hintere Ende.

7. Zubereitung der Scheiben

HINWEIS: Während Sie das chirurgische Material auf der Bank anordnen (Sitzung 2), bereiten Sie den Gewebehacker vor, um den Querschnitt aus dem resezierten Hippocampus zu erhalten.

  1. Stellen Sie die Parameter vor der Verwendung im Gewebezerkleinerer ein. Der Zerkleinerer kann Scheiben von 100 bis 400 μm schneiden; Stellen Sie ihn auf 300 μm ein. Darüber hinaus wird ein Bereich von 60-80 Hüben pro Minute empfohlen, da so die Gewebeintegrität während des Schneidevorgangs erhalten bleibt.
  2. Nach allen Eingriffen, die in Sitzung 2 durchgeführt wurden, nachdem die Hippocampus aus dem Gehirn reseziert und auf das mit kalter Kochsalzlösung befeuchtete Filterpapier auf einem glatten Polypropylenträger gelegt wurden, richten Sie jeden Hippocampus auf dem Filterpapier aus, bevor Sie sie dem Zerkleinerungsverfahren unterziehen.
  3. Platzieren Sie den Hippocampus nacheinander auf dem kreisförmigen Edelstahl-Schneidetisch aus dem Gewebezerkleinerer, senkrecht zu den Schneidklingen, um die quer verlaufenden Hippocampus-Scheiben entlang der septo-temporalen Achse zu erhalten. Bevor Sie mit dem Hacken beginnen, befeuchten Sie die Klinge leicht mit Isopropylalkohol. Dieses Verfahren verhindert, dass das Gewebe an der Klinge kleben bleibt, und ermöglicht ein glatteres und präziseres Schneiden.
  4. Nach dem Einschalten des Geräts wird die Klinge im Schneidarm angehoben und abgesenkt, wodurch das Gewebe in der gewählten Dicke geschnitten wird. Dies ist ein schneller Prozess, und normalerweise wird das Gewebe nach einer Minute richtig geschnitten. Es ist möglich, mehr als einen Hippocampus gleichzeitig zu zerkleinern, wenn sie auf dem Schneidetisch richtig getrennt gehalten werden.
  5. Um die Scheiben zu trennen, entnehmen Sie jede geschnittene Probe vorsichtig mit dem doppelseitigen Spatel aus dem Gewebezerkleinerer und tauchen Sie sie in eine Petrischale mit eiskalter Kochsalzlösung. Mit zwei dünnen Bürsten den Hippocampus vorsichtig zusammendrücken und die Scheiben trennen. Achten Sie darauf, dass die Integrität der Scheibe während dieses Prozesses erhalten bleibt.
    1. Führen Sie dieses Experiment in dreifacher Ausführung durch, wählen Sie also 6 Scheiben aus jeder Probe aus: 3 Scheiben für die gesamte Glutamataufnahme und 3 für die unspezifische Aufnahme.
  6. Übertragen Sie mit dem Pinsel jede Scheibe vorsichtig aus der Petrischale auf eine 24-Well-Platte, die Folgendes enthält: (i) 1 ml HBSS; und (ii) 1 ml HBSS natriumfrei. Identifizieren Sie die Vertiefung/Platte mit den entsprechenden Versuchsgruppen und führen Sie die Analyse mindestens in dreifacher Ausführung durch.
    HINWEIS: Aufgrund eines zeitlich begrenzten Problems ist die Anzahl der Tiere/Gruppen auf nur 6 gleichzeitig begrenzt, wenn das Experiment in dreifachen Mengen durchgeführt wird (ein Hippocampus pro Tier in 5 Minuten Aufnahme). Das bedeutet, dass das L-[3H]-Glutamat alle 15 s verabreicht wird, bis alle Scheiben inkubiert sind. Um die Reaktion zu stoppen, sollte das gleiche Intervall eingehalten werden, um sicherzustellen, dass alle Proben einer Inkubationszeit von 5 Minuten ausgesetzt werden.

