げっ歯類切除海馬から得られた急性横切片における放射性標識L-[3H]-グルタミン酸を用いたグルタミン酸取り込みの測定

要約

この記事では、組織チョッパーを使用してマウスやラットからex vivoの急性海馬横切片を取得するための信頼性が高く簡単な方法について説明します。切除された海馬から得られたスライスは、グルタミン酸作動系の恒常性を調査するための機能的グルタミン酸取り込み分析に提出できます。

要約

高親和性Na⁺依存性トランスポーターによる細胞外空間からのグルタミン酸の除去は、脳の固有の接続メカニズムが適切に機能し、恒常性を維持するために不可欠です。海馬は、高次認知機能を管理するユニークな脳構造であり、神経疾患に関するいくつかの研究の対象となっています。げっ歯類モデルにおける生理学的および病理学的メカニズムの調査には、急性海馬スライス(AHS)調製が役立ちます。AHSには、細胞構造とシナプス回路が保存されているため、細胞機能に関する信頼性の高い情報を提供できるという利点があります。AHS製剤は神経化学研究室で一般的に使用されていますが、文献にはいくつかの方法論的な違いが見つかる可能性があります。独特のスライス調製プロトコルが分析される海馬領域を変更する可能性があることを考慮すると、この現在のプロトコルは、切除された海馬から横行AHSを取得するための標準的な技術を提案しています。この実施が簡単なプロトコールは、マウスおよびラットの実験モデルで使用でき、さまざまなバックグラウンド(例:トランスジェニック操作)またはin vivo操作後(例:薬理学的治療または臨床障害を研究するための適切なげっ歯類モデル)で神経化学的ダイナミクス(背側、中期、腹側海馬)を調査するいくつかのex vivoアプローチが可能になります。げっ歯類の脳から海馬を解剖した後、中隔側頭軸に沿った横切片(厚さ300μm)が得られました。これらのAHSには海馬の異なる部分が含まれており、個々の神経化学的調査が行われました(例として、それぞれの基質を使用した神経伝達物質トランスポーター)。海馬は高密度の興奮性シナプスを示し、グルタミン酸は脳内で最も重要な神経伝達物質であるため、グルタミン酸作動系はin vivoで観察される現象の興味深い標的です。したがって、現在のプロトコルでは、L-[³H]-グルタミン酸を使用してex vivo AHSでのグルタミン酸の取り込みを調査するための詳細な手順が提供されています。このプロトコルを使用して海馬機能を調査すると、神経保護または神経毒性のメカニズムに対するグルタミン酸代謝の影響をよりよく理解するのに役立つ可能性があります。

概要

海馬は、高い認知機能がある各半球の内側側頭葉の奥深くに埋もれた脳構造であり、中枢神経系(CNS)の最も研究されているエンティティの1つです。海馬の機能は、宣言記憶と空間記憶に強く関連しています。この構造は、感情行動や視床下部機能の調節にも役割を果たしています1,2,3,4。それが確認されて以来、この領域では記憶の形成と保存の重要なメカニズムが起こっており、現場では海馬領域の深い調査が始まりました。それに伴い、アルツハイマー病、てんかん、大うつ病、ストレスなど、海馬機能に関連するヒトの脳疾患に類似した動物モデルの使用が増加しています。

げっ歯類では、海馬は内側中隔付近から腹側頭皮質に向かって湾曲した形状の構造です。その縦軸に沿って、海馬は3つの異なる領域に分割することができ、それぞれが特定の回路¹に関連しています。上部は背側/中隔の海馬を構成し、下部は腹側/側頭の海馬を構成し、それらの間の領域は中間の海馬と見なされます。各部分への細胞投射の違いを網羅した広範な文献があり、各部分によって処理される特定の認知的側面の報告もあります^5,6。その内部組織に関しては、海馬領域はその機能領域によって分離することができます。アンモニス(CA)領域は、CA1、CA2、CA3に細分され、海馬の上部、歯状回(DG)と最も内部的な海馬部分である小眼瞭の上を通って広がっています(図1)。これらの領域に位置するシナプスは、生涯を通じて神経原性および可塑性のプロセスを示す連続的な再配列を受けます³。いくつかの研究は、海馬での明確な実験的操作が認知障害をもたらすことをすでに示しています⁷。生化学的および分子的変化の評価に関しては、急性脳スライスを使用する技術は、海馬のさまざまな側面に関する知識を向上させるための優れたツールです。

