使用放射性标记的 L-[3H]-谷氨酸测量从啮齿动物切除的海马获得的急性横切中谷氨酸摄取

摘要

本文描述了一种使用组织切碎机从小鼠和大鼠获得离体急性海马横切切片的可靠且简单的方法。从切除的海马体获得的切片可以提交进行功能性谷氨酸摄取分析，以研究谷氨酸能系统稳态。

摘要

高亲和力 Na ⁺ 依赖性转运蛋白从细胞外空间去除谷氨酸对于确保大脑的内在连接机制正常工作和维持体内平衡至关重要。海马体是一种独特的大脑结构，管理着高级认知功能，是几项关于神经系统疾病的研究的主题。啮齿动物模型中生理和病理机制的研究可以从急性海马切片 （AHS） 制备中受益。AHS 的优势在于提供有关细胞功能的可靠信息，因为保留了细胞结构和突触回路。尽管 AHS 制剂在神经化学实验室中常用，但有可能在文献中发现一些方法学差异。考虑到独特的切片制备方案可能会改变所分析的海马区域，目前的方案提出了一种从切除的海马体获得横向 AHS 的标准技术。这种易于执行的方案可用于小鼠和大鼠的实验模型，并允许几种离体方法研究神经化学动力学（在背侧、中间和腹侧海马体中）在不同背景（例如，转基因作）或体内作后（例如，药物治疗或合适的啮齿动物模型研究临床疾病）。从啮齿动物大脑中解剖海马体后，获得沿隔颞轴 （300 μm 厚） 的横向切片。这些 AHS 包含海马体的不同部分，并进行了单独的神经化学研究（例如：使用各自底物的神经递质转运蛋白）。由于海马体呈现高密度的兴奋性突触，而谷氨酸是大脑中最重要的神经递质，因此谷氨酸能系统是体内观察到现象的有趣靶标。因此，目前的方案提供了使用 L-[³H]-谷氨酸探索离体 AHS 中谷氨酸摄取的详细步骤。使用该方案研究海马功能可能有助于更好地了解谷氨酸代谢对神经保护或神经毒性机制的影响。

引言

海马体是深埋在每个半球内侧颞叶的大脑结构，是高级认知功能所在的地方，是中枢神经系统 （CNS） 研究最多的实体之一。海马体的功能与陈述性和空间记忆密切相关。这种结构还在情绪行为和下丘脑功能的调节中发挥作用 1,2,3,4。自从被证实以来，记忆形成和存储的重要机制发生在该区域，该领域开始深入研究海马区域。因此，类似于与海马功能相关的人类脑部疾病（如阿尔茨海默病、癫痫、重度抑郁症和压力）的动物模型的使用继续增长。

在啮齿动物中，海马体是一个弯曲的形状结构，从内侧隔附近开始向腹侧颞叶皮层延伸。沿其纵轴，海马体可分为三个不同的区域，每个区域都与特定回路¹ 有关。上部构成背侧/鼻中隔海马体，下部构成腹侧/颞侧海马体，它们之间的区域被认为是中间海马体。有大量的文献涵盖了每个部分的细胞投射差异，以及每个部分处理的特定认知方面的报告 ^5,6。关于其内部组织，海马区域可以按其功能区域分开。山茱萸 （CA） 区域细分为 CA1、CA2 和 CA3，并延伸到海马体的上部，在齿状回 （DG） 和泪下部分上方，这是海马最内部的部分（图 1）。位于这些区域的突触经历连续重排，在整个生命过程中表现出神经源性和可塑性过程³。几项研究表明，海马体中不同的实验作会导致认知障碍⁷。关于生化和分子改变的评估，使用急性脑切片的技术是提高对海马体不同方面知识的极好工具。

由于其精确性和可重复性，许多探索神经传递相关现象（酶活性、摄取或释放）方面的研究都使用了通过组织切碎机获得的切除海马体的横向 AHS 8,9,10,11,12。这种切片技术后进行摄取评估适用于需要保留海马组织的转运蛋白活性的复杂神经化学实验。为此，最好使用组织切碎机，因为它比振动切片机更快，并且可以在适当的时间内以适当的精度提供 AHS 以供实验使用。