8. Glutamat-Aufnahme-Assay

  1. Während der Stabilisierung der Scheiben in dem jeweiligen Puffer (HBSS oder natriumfreies HBSS) die radioaktive Lösung herstellen, indem L-[3H]-Glutamat in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 4,5 μCi/ml in einem Endvolumen verdünnt wird, das 20 μl pro Scheibe plus etwas Überschuss zulässt, wodurch der Mangel an radioaktivem Eintrag am Ende der Charge verhindert wird, da es notwendig sein wird, zu quantifizieren, wie viele Desintegrationen pro Minute (DPM) jedem Slice zu Beginn angeboten wurden.
    HINWEIS: Für jede 24-Well-Platte wird empfohlen, 500 μl L-[3 H]-Glutamat mit 4,5 μCi/ml L-[3H]-Glutamat herzustellen, da die Gesamtinkubationszeit für die L-[3H]-Glutamat-Aufnahme (5 min) und die Zeit zum Pipettieren von jeweils 20 μl Aliquot (0,33 μCi in jeder Vertiefung) erforderlich ist, wie unten erläutert. Die Stammkonzentration von L-[3H]-Glutamat beträgt in der Regel 1,0 mCi/ml, bereiten Sie daher eine Verdünnung von 1:200 vor, die auf die Scheiben aufgetragen wird.
  2. Nach 15 Minuten Vorinkubation in HBSS wird der Puffer mit einer Pasteur-Pipette vollständig entfernt und durch Zugabe von 280 μl eines der folgenden Mittel zu den Scheiben ersetzt: i) reguläres HBSS (37 °C) für die Gesamtaufnahme; oder ii) natriumfreies HBSS (4 °C) für unspezifische Aufnahme. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gesamtaufnahme auf einer Heizplatte bei 37 °C erfolgen muss, während die unspezifische Aufnahme auf Eis erfolgt.
  3. Bereiten Sie einen Timer vor und stellen Sie den Beginn des Experiments ein, wenn Sie 20 μl Eingang in die erste Vertiefung mit einer Scheibe geben. Warten Sie 15 - 20 s (abhängig von der Anzahl der Scheiben in der Platte) und geben Sie den radioaktiven Eingang in die nächste Vertiefung und so weiter bis zum Ende der schichthaltigen Vertiefungen. Verteilen Sie 20 μl Input in alle Vertiefungen, immer unter Berücksichtigung der Gesamtinkubationszeit (5 min).
  4. Sobald jede der Vertiefungen mit den Scheiben in der Platte gefüllt ist, warten Sie, bis die erste Scheibe die 5-minütige Inkubation mit L-[3H]-Glutamat abgeschlossen hat. Dann wird das Inkubationsmedium sofort in einen geeigneten Kolben für radioaktive Abfälle gebracht.
  5. Unmittelbar nach der Entnahme schnell 300 μL eiskaltes HBSS zugeben und vorsichtig entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male in jeder Vertiefung und führen Sie drei Wäschen für jede Scheibe durch. Achten Sie darauf, das natriumfreie HBSS zum Waschen der Scheiben zu verwenden, die für die unspezifische Aufnahmemessung bestimmt sind. Nachdem Sie alle Scheiben in der Platte gewaschen haben, geben Sie 300 μL 0,5 M NaOH in jede Vertiefung und lagern Sie die mit Parafilm geschützte Platte über Nacht bei 4 °C.