その精度と再現性により、神経伝達関連現象(酵素活性、取り込み、または放出)の側面を調査した多くの研究では、ティッシュチョッパー8,9,10,11,12によって得られた切除された海馬からの横AHSが使用されました。このスライス技術とそれに続く取り込み評価は、海馬組織からのトランスポーター活性を保存する必要がある高度な神経化学実験に適しています。そのためには、ティッシュチョッパーの採用が望ましいです、なぜならそれはビブラトームよりも速く、適切な精度で実験的な使用のための適切な時間にAHSを提供するからです。

脳内の興奮性神経伝達は、海馬を含む最も豊富な神経伝達物質であるグルタミン酸によって達成され、これはグルタミン酸シグナル伝達に大きく依存しています^13,14。この神経伝達物質の存在量は、細胞外環境において厳密に制御されています。しかし、細胞内小胞内では、最大100 mM¹⁵に達することがあります。シナプス間隙で放出されると、グルタミン酸は代謝されず、通常はグルタミン酸の過負荷に対する応答として引き起こされる興奮毒性を避けるために除去する必要があります^14,16。毒性を正常なシグナル伝達から分離する唯一のメカニズムは、主にグリア細胞14,17,18,19の原形質膜に位置するタンパク質の活性によるナトリウム依存性輸送である。これらのトランスポーター[GLAST(EAAT1)およびGLT-1(EAAT2)]は、細胞外グルタミン酸レベルを厳密に調節し、DNA転写、mRNAのスプライシングおよび分解、タンパク質の合成および標的化、アミノ酸輸送活性、イオンチャネル活性などの広範な因子によって調節することができる20,21,22,23。したがって、それらの活性は、グルタミン酸としての放射性標識基質の輸送によって測定できます。

放射性標識基質の使用は、細胞膜を越えた輸送などの動的メカニズムを追跡できるため、トランスポーター活性を定量化するための好ましい方法を表しています。放射性トレーサー実験の利点は、その高い感度と特異性に加えて、質量分析²⁴などの競合技術と比較して、その簡便さと費用の少なさである。また、少量のトレーサーを使用するだけで、基質の生理学的レベルが変化しないため、実際の代謝活動シナリオをより代表的な画像で示すことができます。

ex vivo実験アプローチの利用可能性は、新規分子標的の特定と創薬活動に関する基礎研究をサポートするために重要です。したがって、グルタミン酸取り込みがグルタミン酸作動性システムの恒常性に関連性があること、および海馬におけるグルタミン酸作動性シナプスの高い優位性を考慮すると、このプロトコルは、切除された海馬からの横AHSを使用して、グルタミン酸取り込み活性を迅速かつ容易に再現する方法で評価する方法を示しています。このアッセイは、放射性標識されたL-[^3H]-グルタミン酸を使用し、定量的な比較と結果の明確な視覚化を可能にし、広範囲の反応条件にわたって、特定のまたはカスタマイズされた基質で使用するために変更することができる²⁵。

急性脳切片には多くの利点があり、薬理学的および遺伝的操作26,27,28の下で機能変化をサポートするために使用されてきた。それらの使用は、次の利点から利益を得ます:(i)神経化学的機能の保存と細胞間相互作用。(ii)ニューロンおよびグリア機能の根底にある経路を調査するために、多数の薬理学的および遺伝的操作を実行する可能性。(iii)細胞外環境の正確な制御。(iv)スライス方法に応じて同じスライスに保持される異なる海馬領域(CA1、CA3、DGなど)への良好な実験的アクセス。独特のスライス調製プロトコルが露出した海馬領域を変化させる可能性があることを考慮すると、このプロトコルは、切除された海馬から横行AHSを取得するための標準的な技術を提案しています。この簡単に実行できるプロトコルは、げっ歯類モデルで使用することができ、さまざまなバックグラウンドで、またはin vivo操作29,30後に神経化学的ダイナミクスを調査するいくつかのex vivoアプローチを可能にする可能性があります^29,30(図2)。

プロトコル

すべての手順は、NIHの実験動物のケアと使用に関するガイドに従って実施され、地元の倫理委員会によって承認されました(プロジェクト承認#33732 / CEUA-UFRGS)。不快感を最小限に抑え、実験に使用する動物の数を減らすために、あらゆる努力が払われました。

