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요약

이 기사는 조직 초퍼를 사용하여 마우스와 쥐에서 생체 외 급성 해마 횡단 절편을 얻는 신뢰할 수 있고 간단한 방법을 설명합니다. 절제된 해마에서 얻은 절편은 글루타메이터성 시스템 항상성을 조사하기 위한 기능적 글루타메이트 흡수 분석을 위해 제출할 수 있습니다.

초록

친화성이 높은 Na+ 의존성 수송체에 의한 세포 외 공간에서 글루타민산을 제거하는 것은 뇌의 고유한 연결 메커니즘이 제대로 작동하고 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 해마는 더 높은 인지 기능을 관리하는 독특한 뇌 구조이며 신경 질환에 관한 여러 연구의 주제입니다. 설치류 모델의 생리학적 및 병리학적 메커니즘에 대한 조사는 급성 해마 절편(AHS) 제제의 이점을 얻을 수 있습니다. AHS는 세포구조와 시냅스 회로가 보존되어 있기 때문에 세포 기능에 대한 신뢰할 수 있는 정보를 제공한다는 장점이 있습니다. AHS 제제는 일반적으로 신경화학 실험실에서 사용되지만 문헌에서 몇 가지 방법론적 차이점을 찾을 수 있습니다. 독특한 절편 준비 프로토콜이 분석된 해마 영역을 변화시킬 수 있다는 점을 고려하여, 이 현재 프로토콜은 절제된 해마에서 횡방향 AHS를 얻기 위한 표준 기술을 제안합니다. 이 수행하기 쉬운 프로토콜은 마우스와 쥐의 실험 모델에 사용될 수 있으며 다양한 배경(예: 형질전환 조작) 또는 생체 내 조작(예: 약물 치료 또는 임상 장애를 연구하기 위한 적합한 설치류 모델)에서 신경화학적 역학(등쪽, 중간 및 복부 해마)을 조사하는 여러 생체 외 접근 방식을 허용합니다. 설치류의 뇌에서 해마를 절개한 후, 중격-측두축(300μm 두께)을 따라 횡방향 절편을 얻었다. 이러한 AHS는 해마의 별개의 부분을 포함하며 개별 신경화학적 조사를 받았습니다(예: 각각의 기질을 사용하는 신경전달물질 수송체). 해마는 흥분성 시냅스의 밀도가 높고 글루타메이트는 뇌에서 가장 중요한 신경전달물질이기 때문에 글루타메이트 시스템은 생체 내에서 관찰된 현상에 대한 흥미로운 표적입니다. 따라서 현재 프로토콜은 L-[3H]-글루타메이트를 사용하여 생체 외 AHS에서 글루타메이트 흡수를 탐색하기 위한 자세한 단계를 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 해마 기능을 조사하면 글루타메이트 대사가 신경 보호 또는 신경 독성 메커니즘에 미치는 영향을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

해마는 각 반구의 내측 측두엽 깊숙이 묻혀 있는 뇌 구조로, 높은 인지 기능이 있는 곳으로, 중추신경계(CNS)에서 가장 많이 연구된 개체 중 하나입니다. 해마의 기능은 선언적 기억 및 공간 기억과 밀접한 관련이 있습니다. 이 구조는 또한 정서적 행동과 시상하부 기능 조절에 중요한 역할을 합니다 1,2,3,4. 확인 된 이래로 기억 형성 및 저장의 중요한 메커니즘이 이 지역에서 발생했으며 이 분야는 해마 영역을 깊이 조사하기 시작했습니다. 이에 따라 알츠하이머병, 간질, 주요우울증, 스트레스 등 해마 기능과 관련된 인간의 뇌 장애를 닮은 동물모델의 사용이 계속 증가하고 있다.