大脑中的兴奋性神经传递由谷氨酸完成，谷氨酸是最丰富的神经递质，包括在海马体中，它在更大程度上依赖于谷氨酸信号传导^13,14。这种神经递质丰度在细胞外环境中受到严格控制。然而，在细胞内囊泡内，它可以达到 100 mM¹⁵。一旦在突触间隙中释放，谷氨酸就不会被代谢，需要去除以避免兴奋性毒性，这通常是对谷氨酸超负荷的反应触发^{的 14,16}。将毒性与正常信号转导区分开来的唯一机制是通过位于主要神经胶质细胞质膜中的蛋白质活性的钠依赖性转运 14,17,18,19。这些转运蛋白 [GLAST （EAAT1） 和 GLT-1 （EAAT2）] 严格调节细胞外谷氨酸水平，并可受多种因素的调节，例如 DNA 转录、mRNA 剪接和降解、蛋白质合成和靶向、氨基酸转运活性和离子通道活性 20,21,22,23。因此，它们的活性可以通过放射性标记底物（如谷氨酸）的运输来测量。

使用放射性标记的底物代表了量化转运蛋白活性的优选方法，因为它们允许追踪动态机制，例如跨细胞膜的运输。除了高灵敏度和特异性外，放射性示踪剂实验的优势还包括与质谱²⁴ 等竞争技术相比简单且费用低。此外，通过仅使用少量示踪剂，底物的生理水平不会改变，从而提供了真实代谢活动场景的更具代表性的图片。

离体实验方法的可用性对于支持确定新分子靶点和药物发现活动的基础研究至关重要。因此，考虑到谷氨酸摄取与谷氨酸能系统稳态的相关性以及谷氨酸能突触在海马体中的高度优势，该方案展示了如何使用来自切除的海马体的横向 AHS 以快速且易于复制的方法评估谷氨酸摄取活性。该测定使用放射性标记的 L-[³H]-谷氨酸，可进行定量比较和结果的清晰可视化，并且可以在广泛的反应条件下进行修改以使用特定或定制的底物²⁵。

急性脑切片具有许多优点，并已用于支持药理学和遗传作下的功能变化 26,27,28。它们的使用受益于以下方面：（i） 神经化学功能守恒和细胞间相互作用;（ii） 进行大量药理学和遗传作以研究神经元和神经胶质细胞功能的潜在途径的可能性;（iii） 精确控制细胞外环境;（iv） 对不同海马区域（如 CA1、CA3 或 DG）的良好实验通路，根据切片方法，这些区域保持在同一切片中。考虑到独特的切片制备方案可能会改变暴露的海马区域，该方案提出了一种从切除的海马体获得横向 AHS 的标准技术。这种简单易行的方案可用于啮齿动物模型，并且可能允许几种离体方法研究不同背景或体内作后的神经化学动力学^29,30（图 2）。

研究方案

所有程序均按照 NIH 实验动物护理和使用指南进行，并经当地伦理委员会批准（项目批准 # 33732/CEUA-UFRGS）。尽一切努力减少不适和实验中使用的动物数量。

1. 准备汉克平衡盐溶液 （HBSS）

1. 在 1 L 烧杯中，加入约 0.5 L 无菌水或双蒸水，并开始在磁力搅拌器上剧烈搅拌。添加以下 HBSS 组分（以 mM 为单位）：137 NaCl、0.63 Na₂HPO₄、4.17 NaHCO₃、5.36 KCl、0.44 KH₂PO₄、0.41 MgSO₄、0.49 MgCl₂、5.55 D-葡萄糖（见 表 1）。
2. 在加入 1.26 mM CaCl₂ 之前，用 NaOH 或 HCl 将 pH 值调节至 7.4 以避免沉淀。在搅拌下非常缓慢地加入盐。用无菌水或双蒸水将其体积升至 1 L。该缓冲液将用于洗涤组织并在实验期间将 AHS 保持在活力状态。它将提供无机离子，同时保持生理 pH 值和渗透压。
   注：在 pH 滴定后添加二价阳离子以避免沉淀。
3. 分离 HBSS 的两种不同部分：一种将保存在 37 °C 的水浴中并在摄取范式中使用，而另一种将保持冰冷 （4 °C） 并用于实验前后的洗涤。
   注意：可以制备每种盐的储备溶液并将其冷冻至使用，将其储存在冰箱 （-20 °C） 中并在几周内使用。