1.ハンク平衡塩溶液(HBSS)の調製

1. 1 Lのビーカーに、約0.5 Lの滅菌水または二重蒸留水を加え、マグネチックスターラーで激しく攪拌し始めます。次のHBSS成分(mM)を追加します:137 NaCl、0.63 Na₂HPO₄、4.17 NaHCO₃、5.36 KCl、0.44 KH₂PO₄、0.41 MgSO₄、0.49 MgCl₂、5.55 D-グルコース( 表1を参照)。
2. NaOHまたはHClでpHを7.4に調整してから、1.26 mM CaCl₂ を添加して沈殿を避けてください。この塩を非常にゆっくりと、攪拌しながら加えます。滅菌水または二重蒸留水で1Lの容量まで上げます。このバッファーは、組織を洗浄し、実験中に AHS を実行可能な状態に維持するために使用されます。生理的なpHと浸透圧を維持しながら無機イオンを提供します。
   注:二価カチオンの添加は、沈殿を避けるためにpHの滴定後に行われます。
3. HBSSの2つの異なる画分を分けます:1つは37°Cの水浴に保持され、取り込みパラダイム中に使用されます。もう1つは氷冷(4°C)に保たれ、実験の前後の洗浄に使用されます。
   注:各塩の原液を調製し、使用するまで冷凍保存し、冷凍庫(-20°C)に保管して数週間以内に使用することが可能です。

2. ナトリウムフリーHBSSの調製

1. ナトリウムフリーHBSSの成分を混合する前に、グルカミン-HCl(137 mM)とグルカミン-HEPES(4.17 mM)の2つの他の溶液を事前に調製してください。等モル濃度のNMDG塩基とHClを混合して、Glucamine-HCl溶液を得ます。2.0 M HEPES遊離酸でも同じ手順を行い、NMDG-HEPES溶液を得ます( 表2を参照)。
2. 0.5 Lのビーカーに、約0.2 Lの滅菌水または二重蒸留水を加え、マグネチックスターラーで激しく攪拌し始めます。次の緩衝成分(mM)を添加します:137 Glucamine-HCl、4.17 Glucamine-HEPES、5.36 KCl、0.44 KH₂PO₄、1.26 MgSO₄、0.41 MgCl₂、および5.55 D-Glucose( 表2を参照)。
3. KOHまたはHClでpHを7.4に調整し、攪拌を続けます。1.26 mM CaCl₂ を非常にゆっくりと、攪拌しながら添加します。溶液を滅菌水または二重蒸留水で0.3Lの容量まで上げます。
   注:このバッファーは、非ナトリウム依存性グルタミン酸取り込みを測定するために使用され、受動的/非特異的グルタミン酸取り込みの測定が可能になります。実験後、このパラメータをグルタミン酸の総摂取量から差し引いて、ナトリウム依存性の摂取量を決定します。
4. 調製後、このバッファーを冷凍庫(-20°C)にストックし、その後の実験で使用することができます。NMDGソリューションについても同じことが言えます。
5. 実験中は、ナトリウムを含まないHBSSの氷を常に冷たく保ってください。

3. ラットの海馬解剖用資料の整理

1. 実験を開始する前に、シンクの横の解剖エリアを整理します。ラット用の特定のギロチン(マウスの場合は、鋭利なハサミを使用することが可能です)をシンクに配置して、ベンチを清潔に保ちます。
2. 脳の除去と海馬の解剖のための手術器具やその他の材料は、使用順に、必要な場所にできるだけ近づけて配置してください( 資料の表を参照)。ペトリ皿を氷のバケツに入れます。また、死骸を処分するためにビニール袋を近くに置いてください。
3. 両方のHBSS溶液を推奨濃度で調製して使用します。ナトリウムを含まないHBSSは、実験前に凍結および解凍することができます。
   1. ナトリウム含有HBSSは、以前に推奨されたように、37°Cで加熱したものと4°Cで加熱したものの2つの異なる部分に分け、解剖に使用します。ナトリウムを含まないHBSSを解凍し、4°Cに保ちます。
4. 麻酔を誘発するには、3%イソフルラン³¹を使用します。.実験を始める前に、後足に角膜反射と侵害受容刺激がないことを確認してください。
   注:適切な麻酔薬は、調査中のパラメータに干渉してはならないため、慎重に選択してください。このプロトコルでは、吸入麻酔薬(例えば、イソフルラン)の使用が推奨される³²。