설치류에서 해마는 내측 중격 근처에서 시작하여 복부 측두엽 피질을 향해 구부러진 모양의 구조입니다. 세로축을 따라 해마는 세 개의 다른 영역으로 나눌 수 있으며, 각 영역은 특정 회로1과 관련이 있습니다. 윗부분은 등쪽/중격 해마를 구성하고, 아래쪽 부분은 복부/측두부 해마를 구성하며, 그 사이의 영역은 중간 해마로 간주됩니다. 각 부분에 대한 세포 투영의 차이를 다루는 광범위한 문헌과 각 부분에 의해 처리되는 특정 인지적 측면에 대한 보고가 있습니다 5,6. 내부 조직과 관련하여, 해마 영역은 기능 영역에 따라 분리 될 수 있습니다. Cornu ammonis(CA) 영역은 CA1, CA2 및 CA3으로 세분화되며 가장 내부 해마 부분인 치상회(DG)와 subiculum 위의 해마의 상부를 통해 확장됩니다(그림 1). 이 영역에 위치한 시냅스는 지속적인 재배열을 거쳐 평생 동안 신경인성 및 가소성 과정을 보여줍니다3. 여러 연구에서 이미 해마의 뚜렷한 실험적 조작이 인지 장애를 초래한다는 사실이 밝혀졌다7. 생화학적 및 분자적 변화의 평가와 관련하여, 급성 뇌 절편을 사용하는 기술은 해마의 다양한 측면에 대한 지식을 향상시키는 훌륭한 도구입니다.

정확성과 재현성으로 인해 신경 전달 관련 현상(효소 활성, 흡수 또는 방출)의 측면을 탐구한 많은 연구에서는 조직 절단기로 얻은 절제된 해마의 횡방향 AHS를 사용했습니다 8,9,10,11,12. 이 슬라이싱 기술과 흡수 평가는 해마 조직의 수송체 활성을 보존해야 하는 정교한 신경화학 실험에 적합합니다. 이를 위해 티슈 다파톱을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 비브라톰보다 빠르고 적절한 정확도로 실험적으로 사용할 수 있도록 적절한 시간에 AHS를 제공하기 때문입니다.

뇌의 흥분성 신경 전달은 해마를 포함하여 가장 풍부한 신경 전달 물질 인 글루타메이트에 의해 이루어지며, 이는 글루타메이트 신호에 더 많이 의존합니다13, 14. 이 신경 전달 물질의 풍부함은 세포 외 환경에서 엄격하게 제어됩니다. 그러나 세포 내 소포 내부에서는 최대 100mM15에 도달할 수 있습니다. 일단 시냅스 틈새로 방출되면, 글루타메이트는 대사되지 않으며 일반적으로 글루타메이트14,16의 과부하에 대한 반응으로 유발되는 흥분 독성을 피하기 위해 제거해야 합니다. 독성을 정상적인 신호전달과 분리하는 유일한 메커니즘은 주로 신경교세포(glial cell)의 원형질막(plasma membrane)에 위치한 단백질의 활동을 통한 나트륨 의존성 수송이다 14,17,18,19. 이러한 수송체[GLAST(EAAT1) 및 GLT-1(EAAT2)]는 세포 외 글루타메이트 수준을 엄격하게 조절하며 DNA 전사, mRNA 접합 및 분해, 단백질 합성 및 표적화, 아미노산 수송 활성, 이온 채널 활성과 같은 광범위한 요인에 의해 조절될 수 있습니다 20,21,22,23. 따라서, 이들의 활성은 글루타메이트와 같은 방사성 표지된 기질의 수송에 의해 측정될 수 있습니다.

방사성 표지된 기질의 사용은 세포막을 가로지르는 수송과 같은 동적 메커니즘을 추적할 수 있기 때문에 수송체 활성을 정량화하는 데 선호되는 방법을 나타냅니다. 높은 감도와 특이성 외에도 방사성 추적자 실험의 장점은 질량 분석법과 같은 경쟁 기술에 비해 단순하고 비용이 적게 든다는 것입니다24. 또한 소량의 추적자만 사용함으로써 기질의 생리학적 수준이 변경되지 않으므로 실제 대사 활성 시나리오에 대한 보다 대표적인 그림을 제공합니다.