2. 制备无钠 HBSS

1. 在混合无钠 HBSS 的组分之前，请提前准备另外两种溶液：Glucamine-HCl （137 mM） 和 Glucamine-HEPES （4.17 mM）。混合等摩尔浓度的 NMDG 碱和 HCl，得到葡萄糖胺-HCl 溶液。用 2.0 M HEPES 游离酸执行相同的程序以获得 NMDG-HEPES 溶液（见 表 2）。
2. 在 0.5 L 烧杯中，加入约 0.2 L 无菌水或双蒸水，并开始在磁力搅拌器中剧烈搅拌。添加以下缓冲液组分（以 mM 为单位）：137 葡萄糖胺-HCl、4.17 葡萄糖胺-HEPES、5.36 KCl、0.44 KH₂PO₄、1.26 MgSO₄、0.41 MgCl₂ 和 5.55 D-葡萄糖（见 表 2）。
3. 用 KOH 或 HCl 将 pH 值调节至 7.4，并继续搅拌。在搅拌下非常缓慢地加入 1.26 mM CaCl₂ 。用无菌水或双蒸水使溶液体积达到 0.3 L。
   注意：该缓冲液将用于测量非钠依赖性谷氨酸摄取，这将允许测量被动/非特异性谷氨酸摄取。实验后，从总谷氨酸摄取中减去该参数以确定钠依赖性摄取。
4. 制备后，该缓冲液可以储存在冰箱 （-20 °C） 中，并在随后的实验中使用。NMDG 解决方案也是如此。
5. 在实验过程中，请始终保持无钠 HBSS 冰冷。

3. 组织大鼠海马解剖的材料

1. 在开始实验之前，组织水槽旁边的解剖区域。将大鼠专用的断头台（对于小鼠，可以使用锋利的剪刀）放入水槽中，以保持工作台清洁。
2. 按使用顺序排列用于脑切除和海马夹层的手术器械和其他材料，并尽可能靠近需要的地方（见 材料表）。将培养皿放入冰桶中。此外，在附近放一个塑料袋以处理尸体。
3. 以推荐浓度制备两种 HBSS 溶液以供使用。无钠 HBSS 可以在实验前冷冻和解冻。
   1. 按照先前的建议，将含钠的 HBSS 分成两个不同的部分：一个在 37 °C 下加热，另一个在 4 °C 下加热，用于解剖。解冻无钠 HBSS 并保持在 4 °C。
4. 要诱导麻醉，请使用 3% 异氟醚³¹。在开始实验之前，请务必验证后爪是否存在角膜反射和伤害性刺激。
   注意：小心选择合适的麻醉药物，因为它不应干扰将要调查的任何参数。对于该方案，建议使用吸入麻醉剂（例如异氟醚）³²。

4. 对大鼠实施安乐死

1. 使用机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 以及美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南（NIH 出版物第 8023 号，1978 年修订）批准的方法对啮齿动物实施安乐死。
2. 使用断头台，在第一颈椎之前立即将大鼠斩首。
3. 将头部放在蘸有冷盐水溶液的干净纸巾上。用 S 号手术剪刀完全去除头皮，以及皮肤肌肉，旨在完全暴露颅骨上表面的缝合线。小心地开始此程序，从枕骨附近开始，向后延伸到鼻骨。
   注意：如果实验模型是小鼠，请使用锋利的剪刀去除头部。确保在颅骨后面切开，以排除多余的组织。

5. 去除大鼠大脑

1. 尽快进行脑部切除。用合适的骨钳，在连接大鼠颅骨两个孔口的两个眼孔之间做一个切口。之后，将 S 号手术剪刀的尖端放入枕骨大孔中，并在颅骨上横向切开一个。对另一侧重复上述步骤。
2. 从枕骨板切下颅骨板，然后沿着顶板的中线缝合，最后到朝向鼻子的额板。确保牢牢握住啮齿动物的头部，并将压力从大脑引开，以防止损坏下面的组织。
   注意：将压力从大脑引开以防止损坏下面的组织，这一点至关重要。在年轻的大鼠和小鼠中，可以用小手术剪刀剪断头骨。
3. 使用刮刀或镊子轻轻地从两个半球去除枕骨板和顶板。仔细检查是否有任何可能附着在颅骨上并伸展到大脑表面的硬脑膜。
4. 立即用薄的双头刮刀取出大脑，然后轻轻地将整个大脑放在覆盖有滤纸的冰冷培养皿上。用塑料巴斯德移液管，用冰冷的盐水溶液润湿。立即开始解剖两个大脑半球的海马体，如下所述。
5. 用 #11 手术刀刀片小心地从整个大脑中切除小脑。为了完全分离大脑半球，手术刀刀片贯穿整个半球内裂。使用塑料巴斯德移液器，经常用冰冷的 HBSS 缓冲液润湿，以保持组织湿润和保存。
6. 分别取每个半球，用鸢尾剪刀从上覆的皮层切开脑干和中脑。小心地，用手术剪刀剪断脑干/中脑/丘脑，同时用细刷子向下推并拉动这些大脑结构。在下面可以观察到海马体（内侧表面）和侧脑室。带有海马体的皮层现在应该从脑干中解放出来。

