JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר דרך אמינה ופשוטה להשיג פרוסות רוחביות היפוקמפוס חריפות ex vivo מעכברים וחולדות באמצעות קוצץ רקמות. ניתן להגיש פרוסות שהתקבלו מההיפוקמפוס שנכרת לניתוח ספיגת גלוטמט פונקציונלי כדי לחקור הומאוסטזיס של המערכת הגלוטמטרגית.

Abstract

הסרת גלוטמט מהחלל החוץ-תאי על ידי טרנספורטרים תלויי Na+ בעלי זיקה גבוהה חיונית כדי להבטיח שמנגנוני הקישוריות הפנימיים של המוח פועלים כראוי וההומאוסטזיס נשמר. ההיפוקמפוס הוא מבנה מוח ייחודי המנהל תפקודים קוגניטיביים גבוהים יותר, והוא נושא למספר מחקרים על מחלות נוירולוגיות. חקירת מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים במודלים של מכרסמים יכולה להפיק תועלת מתכשירי פרוסת היפוקמפוס חריפה (AHS). ל-AHS יש יתרון בכך שהוא מספק מידע אמין על תפקוד התא מכיוון שהציטו-ארכיטקטורה והמעגלים הסינפטיים נשמרים. למרות שתכשירי AHS נמצאים בשימוש נפוץ במעבדות נוירוכימיה, ניתן למצוא כמה הבדלים מתודולוגיים בספרות. בהתחשב בכך שפרוטוקולי הכנת פרוסות ייחודיים עשויים לשנות את אזורי ההיפוקמפוס שנותחו, פרוטוקול נוכחי זה מציע טכניקה סטנדרטית להשגת AHS רוחבי מההיפוקמפוס שנכרת. פרוטוקול פשוט לביצוע זה עשוי לשמש במודלים ניסיוניים של עכברים וחולדות ולאפשר מספר גישות ex vivo החוקרות דינמיקה נוירוכימית (בהיפוקמפוס גבי, ביניים וגחוני) ברקעים שונים (למשל, מניפולציות טרנסגניות) או לאחר מניפולציות in vivo (למשל, טיפולים תרופתיים או מודלים מתאימים של מכרסמים לחקר הפרעות קליניות). לאחר ניתוח ההיפוקמפוס ממוח המכרסם, התקבלו פרוסות רוחביות לאורך ציר הספטו-טמפורלי (בעובי 300 מיקרומטר). AHS אלה מכילים חלקים נפרדים של ההיפוקמפוס והיו נתונים לחקירה נוירוכימית פרטנית (כדוגמה: מובילי נוירוטרנסמיטורים המשתמשים במצעים שלהם). מכיוון שההיפוקמפוס מציג צפיפות גבוהה של סינפסות מעוררות, וגלוטמט הוא המוליך העצבי החשוב ביותר במוח, המערכת הגלוטמטרגית היא מטרה מעניינת לתופעות שנצפו in vivo. לפיכך, הפרוטוקול הנוכחי מספק שלבים מפורטים לחקר ספיגת גלוטמט ב-AHS ex vivo באמצעות L-[3H]-Glutamate. שימוש בפרוטוקול זה כדי לחקור את תפקוד ההיפוקמפוס עשוי לעזור להבין טוב יותר את ההשפעה של חילוף החומרים של גלוטמט על מנגנונים של הגנה עצבית או רעילות עצבית.

Introduction

ההיפוקמפוס, מבנה מוח הקבור עמוק באונה הרקתית האמצעית של כל המיספרה, שבה נמצאים תפקודים קוגניטיביים גבוהים, הוא אחת הישויות הנחקרות ביותר של מערכת העצבים המרכזית (CNS). תפקוד ההיפוקמפוס קשור קשר הדוק לזיכרון הצהרתי ומרחבי. מבנה זה ממלא תפקיד גם בהתנהגות רגשית ובוויסות תפקודי ההיפותלמוס 1,2,3,4. מאז שאושר, מנגנונים חשובים של היווצרות ואחסון זיכרון מתרחשים באזור זה והתחום החל לחקור לעומק את אזור ההיפוקמפוס. בהתאם לכך, השימוש במודלים של בעלי חיים הדומים להפרעות מוחיות אנושיות הקשורות לתפקודי ההיפוקמפוס, כגון מחלת אלצהיימר, אפילפסיה, דיכאון מג'ורי ומתח, ממשיך לגדול.