생체 외 실험 접근법의 가용성은 새로운 분자 표적 식별 및 약물 발견 활동에 대한 기본 연구를 지원하는 데 매우 중요합니다. 따라서, 글루타메이트 시스템 항상성에 대한 글루타메이트 흡수의 관련성과 해마에서 글루타메이트 시냅스의 높은 우세를 고려할 때, 이 프로토콜은 절제된 해마에서 횡방향 AHS를 사용하여 빠르고 쉽게 재현할 수 있는 방법으로 글루타메이트 흡수 활성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 이 분석은 방사성 표지된 L-[3H]-글루타메이트를 사용하여 정량적 비교와 결과의 명확한 시각화를 가능하게 하며, 광범위한 반응 조건에서 특정 기질 또는 맞춤형 기질과 함께 사용하도록 수정할 수 있습니다25.

급성 뇌 절편은 많은 이점을 제시하며 약리학 및 유전자 조작에 따른 기능 변화를 지원하는 데 사용되어 왔다 26,27,28. 그들의 사용은 다음과 같은 이점을 얻습니다 : (i) 신경 화학적 기능 보존 및 세포 간 상호 작용; (ii) 신경 세포 및 신경교 기능의 기저에 있는 경로를 조사하기 위해 수많은 약리학적 및 유전적 조작을 수행할 수 있는 가능성; (iii) 세포 외 환경의 정밀한 제어; (iv) 슬라이싱 방법에 따라 동일한 슬라이스에 유지되는 다른 해마 영역(예: CA1, CA3 또는 DG)에 대한 우수한 실험적 접근. 독특한 절편 준비 프로토콜이 노출된 해마 영역을 변화시킬 수 있다는 점을 고려하여 이 프로토콜은 절제된 해마에서 횡방향 AHS를 얻기 위한 표준 기술을 제안합니다. 이 수행하기 쉬운 프로토콜은 설치류 모델에서 사용될 수 있으며 다양한 배경 또는 생체 내 조작 후 신경 화학적 역학을 조사하는 여러 생체 외 접근 방식을 허용 할 수 있습니다29, 30 (그림 2).

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프로토콜

모든 절차는 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행되었으며 지역 윤리 위원회(프로젝트 승인 # 33732/CEUA-UFRGS)의 승인을 받았습니다. 불편함을 최소화하고 실험에 사용된 동물의 수를 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 준비

  1. 1L 비커에 약 0.5L의 멸균수 또는 이중 증류수를 넣고 자석 교반기에서 격렬하게 저어주기 시작합니다. 다음 HBSS 성분을 추가합니다(mM 단위): 137 NaCl, 0.63 Na2HPO4, 4.17 NaHCO3, 5.36 KCl, 0.44 KH2PO4, 0.41 MgSO4, 0.49 MgCl2, 5.55 D-Glucose( 표 1 참조).
  2. 침전을 피하기 위해 1.26mM CaCl2 를 첨가하기 전에 NaOH 또는 HCl로 pH를 7.4로 조정합니다. 이 소금을 아주 천천히 그리고 교반하면서 넣으십시오. 멸균수 또는 이중 증류수로 1L의 부피까지 가져옵니다. 이 완충액은 조직을 세척하고 실험 중에 AHS를 실행 가능한 상태로 유지하는 데 사용됩니다. 생리학적 pH와 삼투압을 유지하면서 무기 이온을 제공합니다.
    참고: 2가 양이온의 추가는 침전을 피하기 위해 pH를 적정한 후 수행됩니다.
  3. HBSS의 두 가지 다른 분획을 분리합니다: 하나는 37°C의 수조에 보관하여 흡수 패러다임 중에 사용하고, 다른 하나는 얼음처럼 차갑게(4°C) 유지하여 실험 전후에 세척하는 데 사용합니다.
    참고: 각 소금의 원액을 준비하여 사용할 때까지 냉동 보관하고 냉동실(-20°C)에 보관한 후 몇 주 이내에 사용할 수 있습니다.