4.ネズミを安楽死させる

1. げっ歯類を安楽死させるには、Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)およびNational Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH出版物No.8023、1978年改訂)によって承認された方法を使用します。
2. ギロチンを使用して、最初の頸椎の直前にラットを斬首します。
3. 冷たい生理食塩水で湿らせた清潔なペーパータオルの上に頭を置きます。手術用ハサミサイズSで頭皮を完全に取り除き、頭蓋骨の上面に縫合糸を完全に露出させることを狙って皮膚筋も完全に取り除きます。この手順は、後頭骨の近くから始まり、鼻骨の後方に走って慎重に開始します。
   注:実験モデルがマウスの場合は、鋭利なハサミを使用して頭を取り外してください。余分な組織を排除するために、頭蓋骨のすぐ後ろを切るようにしてください。

5.ラットの脳の除去

1. できるだけ早く脳の除去を行います。適切な骨ペンチを使用して、ラットの頭蓋骨の両方の開口部をつなぐ両方のアイホールの間に単一の切り込みを入れます。その後、手術用ハサミのサイズSの先端を大孔に1つ入れ、頭蓋骨に横方向に1つの切り込みを入れます。反対側についても繰り返します。
2. 頭蓋骨板を後頭板から切り取り、次に頭頂板の正中線縫合糸に沿って、最後に鼻に向かって前頭板に切り込みます。げっ歯類の頭がしっかりと保持され、圧力が脳から離れるようにして、下の組織の損傷を防ぐことを確認してください。
   注:下の組織の損傷を防ぐために、圧力を脳から遠ざけることが非常に重要です。若いラットやマウスでは、小さな手術用ハサミで頭蓋骨を切ることが可能です。
3. へらまたは鉗子を使用して、両方の半球から後頭板と頭頂板をそっと取り外します。頭蓋骨に付着し、脳の表面に伸びている可能性のある硬膜物質がないか注意深く検査します。
4. 細い両端のヘラですぐに脳を取り出し、濾紙で覆われた氷冷したペトリ皿に脳全体をそっと置きます。プラスチック製のパスツールピペットで、氷のように冷たい生理食塩水で湿らせます。以下に説明するように、すぐに両方の脳半球から海馬の解剖を開始します。
5. #11メスの刃で全脳から小脳を丁寧に切除します。大脳半球を完全に分離するために、半球内裂全体にメスの刃を走らせます。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、氷冷したHBSSバッファーで頻繁に湿らせて、ティッシュを濡らして保存します。
6. 各半球を別々に取り、虹彩ハサミでその上にある皮質から脳幹と中脳を切除します。手術用ハサミで脳幹/中脳/視床を慎重に切り、細いブラシでこれらの脳構造を押し下げて引きます。以下では、海馬(内側表面)と側脳室を観察することが可能になります。海馬のある皮質は、これで脳幹から自由になるはずです。

6. ラットからの海馬解剖

1. 海馬を切除するには、頭頂葉が下を向くように、片方の脳半球を冠状面に置きます。このとき、海馬の底に浅い双曲線を形成する白い線細線維を観察することができます。
2. 非常に慎重に、利き手ではない手で、細いピンセットで脳組織を固定します。利き手で、他のピンセットを海馬の尾側先端の下に置きます。
3. 内側白質路を固定し、ピンセットを海馬の下に完全に配置して、脳の他の部分から穏やかに分離します。2番目の先端をわずかに前方および横に動かしながら圧力をかけます。適切に行われると、海馬は濾紙に着地するはずです。
4. 海馬の解剖を終了するには、同じピンセットで予備の組織(通常は残っている皮質、血管、白質)を取り除きます。2 番目の半球についても同じ方法を繰り返します。
5. 両方の海馬を取り除いたら、氷のバケツにHBSSを置いたシャーレに移し、ティッシュチョッパーのブレードの上の切断テーブル領域に移します。調査で背側と腹側の領域を別々に分析する必要がある場合は、背側と腹側の領域を適切に特定してください。
   注:解剖中は、海馬の腹側と背側の部分を常に区別することが重要です。これにより、前端が上を向く³³となる。海馬のこの部分は、後端よりもわずかに細いです。