במכרסמים, ההיפוקמפוס הוא מבנה בצורת מעוקל המתחיל בסמוך למחיצה המדיאלית לכיוון קליפת המוח הטמפורלית הגחונית. לאורך ציר האורך שלו, ניתן לחלק את ההיפוקמפוס לשלושה אזורים שונים, כל אחד מהם קשור למעגל ספציפי1. החלק העליון מהווה את ההיפוקמפוס הגבי/מחיצה, החלק התחתון מהווה את ההיפוקמפוס הגחוני/טמפורלי, והאזור שביניהם נחשב להיפוקמפוס הביניים. יש ספרות נרחבת המכסה את ההבדלים בהקרנות התאיות לכל חלק, כמו גם דיווחים על היבטים קוגניטיביים ספציפיים שעובדו על ידיכל 5,6. לגבי הארגון הפנימי שלו, ניתן להפריד את אזורי ההיפוקמפוס על ידי אזורי התפקוד שלו. אזור ה-Cornu ammonis (CA) מחולק ל-CA1, CA2 ו-CA3, ומשתרע דרך החלק העליון של ההיפוקמפוס, מעל הבליטה המשוננת (DG) והסוביקולום, שהם החלקים הפנימיים ביותר של ההיפוקמפוס (איור 1). הסינפסות הממוקמות באזורים אלה עוברות סידור מחדש מתמשך, המראה תהליכים נוירוגניים ופלסטיים לאורך החיים3. מספר מחקרים כבר הראו כי מניפולציות ניסיוניות מובהקות בהיפוקמפוס גורמות למוגבלות קוגניטיבית7. לגבי הערכת שינויים ביוכימיים ומולקולריים, טכניקות המשתמשות בפרוסות מוח חריפות הן כלי מצוין לשיפור הידע לגבי היבטים שונים של ההיפוקמפוס.

בשל הדיוק ויכולת השחזור שלו, מחקרים רבים שחקרו היבטים של תופעות הקשורות להעברה עצבית (פעילות אנזים, קליטה או שחרור) השתמשו ב-AHS רוחבי מההיפוקמפוס שנכרת שהושג על ידי קוצץ רקמות 8,9,10,11,12. טכניקת חיתוך זו ואחריה הערכת קליטה מתאימה לניסויים נוירוכימיים מתוחכמים הדורשים שימור פעילות הטרנספורטר מרקמת ההיפוקמפוס. לשם כך, עדיף להשתמש בקוצץ רקמות, מכיוון שהוא מהיר יותר מהוויברטום ומספק את ה-AHS בזמן מתאים לשימוש ניסיוני בדיוק מתאים.

ההולכה העצבית המעוררת במוח מושגת על ידי גלוטמט, המוליך העצבי הנפוץ ביותר, כולל בהיפוקמפוס, התלוי באיתות גלוטמט במידה רבה יותר13,14. שפע המוליכים העצביים הזה נשלט היטב בסביבה החוץ-תאית. בתוך שלפוחיות תוך-תאיות, לעומת זאת, הוא יכול להגיע עד 100 מ"מ15. לאחר שחרורו בשסע הסינפטי, גלוטמט אינו עובר חילוף חומרים ויש להסירו על מנת למנוע אקסיטוטוקסיות, המופעלת בדרך כלל כתגובה לעומס יתר של גלוטמט14,16. המנגנון היחיד המפריד בין רעילות לאיתות רגיל הוא הובלה תלויה בנתרן באמצעות פעילות של חלבונים הממוקמים בקרומי הפלזמה של, בעיקר, תאי גליה 14,17,18,19. טרנספורטרים אלה [GLAST (EAAT1) ו-GLT-1(EAAT2)] מווסתים היטב את רמות הגלוטמט החוץ-תאי וניתן לווסת אותם על ידי מגוון רחב של גורמים, כגון שעתוק DNA, שחבור ופירוק mRNA, סינתזה ומיקוד חלבונים, פעילות הובלת חומצות אמינו ופעילויות תעלות יונים 20,21,22,23. בהתאם לכך, ניתן למדוד את פעילותם על ידי הובלת מצע מסומן רדיו, כגלוטמט.

השימוש במצעים מסומנים ברדיו מייצג שיטה עדיפה לכימות פעילות הטרנספורטר מכיוון שהם מאפשרים מעקב אחר מנגנונים דינמיים כגון הובלה על פני קרומי התאים. מלבד הרגישות והספציפיות הגבוהות שלהם, היתרונות של ניסויי רדיו-טרייסר כוללים את פשטותם והוצאותיהם הקטנות בהשוואה לטכנולוגיות מתחרות כגון ספקטרומטריית מסה24. כמו כן, על ידי שימוש בכמויות קטנות בלבד של עוקב, הרמות הפיזיולוגיות של הסובסטרטים אינן משתנות, ובכך מספקות תמונה מייצגת יותר של תרחיש הפעילות המטבולית האמיתית.

הזמינות של גישות ניסיוניות ex vivo היא קריטית לתמיכה במחקר בסיסי על זיהוי מטרות מולקולריות חדשות ופעילויות גילוי תרופות. לפיכך, בהתחשב ברלוונטיות של ספיגת הגלוטמט להומאוסטזיס של המערכת הגלוטמטרגית והדומיננטיות הגבוהה של סינפסות גלוטמטרגיות בהיפוקמפוס, פרוטוקול זה מדגים כיצד להעריך את פעילות ספיגת הגלוטמט בשיטה מהירה וקלה לשכפול באמצעות AHS רוחבי מההיפוקמפוס הכרות. בדיקה זו משתמשת ב-L-[3H]-Glutamate, המאפשר השוואות כמותיות והדמיה ברורה של התוצאות, וניתן לשנות אותו לשימוש עם מצעים ספציפיים או מותאמים אישית, על פני מגוון רחב של תנאי תגובה25.