2. 무나트륨 HBSS 준비

  1. 무나트륨 HBSS의 성분을 혼합하기 전에 글루카민-HCl(137mM) 및 글루카민-HEPES(4.17mM)의 두 가지 다른 용액을 미리 준비하십시오. NMDG 염기와 HCl의 등몰 농도를 혼합하여 글루카민-HCl 용액을 얻습니다. NMDG-HEPES 용액을 얻기 위해 2.0 M HEPES 유리산으로 동일한 절차를 수행하십시오 ( 표 2 참조).
  2. 0.5L 비커에 약 0.2L의 멸균수 또는 이중 증류수를 넣고 자석 교반기에서 격렬하게 저어주기 시작합니다. 다음 완충액 성분을 추가합니다(mM 단위): 137 글루카민-HCl, 4.17 글루카민-HEPES, 5.36 KCl, 0.44 KH2PO4, 1.26 MgSO4, 0.41 MgCl2 및 5.55 D-글루코스( 표 2 참조).
  3. KOH 또는 HCl로 pH를 7.4로 조정하고 계속 저어줍니다. 1.26 mM CaCl2 를 매우 천천히 교반 하에서 첨가하십시오. 멸균수 또는 이중 증류수로 용액을 최대 0.3L 부피로 가져옵니다.
    참고: 이 버퍼는 비나트륨 의존성 글루타메이트 흡수를 측정하는 데 사용되며, 이를 통해 수동적/비특이적 글루타메이트 흡수량을 측정할 수 있습니다. 실험 후, 나트륨 의존성 흡수량을 결정하기 위해 총 글루타메이트 흡수량에서 이 매개변수를 뺍니다.
  4. 준비 후 이 버퍼는 냉동고(-20 °C)에 비축하고 나중에 후속 실험에 사용할 수 있습니다. NMDG 솔루션도 마찬가지입니다.
  5. 실험하는 동안 항상 나트륨이 없는 HBSS를 얼음처럼 차갑게 유지하십시오.

3. 쥐에서 해마 해부를 위한 자료 정리

  1. 실험을 시작하기 전에 싱크대 옆의 해부 구역을 정리합니다. 벤치를 깨끗하게 유지하기 위해 싱크대에 쥐를 위한 특정 단두대(쥐의 경우 날카로운 가위를 사용할 수 있음)를 배치하십시오.
  2. 뇌 제거 및 해마 박리를 위한 수술 기구 및 기타 재료를 사용 순서대로 그리고 필요한 위치에 가능한 한 가깝게 배치합니다( 재료 표 참조). 페트리 접시를 얼음 양동이에 넣으십시오. 또한 사체를 처리할 수 있도록 비닐 봉지를 근처에 두십시오.
  3. 두 HBSS 용액을 모두 권장 농도로 준비하여 사용합니다. 나트륨이 없는 HBSS는 실험 전에 냉동 및 해동할 수 있습니다.
    1. 나트륨 함유 HBSS를 이전에 권장했던 대로 두 부분으로 분리합니다: 하나는 37°C에서 가열되고 다른 하나는 4°C에서 가열되어 해부에 사용됩니다. 무나트륨 HBSS를 해동하고 4°C에서 유지합니다.
  4. 마취를 유도하려면 3% 이소플루란31을 사용하십시오. 실험을 시작하기 전에 뒷발의 각막 반사 및 통각 자극이 없는지 확인하십시오.
    참고: 적절한 마취제는 조사 중인 매개변수를 방해하지 않아야 하므로 적절한 마취제를 선택할 때 주의하십시오. 이 프로토콜의 경우 흡입 마취제(예: 이소플루란)를 사용하는 것이 좋습니다32.