7.スライスの準備

注:手術材料をベンチに配置しながら(セッション2)、切除した海馬から横切片を取得するために組織チョッパーを準備します。

1. 使用する前に、ティッシュチョッパーにパラメータを設定してください。チョッパーは100〜400μmのスライスをカットできます。300μmに設定します。さらに、スライス手順中に組織の完全性を維持するため、毎分60〜80ストロークの範囲が推奨されます。
2. セッション2で行われたすべての手順の後、海馬を脳から切除し、滑らかなポリプロピレン支持体の上に冷たい生理食塩水で加湿した濾紙の上に置いたら、各海馬を濾紙に合わせてから、チョッピング手順に提出します。
3. 海馬をティッシュチョッパーから円形のステンレス製切断テーブルに一度に置き、切断刃に対して垂直にして、中隔側頭軸に沿った横方向の海馬スライスを得る。チョッピングプロセスを開始する前に、イソプロピルアルコールを使用してブレードを軽く加湿します。この手順により、組織がブレードに付着するのを防ぎ、よりスムーズで正確なスライスが可能になります。
4. 装置の電源を入れると、チョッピングアームの刃が持ち上げられて落下し、選択した厚さの組織をスライスします。これは迅速なプロセスであり、通常、組織は1分後に適切にスライスされます。カッティングテーブル上で適切に分離されていれば、複数の海馬を同時に切り刻むことができます。
5. スライスを分離するには、両端のスパチュラを使用してティッシュチョッパーからスライスした各サンプルを慎重に取り出し、氷冷生理食塩水を入れたシャーレに突っ込みます。2本の細いブラシを使用して、海馬をそっとつまみ、スライスを分離します。このプロセスを通じてスライスの整合性を維持するように注意してください。
   1. この実験を3回に分けて行うため、各サンプルから6つのスライスを選択します:3つのスライスを総グルタミン酸の取り込みに、3つのスライスを非特異的な取り込みに使用します。
6. ブラシを使用して、各スライスをペトリ皿から以下を含む24ウェルプレートに静かに移します:(i)HBSS1mL;(ii)1mLのHBSSナトリウムフリー。対応する実験グループでウェル/プレートを特定し、少なくとも3回で分析を実行します。
   注:時間制限の問題により、実験を3回に分けて行うと、動物/グループの数が一度に6匹に制限されます(5分間の取り込みで動物1匹につき1つの海馬)。これは、L-[³H]-グルタミン酸は、すべてのスライスがインキュベートされるまで15秒ごとに投与されることを意味します。反応を止めるには、すべてのサンプルが5分間のインキュベーション期間にさらされるように、同じ間隔を観察する必要があります。

8. グルタミン酸取り込みアッセイ

1. それぞれのバッファー(HBSSまたはナトリウムフリーHBSS)でのスライスの安定化中に、L-[³H]-グルタミン酸を滅菌水で最終濃度4.5 μCi/mLに希釈し、スライスあたり20 μLと多少の過剰量を許容する最終容量で放射性含有溶液を調製します。これにより、バッチ終了時の放射性インプットの不足を防ぐことができます。 最初に各スライスに提供された分裂数(DPM)を定量化する必要があるためです。
   注:以下で説明するように、L-[³H]-グルタミン酸の取り込みに必要な合計インキュベーション時間(5分)と各20 μLアリコート(各ウェルに0.33 μCi)をピペットする時間があるため、各24ウェルプレートには、500 μLの4.5 μCi/mL L-[³H]-グルタミン酸を調製することをお勧めします。L-[³H]-グルタミン酸のストック濃度は通常1.0 mCi/mLであるため、スライスに適用する希釈液を1:200に調製します。
2. HBSSで15分間のプレインキュベーションを行った後、パスツールピペットでバッファーを完全に取り除き、次のいずれかをスライスに280μLを加えて交換します:(i)通常のHBSS(37°C)を総取り込み量として;または(ii)非特異的な取り込みのためのナトリウムフリーHBSS(4°C)。総取り込みは37°Cの加熱プレート上で行う必要があり、非特異的な取り込みは氷上で行う必要があることに注意することが重要です。
3. タイマーを1つ用意し、スライスを含む最初のウェルに20μLの入力を追加するときに実験の開始を設定します。15〜20秒(プレート内のスライスの数によって異なります)待ち、放射性インプットを次のウェルなどに追加し、スライスを含むウェルが終了するまで続けます。すべてのウェルに20 μLのインプットを分配し、常に総インキュベーション時間(5分)を考慮します。
4. プレート内のスライスを含む各ウェルが満たされたら、最初のスライスがL-[³H]-グルタミン酸との5分間のインキュベーションを完了するのを待ちます。その後、すぐにインキュベーション培地を放射性廃棄物用の適切なフラスコに移します。
5. 取り出し直後は、氷冷したHBSSをさっと300μL加え、やさしく取り出します。この手順を各ウェルでさらに2回繰り返し、スライスごとに3回の洗浄を完了します。非特異的な取り込み測定専用のスライスを洗浄するために、ナトリウムを含まないHBSSを必ず使用してください。プレート内のすべてのスライスを洗浄した後、各ウェルに300 μL 0.5 M NaOHを加え、パラフィルムで保護したプレートを4°Cで一晩保存します。