פרוסות מוח חריפות מציגות יתרונות רבים ושימשו לתמיכה בשינוי תפקוד תחת מניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות 26,27,28. השימוש בהם נהנה מהדברים הבאים: (i) שימור הפונקציונליות הנוירוכימית ואינטראקציות בין תאים; (ii) האפשרות לבצע מניפולציות פרמקולוגיות וגנטיות רבות כדי לחקור מסלולים העומדים בבסיס תפקודי עצב וגליה; (3) בקרה מדויקת על הסביבה החוץ-תאית; ו-(iv) גישה ניסויית טובה לאזורים שונים בהיפוקמפוס (כגון CA1, CA3 או DG), שנשמרים באותה פרוסה בהתאם לשיטת החיתוך. בהתחשב בכך שפרוטוקולי הכנת פרוסות ייחודיים עשויים לשנות את אזורי ההיפוקמפוס החשופים, פרוטוקול זה מציע טכניקה סטנדרטית להשגת AHS רוחבי מההיפוקמפוס הכרות. פרוטוקול פשוט לביצוע זה עשוי לשמש במודלים של מכרסמים ועשוי לאפשר מספר גישות ex vivo החוקרות דינמיקה נוירוכימית ברקעים שונים או לאחר מניפולציות in vivo29,30 (איור 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם למדריך ה-NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (אישור פרויקט # 33732/CEUA-UFRGS). כל המאמצים נעשו כדי למזער את אי הנוחות ואת מספר החיות ששימשו בניסויים.

1. הכנת תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)

  1. בכוס של 1 ליטר, מוסיפים כ-0.5 ליטר מים סטריליים או מזוקקים כפולים ומתחילים לערבב במרץ על מערבל מגנטי. הוסף את רכיבי HBSS הבאים (במ"מ): 137 NaCl, 0.63 Na2HPO4, 4.17 NaHCO3, 5.36 KCl, 0.44 KH2PO4, 0.41 MgSO4, 0.49 MgCl2, 5.55 D-גלוקוז (ראה טבלה 1).
  2. התאם את ה-pH ל-7.4 עם NaOH או HCl לפני הוספת 1.26 מ"מ CaCl2 כדי למנוע משקעים. מוסיפים את המלח הזה לאט מאוד ותחת תסיסה. הביאו אותו לנפח של 1 ליטר עם מים סטריליים או מזוקקים כפולים. מאגר זה ישמש לשטיפת הרקמה ולשמירה על ה-AHS במצב בר-קיימא במהלך הניסוי. הוא יספק יונים אנאורגניים תוך שמירה על pH פיזיולוגי ולחץ אוסמוטי.
    הערה: הוספת קטיונים דו-ערכיים נעשית לאחר טיטרציה של pH כדי למנוע משקעים.
  3. הפרד שני שברים שונים של HBSS: אחד יישמר באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס וישמש במהלך פרדיגמת הקליטה, בעוד השני יישמר קר כקרח (4 מעלות צלזיוס) וישמש לשטיפות לפני ואחרי הניסוי.
    הערה: ניתן להכין תמיסות מלאי מכל מלח ולשמור אותן קפואות עד השימוש, לאחסן במקפיא (-20 מעלות צלזיוס) ולהשתמש בו תוך מספר שבועות.

2. הכנת HBSS ללא נתרן

  1. לפני ערבוב הרכיבים ל- HBSS נטול נתרן, הכינו מראש שני פתרונות נוספים: גלוקמין-HCl (137 מ"מ) וגלוקמין-HEPES (4.17 מ"מ). מערבבים ריכוזים שווי ערך של בסיס NMDG ו-HCl לקבלת תמיסת גלוקאמין-HCl. בצע את אותו הליך עם חומצה נטולת HEPES 2.0 M כדי לקבל את תמיסת NMDG-HEPES (ראה טבלה 2).
  2. בכוס של 0.5 ליטר מוסיפים כ-0.2 ליטר מים סטריליים או מזוקקים כפולים ומתחילים לערבב במרץ במערבל מגנטי. הוסף את רכיבי המאגר הבאים (במ"מ): 137 גלוקמין-הידרוכלוריד, 4.17 גלוקמין-HEPES, 5.36 קילו-צ'ל, 0.44 ק"ש2PO4, 1.26 מ"ג SO4, 0.41 מ"ג Cl2 ו-5.55 D-גלוקוז (ראה טבלה 2).
  3. התאם את ה-pH ל-7.4 עם KOH או HCl והמשיך לערבב. הוסף 1.26 מ"מ CaCl2 לאט מאוד ותחת תסיסה. הביאו את התמיסה לנפח של 0.3 ליטר עם מים סטריליים או מזוקקים כפולים.
    הערה: מאגר זה ישמש למדידת ספיגת גלוטמט שאינה תלויה בנתרן, מה שיאפשר מדידה של ספיגת גלוטמט פסיבית/לא ספציפית. לאחר הניסוי, פרמטר זה מופחת מספיגת הגלוטמט הכוללת כדי לקבוע ספיגה תלויה בנתרן.
  4. לאחר ההכנה, ניתן לאחסן את המאגר הזה במקפיא (-20 מעלות צלזיוס) ולהשתמש בו לאחר מכן בניסויים הבאים. אותו דבר לגבי פתרונות NMDG.
  5. במהלך הניסוי, שמור תמיד על קרח HBSS נטול נתרן.