4. 쥐를 안락사시키는 것

  1. IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)와 미국 국립보건원(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에서 승인한 방법을 사용하여 설치류를 안락사시킵니다(NIH Publications No. 8023, 1978년 개정).
  2. 단두대를 사용하여 첫 번째 경추 직전에 쥐의 목을 베십시오.
  3. 차가운 식염수를 적신 깨끗한 종이 타월 위에 머리를 올려 놓습니다. 수술용 가위 S 사이즈로 두피를 완전히 제거하고 두개골 상면의 봉합사를 완전히 노출시키는 것을 목표로 피부 근육을 제거합니다. 후두골 근처에서 시작하여 후방으로 코뼈까지 이 절차를 조심스럽게 시작하십시오.
    참고: 실험 모델이 생쥐인 경우 날카로운 가위를 사용하여 머리를 제거하십시오. 과도한 조직을 배제하기 위해 두개골 바로 뒤를 절개해야 합니다.

5. 쥐의 뇌 제거

  1. 가능한 한 빨리 뇌 제거를 수행합니다. 적절한 뼈 플라이어를 사용하여 쥐의 두개골에 있는 두 구멍을 연결하는 두 눈구멍 사이를 한 번 절개합니다. 그런 다음 수술용 가위 크기 S의 한 끝을 천공 매그넘에 넣고 두개골을 측면으로 한 번 자릅니다. 반대쪽도 반복합니다.
  2. 후두판에서 두개골 플레이트를 절단한 다음 두정판의 정중선 봉합선을 따라, 마지막으로 코를 향한 전두판까지 절단합니다. 설치류의 머리를 단단히 잡고 아래 조직이 손상되지 않도록 압력이 뇌에서 멀어지도록 합니다.
    참고: 아래 조직이 손상되지 않도록 뇌에서 압력을 가하는 것이 매우 중요합니다. 어린 쥐와 생쥐에서는 작은 수술 용 가위로 두개골을자를 수 있습니다.
  3. 주걱이나 집게를 사용하여 양쪽 반구에서 후두판과 두정판을 부드럽게 제거합니다. 두개골 뼈에 붙어 뇌 표면을 가로질러 뻗어 있을 수 있는 경막 물질이 있는지 주의 깊게 검사하십시오.
  4. 얇은 양단 주걱으로 즉시 뇌를 제거하고 여과지로 덮인 얼음처럼 차가운 페트리 접시에 뇌 전체를 부드럽게 놓습니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 얼음처럼 차가운 식염수로 적십니다. 즉시 아래 설명과 같이 양쪽 뇌 반구에서 해마를 해부하기 시작합니다.
  5. #11 메스 날로 뇌 전체에서 소뇌를 조심스럽게 절제합니다. 대뇌 반구를 완전히 분리하기 위해 반구 내 열구 전체에 메스 날을 실행합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 적시고 보존하기 위해 얼음처럼 차가운 HBSS 버퍼를 자주 적십니다.
  6. 각 반구를 따로 떼어내고, 홍채 가위로 위에 있는 피질에서 뇌간과 중뇌를 절제한다. 조심스럽게 수술용 가위로 뇌간/중뇌/시상을 자르고 얇은 브러시로 이러한 뇌 구조를 아래로 누르고 당깁니다. 아래에서는 해마(내측 표면)와 외측 뇌실을 관찰할 수 있습니다. 해마가 있는 피질은 이제 뇌간으로부터 자유로워야 한다.