6. 大鼠海马解剖

1. 要切除海马体，将一个大脑半球放在冠状平面上，顶叶皮层朝下。此时，可以观察到在海马体底部形成浅双曲线的白色菌毛纤维。
2. 非常小心地，用非惯用手用细镊子固定脑组织。用你的惯用手，将其他镊子放在海马体的尾尖下。
3. 固定内侧白质束，将镊子完全放在海马体下方，轻轻地将其与大脑的其他部分分开。施加压力，同时稍微向前和横向移动第二个尖端。如果作得当，海马体应该落在滤纸上。
4. 要完成海马体解剖，请用相同的镊子去除备用组织（通常是任何剩余的皮层、血管和白质）。对第二个半球重复相同的方法。
5. 取出两个海马体后，将其转移到培养皿中，将 HBSS 放置在冰桶上，然后转移到组织切碎机中刀片上方的切割台区域。如果调查需要分别分析背侧和腹侧区域，请务必正确识别它们。
   注意：在解剖过程中始终区分海马体的腹侧和背侧部分很重要。这样，前端将朝上³³.海马体的这一部分比后端略薄。

7. 切片准备

注意：在工作台上布置手术材料（第 2 节）时，准备组织切碎机以从切除的海马体获得横向切片。

1. 使用前在 Tissue Chopper 中设置参数。切碎机可以切割 100 至 400 μm 的切片;将其设置为 300 μM。此外，建议每分钟 60-80 次冲程，因为它可以在切片过程中保持组织的完整性。
2. 在第 2 节中执行完所有程序后，一旦从大脑中切除海马体并放在用冷盐水溶液加湿的滤纸上，在光滑的聚丙烯支架上，在将它们提交给切碎程序之前，将每个海马体对准滤纸。
3. 将海马体一次放在组织切碎机的圆形不锈钢切割台上，垂直于切割刀片，以获得沿隔颞轴的横向海马切片。在开始切碎过程之前，使用异丙醇对刀片进行轻微加湿。此过程可防止组织粘在刀片上，从而实现更平滑和精确的切片。
4. 启动设备后，切碎臂中的刀片将升高和放下，以选定的厚度切片组织。这是一个快速的过程，通常组织会在一分钟后被正确切片。如果将它们正确地放在切割台上，则可以同时切碎多个海马体。
5. 要分离切片，请使用双头刮刀小心地从组织切碎机中取出每个切片样品，然后将其浸入装有冰冷盐水溶液的培养皿中。使用两把细刷子，轻轻捏住海马体并分开切片。在此过程中，请小心保持 slice 完整性。
   1. 一式三份进行此实验，因此从每个样品中选择 6 个切片：3 个切片用于总谷氨酸摄取，3 个切片用于非特异性摄取。
6. 用刷子轻轻地将每片从培养皿转移到含有以下成分的 24 孔板中：（i） 1 mL HBSS;（ii） 1 mL 无钠 HBSS。与相应的实验组一起确定孔/板，并至少一式三份进行分析。
   注意：由于时间限制问题，如果实验一式三份进行，它会将动物/组的数量限制为一次只有 6 只（每只动物在 5 分钟内采集一个海马体）。这意味着 L-[³H]-谷氨酸将每 15 秒给药一次，直到所有切片都被孵育。为了终止反应，应遵守相同的间隔，以确保所有样品都暴露于 5 分钟的孵育期。

8. 谷氨酸摄取测定

1. 在相应的缓冲液（HBSS 或无钠 HBSS）中稳定切片期间，通过在无菌水中稀释 L-[³H]-谷氨酸至终浓度为 4.5 μCi/mL，最终体积允许每切片 20 μL 加上一些过量，这将防止批次结束时缺乏放射性输入， 因为需要量化开始时为每个切片提供每分钟多少次崩解 （DPM）。
   注：对于每个 24 孔板，建议制备 500 μL 4.5 μCi/mL L-[³H]-谷氨酸，因为 L-[³H]-谷氨酸摄取所需的总孵育时间（5 分钟）和每 20 μL 等分试样的移液时间（每个孔中 0.33 μCi），如下所述。L-[³H]-谷氨酸的储备浓度通常为 1.0 mCi/mL，因此制备 1：200 稀释液以应用于切片。
2. 在 HBSS 中预孵育 15 分钟后，用巴斯德移液管完全去除缓冲液，并在切片中加入 280 μL 以下成分之一替换它：（i） 常规 HBSS （37 °C） 用于总摄取;或 （ii） 无钠 HBSS （4 °C） 用于非特异性摄取。需要注意的是，必须在 37 °C 的加热板上进行总摄取，而非特异性摄取是在冰上进行的。
3. 准备一个计时器，并在第一个包含切片的孔中加入 20 μL 起始量时设置实验开始时间。等待 15 - 20 秒（取决于板中的切片数量）并将放射性输入添加到下一个孔中，依此类推，直到含有切片的孔结束。在所有孔中分配 20 μL 的输入，始终考虑总孵育时间（5 分钟）。
4. 填充板中含有切片的每个孔后，等待第一个切片完成与 L-[³H]-谷氨酸的 5 分钟孵育。然后，立即将孵育培养基取出到适当的放射性废液瓶中。
5. 去除后，立即快速加入 300 μL 冰冷的 HBSS 并轻轻去除。在每个孔中再重复此过程两次，每个切片完成 3 次洗涤。确保使用无钠 HBSS 清洗专用于非特异性摄取测量的切片。洗涤板中的所有切片后，向每个孔中加入 300 μL 0.5 M NaOH，并将用封口膜保护的板在 4 °C 下储存过夜。