3. ארגון החומר לדיסקציה של ההיפוקמפוס מחולדות

  1. ארגן את אזור הדיסקציה ליד הכיור לפני תחילת הניסוי. מקם גיליוטינה ספציפית לחולדות (לעכברים ניתן יהיה להשתמש במספריים חדים) בכיור כדי לשמור על ניקיון הספסל.
  2. סדרו את המכשירים הכירורגיים וחומרים אחרים להסרת מוח ודיסקציה של ההיפוקמפוס לפי סדר השימוש וקרוב ככל האפשר למקום שבו הם נדרשים (ראו טבלת חומרים). מניחים את צלחת הפטרי בדלי קרח. כמו כן, שמור שקית ניילון בקרבת מקום לסילוק הפגר.
  3. הכן את שתי תמיסות HBSS בריכוז המומלץ לשימוש. ניתן להקפיא ולהפשיר את ה-HBSS נטול הנתרן לפני הניסוי.
    1. הפרד HBSS המכיל נתרן לשני חלקים נפרדים, כפי שהומלץ בעבר: אחד מחומם ב-37 מעלות צלזיוס והשני ב-4 מעלות צלזיוס שישמש לדיסקציה. יש להפשיר HBSS נטול נתרן ולשמור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. כדי לגרום להרדמה, השתמש ב-3% איזופלורן31. לפני תחילת הניסוי, הקפד לוודא את היעדר רפלקס הקרנית וגירוי נוסיספטיבי של הכפה האחורית.
    הערה: הקפד לבחור את תרופת ההרדמה המתאימה, מכיוון שהיא לא אמורה להפריע לפרמטרים כלשהם שיהיו בבדיקה. עבור פרוטוקול זה, מומלץ להשתמש בהרדמה ממלפת (למשל, איזופלורן)32.

4. המתת חסד של החולדה

  1. המתת חסד של המכרסם באמצעות השיטות המאושרות על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), כמו גם על ידי המדריך הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסומי NIH מס' 8023, מתוקן 1978).
  2. בעזרת גיליוטינה, ערפו את ראשה של החולדה מיד לפני חוליית צוואר הרחם הראשונה.
  3. הניחו את הראש על מגבת נייר נקייה לחה בתמיסת מלח קרה. הסר לחלוטין את הקרקפת עם המספריים הכירורגיים בגודל S, כמו גם את השריר העורי במטרה לחשוף את התפרים במלואם על פני השטח העליונים של הגולגולת. התחל הליך זה בזהירות, החל בסמוך לעצם העורף ועובר לאחור לעצם האף.
    הערה: במקרה שהדגם הניסיוני הוא עכברים, השתמש במספריים חדים כדי להסיר את הראש. הקפד לחתוך ממש מאחורי הגולגולת כדי לא לכלול רקמות עודפות.

5. הסרת מוח החולדה

  1. בצע הסרת מוח במהירות האפשרית. בעזרת צבת עצם מתאימה, בצע חתך יחיד בין שני חורי העיניים המחבר את שני הפתחים בגולגולת החולדה. לאחר מכן, הנח קצה אחד של המספריים הכירורגיים בגודל S לתוך הנקב מגנום ובצע חתך בודד לרוחב לתוך הגולגולת. חזור על הפעולה עבור הצד השני.
  2. חותכים את לוחות הגולגולת מהצלחת העורפית, ואז לאורך תפר קו האמצע של הלוחות הקודקודיים, ולבסוף לצלחת הקדמית לכיוון האף. ודא שראש המכרסם מוחזק בחוזקה ושהלחץ מופנה הרחק מהמוח כדי למנוע פגיעה ברקמה שמתחתיו.
    הערה: חשוב מאוד שהלחץ יופנה הרחק מהמוח כדי למנוע נזק לרקמה שמתחתיו. בחולדות ועכברים צעירים ניתן לחתוך את הגולגולת במספריים כירורגיים קטנים.
  3. הסר בעדינות את הלוחות העורפיים והקודקודיים משתי ההמיספרות באמצעות מרית או מלקחיים. בדוק בזהירות אם יש חומר דורה שעשוי להיות מחובר לעצמות הגולגולת ונמתח על פני השטח של המוח.
  4. הסר את המוח מיד בעזרת המרית הדו-צדדית הדקה והניח בעדינות את כל המוח על צלחת פטרי קרה כקרח מכוסה בנייר פילטר. בעזרת פיפטת פסטר מפלסטיק מרטיבים אותה בתמיסת מלח קרה כקרח. התחילו מיד לנתח את ההיפוקמפוס משתי ההמיספרות של המוח, כפי שמוסבר להלן.
  5. כרתו בזהירות את המוח הקטן מכל המוח בעזרת להב האזמל #11. על מנת להפריד לחלוטין את חצאי המוח, העבירו להב אזמל לאורך הסדק התוך-חצי כדורי. בעזרת פיפטת פסטר מפלסטיק, הרטיבו אותה עם מאגר HBSS קר כקרח לעתים קרובות כדי לשמור על הרקמה רטובה ונשמרת.
  6. קחו כל המיספרה בנפרד, חתכו את גזע המוח והמוח האמצעי מקליפת המוח שמעליו בעזרת מספריים של קשתית. בזהירות, בעזרת המספריים הכירורגיים חותכים את גזע המוח/מוח אמצעי/תלמוס, תוך כדי מברשת דקה דוחפים כלפי מטה ומושכים את מבני המוח הללו. להלן ניתן יהיה לצפות בהיפוקמפוס (משטח מדיאלי) ובחדר הרוחבי. קליפת המוח עם ההיפוקמפוס אמורה כעת להיות חופשיה מגזע המוח.