6. 쥐의 해마 해부

  1. 해마를 절제하려면 두정엽 피질이 아래를 향하도록 관상동맥 평면에 한쪽 뇌 반구를 놓습니다. 이 순간, 해마의 바닥에서 얕은 쌍곡선을 형성하는 흰색 핌브리아 섬유를 관찰 할 수 있습니다.
  2. 매우 조심스럽게 주로 사용하지 않는 손으로 얇은 핀셋으로 뇌 조직을 고정합니다. 주로 사용하는 손으로 다른 핀셋을 해마의 꼬리 끝 아래에 놓습니다.
  3. 내측 백질관을 고정하고 핀셋을 해마 아래에 완전히 위치시켜 뇌의 나머지 부분과 부드럽게 분리합니다. 두 번째 팁을 약간 앞쪽과 옆으로 움직이면서 압력을 가합니다. 제대로 수행되면 해마가 여과지에 닿을 것입니다.
  4. 해마 박리를 마치려면 동일한 핀셋으로 여분의 조직(일반적으로 남아 있는 피질, 혈관 및 백질)을 제거합니다. 두 번째 반구에 대해 동일한 방법론을 반복합니다.
  5. 두 해마를 모두 제거한 후 HBSS를 얼음 양동이에 올려 놓고 페트리 접시에 옮기고 티슈 초퍼의 날 위에 있는 절단 테이블 영역으로 옮깁니다. 조사에서 별도로 분석해야 하는 경우 등쪽과 복부 영역을 적절하게 식별해야 합니다.
    참고: 해마를 해부하는 동안 항상 배쪽과 등쪽 부분을 구별하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 앞쪽 끝이 위쪽을 향하게 됩니다(33). 해마의 이 부분은 뒤쪽 끝보다 약간 얇습니다.

7. 슬라이스 준비

참고: 벤치(세션 2)에 수술 재료를 배치하는 동안 절제된 해마에서 횡단 절편을 얻을 수 있도록 조직 다지기를 준비합니다.

  1. 사용하기 전에 조직 다지기의 매개변수를 설정하십시오. 초퍼는 100μm에서 400μm까지 슬라이스를 절단할 수 있습니다. 300μm로 설정합니다. 또한 슬라이싱 절차 중에 조직의 무결성을 유지하기 때문에 분당 60-80 스트로크 범위를 권장합니다.
  2. 세션 2에서 수행된 모든 절차가 끝난 후, 해마를 뇌에서 절제하고 부드러운 폴리프로필렌 지지대 위에 차가운 식염수로 가습한 여과지 위에 놓은 후 각 해마를 여과지에 정렬한 후 다지기 절차에 제출합니다.
  3. 조직 헬기의 원형 스테인리스 스틸 절단 테이블에 한 번에 해마를 놓고 절단 날에 수직으로 하여 중격-측두 축을 따라 가로 해마 조각을 얻습니다. 다지기 전에 이소프로필 알코올을 사용하여 칼날을 가볍게 가습하십시오. 이 절차는 조직이 칼날에 달라붙는 것을 방지하여 보다 부드럽고 정확하게 자를 수 있습니다.
  4. 장비를 켠 후 도마의 날을 올리고 내려 선택한 두께로 조직을 자릅니다. 이것은 빠른 과정이며 일반적으로 조직은 1분 후에 적절하게 절단됩니다. 하나 이상의 해마를 절단 테이블에서 적절하게 분리하여 보관하면 동시에 절단할 수 있습니다.
  5. 조각을 분리하려면 양단 주걱을 사용하여 조직 다지기에서 얇게 썬 각 샘플을 조심스럽게 가져와서 얼음처럼 차가운 식염수가 든 페트리 접시에 넣습니다. 두 개의 얇은 브러시를 사용하여 해마를 부드럽게 꼬집고 조각을 분리합니다. 이 프로세스를 통해 슬라이스 무결성을 유지하도록 주의하십시오.
    1. 이 실험을 3회씩 수행하여 각 샘플에서 6개의 슬라이스를 선택합니다: 총 글루타메이트 흡수에 대해 3개의 슬라이스와 비특이적 흡수에 대해 3개의 슬라이스.
  6. 브러시를 사용하여 페트리 접시의 각 조각을 다음을 포함하는 24웰 플레이트로 부드럽게 옮깁니다: (i) HBSS 1mL; (ii) 1mL의 HBSS 무나트륨. 해당 실험 그룹과 함께 웰/플레이트를 식별하고 적어도 세 번으로 분석을 수행합니다.
    참고: 시간 제한 문제로 인해 실험을 세 번으로 수행하는 경우 동물/그룹의 수를 한 번에 6개로 제한합니다(5분 흡수에 동물 당 해마 1개). 이는 L-[3H]-글루타메이트가 모든 슬라이스가 배양될 때까지 15초마다 투여된다는 것을 의미합니다. 반응을 중지하려면 모든 샘플이 5분의 배양 기간에 노출되도록 동일한 간격을 관찰해야 합니다.