9. 计算放射性 L-[³H]-谷氨酸

1. 第二天，在实验中标记尽可能多的试管作为切片，并将孔的内容物收集到每个试管中。确保切片完全溶解在裂解液中。如有必要，使用与 1 mL 注射器耦合的 26 号针头对样品进行均质化。
2. 加入 1.2 mL 闪烁液至最终体积约为 1.5 mL，并在涡旋中匀浆所有样品，然后在闪烁计数器中读取它们每个 60 秒。
   注意：确保将检测参数设置为氚，结果将以 DPM 格式提供。

10. 计算

1. 将闪烁计数器给出的结果转换为切片内捕获的试剂发射的放射性，并表示吸收的谷氨酸量。从常规 HBSS 获得的结果中减去非特异性摄取获得的值。1 μCi 相当于 2.22×10⁶ DPM。
2. 通过知道 μCi 的量和 [³H] L-谷氨酸的原始浓度（通常在试剂瓶或数据表中提供的信息），计算每个切片捕获的 L-[³H]-谷氨酸。

结果

谷氨酸摄取是控制大脑神经传递的最重要机制之一。具体来说，海马体是谷氨酸信号传导的关键位置，是连接大脑中记忆、认知和情绪的重要枢纽。按照方案，使用成年雄性 Wistar 大鼠产生代表性结果。使用 3% 异氟醚麻醉动物直至失去知觉。解剖大脑后，取出海马体并垂直于刀片放置在切碎台上。以每分钟 60 张的速率获得 300 μm 厚的切片，并收集到含有冰冷盐水溶液的?...

讨论

提出的方案显示了使用海马切片进行的易于执行的谷氨酸摄取评估。结果表明，AHS 经常吸收约 60 fmol 的放射性标记的 L-[³H]-谷氨酸，切片的厚度（蛋白质量）不会影响 L-[³H]-谷氨酸的摄取（数据未显示），并且海马体的背侧、中间和腹侧部分在从幼稚的成年雄性 Wistar 大鼠获得时表现出相似的表现（图 3A）。在时程实验中还证明，在 ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 scalpel blade	Swann-Morton	525
100 mm glass petri dish	Common suppliers
110 mm diameter Whatman Filter	Sigma Aldrich	WHA1001110
42.5 mm diameter Whatman Filter	Sigma Aldrich	WHA1001042
24-well cell culture plate	Falcon	353047
Becker	Common suppliers
Blades for the tissue chopper	Wilkinson	3241
Bone rongeur	Erwin Guth	9,00,005
CaCl2	Sigma Aldrich	C4901
D-[2,3-3H]-Aspartic acid	PerkinElmer	NET581001MC	11.3 Ci/mmol (37 MBq)
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
N-Methyl-D- Glucamine	Sigma Aldrich	M2004
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Hidex 300 SL	Hidex Oy.	Super Low Level #425-020
Iris scissors	Erwin Guth	8,00,040
Isoflurane	Cristalia (São Paulo, Brazil)	4,10,525	1 mL/mL
KCl	Sigma Aldrich	P3911
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662
L-[3,4-3H]-Glutamic Acid	PerkinElmer	NET490005MC	49.7 Ci/mmol (185 MBq)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Plastic Pasteur pipette	Common suppliers
Scintillation liquid	PerkinElmer	1200.437 for 1 x 5 Liter	Optiphase HiSafe 3
Small surgical scissors	Erwin Guth	8,00,040
Small tweezers	Erwin Guth	6,00,131
Spare chopping discs for the chopper	Common suppliers
Standard scissors	Erwin Guth	8,00,010
Thin brushes (size 0 or 2)	Common suppliers
Thin double-ended spatula	Erwin Guth	470.260E
Tissue Chopper	Ted Pella, Inc.	10180