6. דיסקציה של ההיפוקמפוס מחולדות

  1. כדי לכרות את ההיפוקמפוס, הניחו המיספרה אחת של המוח במישור העטרה כשקליפת המוח הקודקודית פונה כלפי מטה. ברגע זה ניתן לצפות בסיבי הפימבריה הלבנים היוצרים היפרבולה רדודה בתחתית ההיפוקמפוס.
  2. בזהירות רבה, ביד הלא דומיננטית, עוגנים את רקמת המוח בפינצטה דקה. בעזרת היד הדומיננטית שלכם, הניחו פינצטה אחרת מתחת לקצה הזנב של ההיפוקמפוס.
  3. עיגון דרכי החומר הלבן המדיאלי, מקם את הפינצטה לחלוטין מתחת להיפוקמפוס כדי להפריד אותו משאר המוח בעדינות. הפעל לחץ תוך הזזת הקצה השני מעט קדימה ולרוחב. אם נעשה כראוי, ההיפוקמפוס אמור לנחות על נייר הסינון.
  4. כדי לסיים את דיסקציה של ההיפוקמפוס, הסירו את הרקמה הרזרבית עם אותם פינצטה (בדרך כלל כל קליפת המוח שנותרה, כלי דם וחומר לבן). חזור על אותה מתודולוגיה עבור חצי הכדור השני.
  5. לאחר הסרת שני ההיפוקמפוס, העבירו אותו לצלחת פטרי עם HBSS המונח על דלי הקרח והעבירו לאזור שולחן החיתוך מעל הלהב בקוצץ הרקמות. הקפד לזהות כראוי את אזורי הגב והגחון אם החקירה דורשת ניתוח בנפרד.
    הערה: חשוב תמיד להבחין בין חלקי הגחון והגב של ההיפוקמפוס במהלך דיסקציה. על ידי כך, הקצה הקדמי יפנה כלפי מעלה33. חלק זה של ההיפוקמפוס מעט דק יותר מהקצה האחורי.

7. הכנת פרוסות

הערה: תוך כדי סידור החומר הניתוחי על הספסל (מפגש 2), הכינו את קוצץ הרקמות כדי להשיג את הפרוסה הרוחבית מההיפוקמפוס שנכרת.