8. 글루타메이트 흡수 분석

  1. 각 완충액(HBSS 또는 무나트륨 HBSS)에서 슬라이스가 안정화되는 동안 L-[3H]-글루타메이트를 멸균수에서 최종 농도 4.5μCi/mL로 희석하여 슬라이스당 20μL에 약간의 초과량을 허용하여 배치 종료 시 방사성 입력 부족을 방지할 수 있는 방사성 함유 용액을 준비합니다. 처음에 각 슬라이스에 얼마나 많은 DPM(Disintegrations Per Minute)이 제공되었는지 정량화해야 하기 때문입니다.
    참고: 각 24웰 플레이트에 대해 L-[3H]-글루타메이트 흡수에 필요한 총 배양 시간(5분)과 각 20μL 분취량(각 웰에서 0.33μCi)을 피펫팅하는 시간으로 인해 각 24웰 플레이트에 대해 500μL의 4.5μCi/mL L-[3H]-글루타메이트를 준비하는 것이 좋습니다. L-[3H]-글루타메이트의 스톡 농도는 일반적으로 1.0 mCi/mL이므로 슬라이스에 적용할 1:200 희석액을 준비합니다.
  2. HBSS에서 15분 동안 사전 배양한 후 파스퇴르 피펫으로 완충액을 완전히 제거하고 다음 중 하나의 슬라이스 280μL를 추가하여 교체합니다. (i) 총 흡수를 위한 일반 HBSS(37°C); 또는 (ii) 불특정 흡수를 위한 무나트륨 HBSS(4°C). 총 흡수는 37°C의 가열판에서 수행해야 하는 반면 불특정 흡수는 얼음에서 수행된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
  3. 하나의 타이머를 준비하고 슬라이스를 포함하는 첫 번째 웰에 20μL 입력을 추가할 때 실험의 시작을 설정합니다. 15 - 20초 동안 기다린 후(플레이트의 슬라이스 수에 따라 다름) 방사성 입력을 다음 웰에 추가하는 식으로 슬라이스가 포함된 웰이 끝날 때까지 계속합니다. 항상 총 배양 시간(5분)을 고려하여 모든 웰에 20μL의 입력을 분배합니다.
  4. 플레이트에 슬라이스를 포함하는 각 웰이 채워지면 첫 번째 슬라이스가 L-[3H]-글루타메이트로 5분 배양이 완료될 때까지 기다립니다. 그런 다음 즉시 배양 매체를 방사성 폐기물이 있는 적절한 플라스크로 제거합니다.
  5. 제거 직후 얼음처럼 차가운 HBSS 300μL를 빠르게 넣고 부드럽게 제거합니다. 각 웰에서 이 절차를 두 번 더 반복하여 각 조각에 대해 세 번의 세척을 완료합니다. 불특정 흡수 측정에 전념하는 슬라이스를 세척하기 위해 나트륨이 없는 HBSS를 사용해야 합니다. 플레이트의 모든 슬라이스를 세척 한 후 각 웰에 300 μL 0.5 M NaOH를 첨가하고 파라 필름으로 보호 된 플레이트를 4 ° C에서 밤새 보관합니다.