9. 放射性L-[³H]-グルタミン酸の計数

1. 翌日、実験でスライスする数と同じ数のチューブにラベルを付け、ウェルの内容物を各チューブに収集します。スライスが溶解液で完全に可溶化されていることを確認してください。必要に応じて、1 mLシリンジに結合した26ゲージの針を使用してサンプルをホモジナイズします。
2. 1.2 mLのシンチレーション液を最終容量約1.5 mLに加え、すべてのサンプルをボルテックスでホモジナイズしてから、シンチレーションカウンターでそれぞれ60秒間読み取ります。
   注:検出パラメータがトリチウムに設定され、結果がDPMで配信されることを確認してください。

10. 計算

1. シンチレーションカウンターから得られた結果を、スライス内に閉じ込められた試薬から放出される放射能に変換し、グルタミン酸の摂取量を表します。通常のHBSSで得られた結果から、非特異的取り込みについて得られた値を差し引きます。1μCiは2.22×10^6DPM に相当します。
2. μCiの量と[³H]L-グルタミン酸の元の濃度(通常は試薬のフラスコまたはデータシートに記載されている情報)を知ることで、各スライスで捕捉されたL-[³H]-グルタミン酸を計算します。

結果

グルタミン酸の取り込みは、脳内の神経伝達を制御する最も重要なメカニズムの1つです。特に海馬は、グルタミン酸シグナル伝達の重要な場所であり、脳内の記憶、認知、感情をつなぐ重要なハブです。プロトコルに従って、成体の雄Wistarラットを使用して代表的な結果を生成しました。動物は意識を失うまでイソフルラン3%を使用して麻酔をかけられました。脳を...

ディスカッション

提示されたプロトコルは、海馬スライスを使用して簡単に実行できるグルタミン酸取り込み評価を示しています。その結果、AHSは定期的に約60 fmolの放射性標識L-[³H]-グルタミン酸を吸収すること、スライスの厚さ(タンパク質量)がL-[³H]-グルタミン酸の取り込みに影響を与えなかったこと(データは示さず)、海馬の背側、中間部、腹側部分がナイーブな?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 scalpel blade	Swann-Morton	525
100 mm glass petri dish	Common suppliers
110 mm diameter Whatman Filter	Sigma Aldrich	WHA1001110
42.5 mm diameter Whatman Filter	Sigma Aldrich	WHA1001042
24-well cell culture plate	Falcon	353047
Becker	Common suppliers
Blades for the tissue chopper	Wilkinson	3241
Bone rongeur	Erwin Guth	9,00,005
CaCl2	Sigma Aldrich	C4901
D-[2,3-3H]-Aspartic acid	PerkinElmer	NET581001MC	11.3 Ci/mmol (37 MBq)
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
N-Methyl-D- Glucamine	Sigma Aldrich	M2004
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Hidex 300 SL	Hidex Oy.	Super Low Level #425-020
Iris scissors	Erwin Guth	8,00,040
Isoflurane	Cristalia (São Paulo, Brazil)	4,10,525	1 mL/mL
KCl	Sigma Aldrich	P3911
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662
L-[3,4-3H]-Glutamic Acid	PerkinElmer	NET490005MC	49.7 Ci/mmol (185 MBq)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Plastic Pasteur pipette	Common suppliers
Scintillation liquid	PerkinElmer	1200.437 for 1 x 5 Liter	Optiphase HiSafe 3
Small surgical scissors	Erwin Guth	8,00,040
Small tweezers	Erwin Guth	6,00,131
Spare chopping discs for the chopper	Common suppliers
Standard scissors	Erwin Guth	8,00,010
Thin brushes (size 0 or 2)	Common suppliers
Thin double-ended spatula	Erwin Guth	470.260E
Tissue Chopper	Ted Pella, Inc.	10180