  1. הגדר את הפרמטרים במסוק הרקמות לפני השימוש בו. המסוק יכול לחתוך פרוסות בין 100 ל -400 מיקרומטר; הגדר אותו ל-300 מיקרומטר. בנוסף, מומלץ טווח של 60-80 משיכות לדקה, מכיוון שהוא שומר על שלמות הרקמה במהלך הליך החיתוך.
  2. לאחר כל ההליכים שבוצעו במפגש 2, לאחר שההיפוקמפוס נכרת מהמוח והונח על נייר הסינון שהורטב בתמיסת מלח קרה על גבי תומך פוליפרופילן חלק, יישר כל היפוקמפוס על נייר הסינון לפני הגשתו להליך הקיצוץ.
  3. הנח את ההיפוקמפוס בכל פעם על שולחן החיתוך העגול מפלדת אל-חלד מקוצץ רקמות, בניצב ללהבי החיתוך כדי להשיג את פרוסות ההיפוקמפוס הרוחביות לאורך ציר הספטו-טמפורלי. לפני שמתחילים בתהליך הקיצוץ, יש להרטיב קלות את הלהב באמצעות אלכוהול איזופרופיל. הליך זה מונע מהרקמה להידבק על הלהב, ומאפשר חיתוך חלק ומדויק יותר.
  4. לאחר הפעלת הציוד, הלהב בזרוע החיתוך יועלה ויפול, ופורס את הרקמה בעובי שנבחר. זהו תהליך מהיר, ובדרך כלל הרקמה תיחתך כראוי לאחר דקה. אפשר לקצוץ יותר מהיפוקמפוס אחד בו זמנית אם הם מופרדים כראוי על שולחן החיתוך.
  5. כדי להפריד את הפרוסות, קחו בזהירות כל דגימה פרוסה מקוצץ הטישו בעזרת המרית הדו-צדדית וצללו אותה לצלחת פטרי עם תמיסת מלח קרה כקרח. בעזרת שתי מברשות דקות צובטים בעדינות את ההיפוקמפוס ומפרידים את הפרוסות. הקפד לשמור על שלמות הפרוסה בתהליך זה.
    1. בצע ניסוי זה בשלוש פרוסות, ולכן בחר 6 פרוסות מכל דגימה: 3 פרוסות עבור ספיגת הגלוטמט הכוללת ו-3 עבור הספיגה הלא ספציפית.
  6. בעזרת המברשת, העבירו בעדינות כל פרוסה מצלחת הפטרי לצלחת של 24 בארות המכילה: (i) 1 מ"ל HBSS; ו-(ii) 1 מ"ל של HBSS ללא נתרן. זהה את הבאר/צלחת עם קבוצות הניסוי המקבילות ובצע את הניתוח לפחות בשלוש פעמים.
    הערה: עקב בעיה מוגבלת בזמן, אם הניסוי מבוצע בשלוש פעמים, הוא מגביל את מספר החיות/קבוצות ל-6 בלבד בכל פעם (היפוקמפוס אחד לכל חיה ב-5 דקות קליטה). המשמעות היא שה-L-[3H]-גלוטמט יינתן כל 15 שניות עד שכל הפרוסות מודגרות. כדי לעצור את התגובה, יש להקפיד על אותו מרווח כדי להבטיח שכל הדגימות חשופות לתקופת דגירה של 5 דקות.

8. בדיקת ספיגת גלוטמט

  1. במהלך ייצוב הפרוסות במאגר המתאים (HBSS או HBSS ללא נתרן), הכינו את התמיסה המכילה רדיואקטיבית על ידי דילול L-[3H]-Glutamate במים סטריליים לריכוז סופי של 4.5 μCi/mL בנפח סופי המאפשר 20 מיקרוליטר לפרוסה בתוספת עודף מסוים, מה שימנע את היעדר הקלט הרדיואקטיבי בסוף האצווה, מכיוון שיהיה צורך לכמת כמה התפרקות לדקה (DPM) הוצעה לכל פרוסה בהתחלה.
    הערה: עבור כל צלחת של 24 בארות, מומלץ להכין 500 מיקרוליטר של 4.5 μCi/mL L-[3H]- גלוטמט בשל זמן הדגירה הכולל הדרוש לספיגת L-[3H]-Glutamate (5 דקות) וזמן הפיפטה כל 20 μL aliquot (0.33 μCi בכל באר), כפי שמוסבר להלן. ריכוז המלאי של L-[3H]-גלוטמט הוא בדרך כלל 1.0 mCi/mL, לכן הכינו דילול של 1:200 למריחה על הפרוסות.
  2. לאחר 15 דקות של דגירה מוקדמת ב-HBSS, הסר לחלוטין את המאגר עם פיפטה פסטר והחלף אותו על ידי הוספת 280 מיקרוליטר לפרוסות של אחד מהבאים: (i) HBSS רגיל (37 מעלות צלזיוס) לספיגה כוללת; או (ii) HBSS נטול נתרן (4 מעלות צלזיוס) לספיגה לא ספציפית. חשוב לשים לב כי הספיגה הכוללת חייבת להתבצע על פלטת חימום ב-37 מעלות צלזיוס, בעוד שהספיגה הלא ספציפית מתבצעת על קרח.
  3. הכן טיימר אחד והגדר את תחילת הניסוי בעת הוספת קלט של 20 מיקרוליטר בבאר הראשונה המכילה פרוסה. המתן 15 - 20 שניות (תלוי במספר הפרוסות בצלחת) והוסף את הקלט הרדיואקטיבי לבאר הבאה וכן הלאה עד סוף הבארות המכילות פרוסה. הפץ 20 מיקרוליטר קלט בכל הבארות תוך התחשבות תמיד בזמן הדגירה הכולל (5 דקות).
  4. לאחר מילוי כל אחת מהבארות המכילות פרוסות בצלחת, המתן עד שהפרוסה הראשונה תשלים 5 דקות דגירה עם L-[3H]-Glutamate. לאחר מכן, הסר מיד את אמצעי הדגירה לבקבוק מתאים לפסולת רדיואקטיבית.
  5. מיד לאחר ההסרה, הוסף במהירות 300 מיקרוליטר HBSS קר כקרח והסר אותו בעדינות. חזור על הליך זה פעמיים נוספות בכל באר, והשלם שלוש שטיפות לכל פרוסה. הקפד להשתמש ב-HBSS נטול הנתרן לשטיפת הפרוסות המוקדשות למדידת הספיגה הלא ספציפית. לאחר שטיפת כל הפרוסות בצלחת, הוסיפו 300 מיקרוליטר 0.5 M NaOH לכל באר ואחסנו את הצלחת מוגנת בפרפילם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