9. 방사성 L-[3H]-글루타메이트 계수

  1. 다음 날에는 실험에서 slices만큼 튜브에 라벨을 붙이고 웰의 내용물을 각 튜브에 수집합니다. 슬라이스가 용해 용액에 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 필요한 경우 1mL 주사기에 연결된 26게이지 바늘을 사용하여 샘플을 균질화합니다.
  2. 약 1.5mL의 최종 부피에 1.2mL의 섬광 액체를 추가하고 소용돌이의 모든 샘플을 균질화한 후 각각 60초 동안 섬광 카운터에서 판독합니다.
    참고: 검출 매개변수가 삼중수소로 설정되어 있고 결과가 DPM으로 전달되는지 확인하십시오.

10. 계산

  1. 섬광 계수기에 의해 제공된 결과를 슬라이스 내에 갇힌 시약에서 방출되는 방사능으로 변환하고 흡수된 글루타메이트의 양을 나타냅니다. 일반 HBSS로 얻은 결과에서 불특정 흡수에 대해 얻은 값을 뺍니다. 1μCi는 2.22×106DPM 에 해당합니다.
  2. μCi의 양과 [3H]L-글루타메이트의 원래 농도(일반적으로 시약의 플라스크 또는 데이터시트에 제공된 정보)를 알고 있으면 각 슬라이스에서 포획된 L-[3H]-글루타메이트를 계산합니다.

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결과

글루타메이트 흡수는 뇌의 신경 전달을 조절하는 가장 중요한 메커니즘 중 하나입니다. 특히 해마는 글루타메이트 신호전달에서 중요한 위치를 차지하며, 뇌의 기억, 인지 및 감정을 연결하는 중요한 허브입니다. 프로토콜에 따라 성인 수컷 Wistar 쥐를 사용하여 대표적인 결과를 생성했습니다. 동물은 의식을 잃을 때까지 이소플루란 3%를 사용하여 마취했습니다. 뇌를 해?...

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토론

제시된 프로토콜은 해마 절편을 사용하여 수행하기 쉬운 글루타메이트 흡수 평가를 보여줍니다. 그 결과, AHS는 정기적으로 약 60 fmol의 방사성 표지된 L-[3H]-글루타메이트를 흡수하고, 슬라이스의 두께(단백질 양)가 L-[3H]-글루타메이트 흡수에 영향을 미치지 않았으며(데이터는 표시되지 않음), 해마의 등쪽, 중간 및 복부 부분이 순진한 성인 수컷 Wistar 쥐에...

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공개

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감사의 말

저자는 브라질 국립과학기술연구소(Brazilian National Institute of Science and Technology)로부터 Excitotoxicity and Neuroprotection [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0], 및 [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]로부터 재정 지원을 받습니다.

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
#11 scalpel bladeSwann-Morton525
100 mm glass petri dishCommon suppliers
110 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001110
42.5 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001042
24-well cell culture plateFalcon353047
BeckerCommon suppliers
Blades for the tissue chopperWilkinson3241
Bone rongeurErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-Aspartic acidPerkinElmerNET581001MC11.3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-GlucoseSigma AldrichG8270
N-Methyl-D- GlucamineSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Iris scissorsErwin Guth8,00,040
IsofluraneCristalia (São Paulo, Brazil)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-Glutamic AcidPerkinElmerNET490005MC49.7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Plastic Pasteur pipetteCommon suppliers
Scintillation liquidPerkinElmer1200.437 for 1 x 5 LiterOptiphase HiSafe 3
Small surgical scissorsErwin Guth8,00,040
Small tweezersErwin Guth6,00,131
Spare chopping discs for the chopperCommon suppliers
Standard scissorsErwin Guth8,00,010
Thin brushes (size 0 or 2)Common suppliers
Thin double-ended spatulaErwin Guth470.260E
Tissue ChopperTed Pella, Inc.10180

참고문헌

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