9. Zählung des radioaktiven L-[3H]-Glutamat

  1. Beschriften Sie am nächsten Tag so viele Röhrchen wie Scheiben im Experiment und sammeln Sie den Inhalt der Vertiefung zu jedem Röhrchen. Achten Sie darauf, dass die Scheiben vollständig in der Lyselösung löslich sind. Falls erforderlich, homogenisieren Sie die Probe mit einer 26-Gauge-Nadel, die mit einer 1-ml-Spritze gekoppelt ist.
  2. Geben Sie 1,2 mL Szintillationsflüssigkeit zu einem Endvolumen von ca. 1,5 mL und homogenisieren Sie alle Proben in einem Wirbel, bevor Sie sie in einem Szintillationszähler für jeweils 60 s ablesen.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Erkennungsparameter auf Tritium eingestellt sind und das Ergebnis in DPM geliefert wird.

10. Berechnungen

  1. Die vom Szintillationszähler gelieferten Ergebnisse werden in die Radioaktivität umgerechnet, die von dem in der Scheibe eingeschlossenen Reagenz emittiert wird, und stellt die Menge des aufgenommenen Glutamats dar. Ziehen Sie den für die unspezifische Aufnahme erhaltenen Wert von dem Ergebnis ab, das mit dem regulären HBSS erhalten wurde. Ein μCi entspricht 2,22×106 DPM.
  2. Wenn Sie die Menge an μCi und die ursprüngliche Konzentration von [3H]L-Glutamat kennen (Informationen finden Sie normalerweise im Reagenzkolben oder Datenblatt), berechnen Sie das L-[3H]-Glutamat, das von jeder Scheibe eingefangen wird.

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Ergebnisse

Die Aufnahme von Glutamat ist einer der wichtigsten Mechanismen, die die Neurotransmission im Gehirn steuern. Insbesondere der Hippocampus ist ein kritischer Ort bei der Glutamat-Signalgebung, da er ein wichtiger Knotenpunkt ist, der Gedächtnis, Kognition und Emotionen im Gehirn verbindet. Gemäß dem Protokoll wurden erwachsene männliche Wistar-Ratten verwendet, um repräsentative Ergebnisse zu erzielen. Die Tiere wurden mit Isofluran 3% bis zur Bewusstlosigkeit betäubt. Nach der Pr?...

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Diskussion

Das vorgestellte Protokoll zeigt eine einfach durchzuführende Beurteilung der Glutamataufnahme anhand von Hippocampusschnitten. Die Ergebnisse zeigen, dass AHS regelmäßig etwa 60 fmol radioaktiv markiertes L-[3H]-Glutamat aufnimmt, dass die Dicke der Scheibe (Proteinmenge) keinen Einfluss auf die L-[3H]-Glutamat-Aufnahme hatte (Daten nicht gezeigt) und dass die dorsalen, intermediären und ventralen Teile des Hippocampus ähnliche Leistungen zeigten, wenn sie von...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren erhalten finanzielle Unterstützung vom brasilianischen Nationalen Institut für Wissenschaft und Technologie in den Bereichen Excitotoxizität und Neuroprotektion [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0] und [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
#11 scalpel bladeSwann-Morton525
100 mm glass petri dishCommon suppliers
110 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001110
42.5 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001042
24-well cell culture plateFalcon353047
BeckerCommon suppliers
Blades for the tissue chopperWilkinson3241
Bone rongeurErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-Aspartic acidPerkinElmerNET581001MC11.3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-GlucoseSigma AldrichG8270
N-Methyl-D- GlucamineSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Iris scissorsErwin Guth8,00,040
IsofluraneCristalia (São Paulo, Brazil)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-Glutamic AcidPerkinElmerNET490005MC49.7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Plastic Pasteur pipetteCommon suppliers
Scintillation liquidPerkinElmer1200.437 for 1 x 5 LiterOptiphase HiSafe 3
Small surgical scissorsErwin Guth8,00,040
Small tweezersErwin Guth6,00,131
Spare chopping discs for the chopperCommon suppliers
Standard scissorsErwin Guth8,00,010
Thin brushes (size 0 or 2)Common suppliers
Thin double-ended spatulaErwin Guth470.260E
Tissue ChopperTed Pella, Inc.10180

Referenzen

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