9. ספירת ה-L-[3H]-גלוטמט הרדיואקטיבי

  1. למחרת, סמנו כמה צינורות כמו פרוסות בניסוי ואספו את תכולת הבאר לכל צינור. ודא שהפרוסות מסיסות לחלוטין בתמיסת הליזיס. במידת הצורך, הומוגניזציה של הדגימה באמצעות מחט בגודל 26 המחוברת למזרק של 1 מ"ל.
  2. הוסף 1.2 מ"ל של נוזל נצנוץ לנפח סופי של כ-1.5 מ"ל והומוגניזציה של כל הדגימות במערבולת לפני קריאתן במונה נצנוץ למשך 60 שניות כל אחת.
    הערה: ודא שפרמטרי הזיהוי מוגדרים לטריטיום והתוצאה תימסר ב-DPM.

10. חישובים

  1. המר את התוצאות שניתנו על ידי מונה הנצנוץ לרדיואקטיביות הנפלטת על ידי המגיב הכלוא בתוך הפרוסה ומייצגת את כמות הגלוטמט שנקלט. נכה את הערך המתקבל עבור הספיגה הלא ספציפית מהתוצאה המתקבלת עם HBSS הרגיל. μCi אחד שווה ערך ל-2.22×106 DPM.
  2. על ידי ידיעת כמות ה-μCi והריכוז המקורי של [3H]L-Glutamate (מידע המסופק בדרך כלל בבקבוק או בגיליון הנתונים של המגיב), חשב את ה-L-[3H]-Glutamate שנלכד על ידי כל פרוסה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ספיגת גלוטמט היא אחד המנגנונים החשובים ביותר השולטים בהולכה עצבית במוח. ההיפוקמפוס, באופן ספציפי, הוא מקום קריטי באיתות גלוטמט, בהיותו מרכז חשוב המחבר בין זיכרון, קוגניציה ורגשות במוח. בעקבות הפרוטוקול, נעשה שימוש בחולדות וויסטאר זכרים בוגרים כדי לייצר תוצאות מייצגות. ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המוצג מציג הערכת ספיגת גלוטמט קלה לביצוע באמצעות פרוסות היפוקמפוס. התוצאות מראות ש-AHS תופס באופן קבוע כ-60 fmol של L-[3H]-Glutamate, שעובי הפרוסה (כמות החלבון) לא השפיע על ספיגת L-[3H]-Glutamate (הנתונים לא מוצגים), ושהחלקים הגביים, הביניים והגחונים של ההיפוקמפוס הראו ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מקבלים תמיכה כספית מהמכון הלאומי הברזילאי למדע וטכנולוגיה באקסיטוטוקסיות והגנה עצבית [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0], ו-[152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#11 scalpel bladeSwann-Morton525
100 mm glass petri dishCommon suppliers
110 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001110
42.5 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001042
24-well cell culture plateFalcon353047
BeckerCommon suppliers
Blades for the tissue chopperWilkinson3241
Bone rongeurErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-Aspartic acidPerkinElmerNET581001MC11.3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-GlucoseSigma AldrichG8270
N-Methyl-D- GlucamineSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Iris scissorsErwin Guth8,00,040
IsofluraneCristalia (São Paulo, Brazil)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-Glutamic AcidPerkinElmerNET490005MC49.7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Plastic Pasteur pipetteCommon suppliers
Scintillation liquidPerkinElmer1200.437 for 1 x 5 LiterOptiphase HiSafe 3
Small surgical scissorsErwin Guth8,00,040
Small tweezersErwin Guth6,00,131
Spare chopping discs for the chopperCommon suppliers
Standard scissorsErwin Guth8,00,010
Thin brushes (size 0 or 2)Common suppliers
Thin double-ended spatulaErwin Guth470.260E
Tissue ChopperTed Pella, Inc.10180

References

  1. Knierim, J. J. The hippocampus. Current Biology. 25 (23), 1116-1121 (2015).
  2. Stella, F., Cerasti, E., Si, B., Jezek, K., Treves, A. Self-organization of multiple spatial and context memories in the hippocampus. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (7), 1609-1625 (2012).
  3. Toyoda, H., et al. Interplay of amygdala and cingulate plasticity in emotional fear. Neural Plasticity. 2011, 813749(2011).
  4. Koehl, M., Abrous, D. N. A new chapter in the field of memory: adult hippocampal neurogenesis. European Journal of Neuroscience. 33 (6), 1101-1114 (2011).
  5. Bannerman, D. M., et al. Regional dissociations within the hippocampus--memory and anxiety. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 28 (3), 273-283 (2004).
  6. Moser, E., Moser, M. B., Andersen, P. Spatial learning impairment parallels the magnitude of dorsal hippocampal lesions, but is hardly present following ventral lesions. Journal of Neuroscience. 13 (9), 3916-3925 (1993).
  7. Spiers, H. J., Bendor, D. Enhance, delete, incept: manipulating hippocampus-dependent memories. Brain Research Bulletin. 105, 2-7 (2014).
  8. Gubert, P., et al. Low concentrations of methamidophos do not alter AChE activity but modulate neurotransmitters uptake in hippocampus and striatum in vitro. Life Sciences. 88 (1-2), 89-95 (2011).
  9. Andersen, J. V., et al. Extensive astrocyte metabolism of gamma-aminobutyric acid (GABA) sustains glutamine synthesis in the mammalian cerebral cortex. Glia. 68 (12), 2601-2612 (2020).
  10. Nonose, Y., et al. Guanosine enhances glutamate uptake and oxidation, preventing oxidative stress in mouse hippocampal slices submitted to high glutamate levels. Brain Research. 1748, 147080(2020).
  11. Rambo, L. M., et al. Creatine increases hippocampal Na(+),K(+)-ATPase activity via NMDA-calcineurin pathway. Brain Research Bulletin. 88 (6), 553-559 (2012).
  12. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  13. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  14. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Progress in Neurobiology. 65 (1), 1(2001).
  15. Featherstone, D. E. Intercellular glutamate signaling in the nervous system and beyond. ACS Chem Neurosci. 1 (1), 4-12 (2010).
  16. Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
  17. Grewer, C., Rauen, T. Electrogenic glutamate transporters in the CNS: molecular mechanism, pre-steady-state kinetics, and their impact on synaptic signaling. Journal of Membrane Biology. 203 (1), 1-20 (2005).
  18. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8 (12), 935-947 (2007).
  19. Vandenberg, R. J., Ryan, R. M. Mechanisms of glutamate transport. Physiological Reviews. 93 (4), 1621-1657 (2013).
  20. Peterson, A. R., Binder, D. K. Post-translational Regulation of GLT-1 in Neurological Diseases and Its Potential as an Effective Therapeutic Target. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 164(2019).
  21. Martinez-Lozada, Z., Guillem, A. M., Robinson, M. B. Transcriptional Regulation of Glutamate Transporters: From Extracellular Signals to Transcription Factors. Advances in Pharmacology. 76, 103-145 (2016).
  22. Carbone, M., Duty, S., Rattray, M. Riluzole elevates GLT-1 activity and levels in striatal astrocytes. Neurochemistry International. 60 (1), 31-38 (2012).
  23. Jimenez, E., et al. Differential regulation of the glutamate transporters GLT-1 and GLAST by GSK3beta. Neurochemistry International. 79, 33-43 (2014).
  24. Wang, C. H., et al. Radiotracer Methodology in the Biological, Environmental and Physical Sciences. , Prentice-hall. (1975).
  25. Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. Journal of Visualized Experiments. (123), e55504(2017).
  26. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309(2014).
  27. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  28. Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Wilde, G. J., Williams, L. R., Iannotti, F. Brain-derived neurotrophic factor, but not neurotrophin-3, prevents ischaemia-induced neuronal cell death in organotypic rat hippocampal slice cultures. Neuroscience Letters. 211 (3), 203-206 (1996).
  29. Paniz, L. G., et al. Neuroprotective effects of guanosine administration on behavioral, brain activity, neurochemical and redox parameters in a rat model of chronic hepatic encephalopathy. Metabolic Brain Disease. 29 (3), 645-654 (2014).
  30. Hansel, G., et al. The potential therapeutic effect of guanosine after cortical focal ischemia in rats. PLoS One. 9 (2), 90693(2014).
  31. Cittolin-Santos, G. F., et al. Neurochemical and Brain Oscillation Abnormalities in an Experimental Model of Acute Liver Failure. Neuroscience. 401, 117-129 (2019).
  32. Westphalen, R. I., Hemmings, H. C. Effects of isoflurane and propofol on glutamate and GABA transporters in isolated cortical nerve terminals. Anesthesiology. 98 (2), 364-372 (2003).
  33. Lee, A. R., Kim, J. H., Cho, E., Kim, M., Park, M. Dorsal and Ventral Hippocampus Differentiate in Functional Pathways and Differentially Associate with Neurological Disease-Related Genes during Postnatal Development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 331(2017).
  34. Thomazi, A. P., et al. Ontogenetic profile of glutamate uptake in brain structures slices from rats: sensitivity to guanosine. Mechanisms of Ageing and Development. 125 (7), 475-481 (2004).
  35. Nonose, Y., et al. Cortical Bilateral Adaptations in Rats Submitted to Focal Cerebral Ischemia: Emphasis on Glial Metabolism. Molecular Neurobiology. 55 (3), 2025-2041 (2018).
  36. Arriza, J. L., et al. Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5559-5569 (1994).
  37. Aggarwal, S., Mortensen, O. V. In Vitro Assays for the Functional Characterization of the Dopamine Transporter (DAT). Current Protocols in Pharmacology. 79, 12(2017).
  38. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  39. Moreira, J. D., et al. Dietary omega-3 fatty acids prevent neonatal seizure-induced early alterations in the hippocampal glutamatergic system and memory deficits in adulthood. Nutritional Neuroscience. , 1-12 (2020).
  40. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  41. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12 (5), 1077-1080 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

L 3HNaEx Vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved