JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, bir doku kıyıcı kullanarak farelerden ve sıçanlardan ex vivo akut hipokampal enine dilimler elde etmenin güvenilir ve basit bir yolunu açıklamaktadır. Rezeke edilen hipokampuslardan elde edilen dilimler, glutamaterjik sistem homeostazını araştırmak için fonksiyonel glutamat alım analizine gönderilebilir.

Özet

Beynin içsel bağlantı mekanizmalarının düzgün çalışmasını ve homeostazın sürdürülmesini sağlamak için yüksek afiniteli Na+'ya bağımlı taşıyıcılar tarafından hücre dışı boşluktan glutamat uzaklaştırılması esastır. Hipokampus, daha yüksek bilişsel fonksiyonları yöneten benzersiz bir beyin yapısıdır ve nörolojik hastalıklarla ilgili çeşitli çalışmalara konu olmuştur. Kemirgen modellerinde fizyolojik ve patolojik mekanizmaların araştırılması akut hipokampal dilim (AHS) preparatlarından fayda sağlayabilir. AHS, sitomimari ve sinaptik devreler korunduğu için hücre fonksiyonu hakkında güvenilir bilgi sağlama avantajına sahiptir. AHS preparatları nörokimya laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılsa da literatürde bazı metodolojik farklılıklar bulmak mümkündür. Ayırıcı dilim hazırlama protokollerinin analiz edilen hipokampal bölgeleri değiştirebileceği göz önüne alındığında, bu mevcut protokol rezeke hipokampustan transvers AHS elde etmek için standart bir teknik önermektedir. Bu basit uygulanabilir protokol, farelerin ve sıçanların deneysel modellerinde kullanılabilir ve farklı arka planlarda (örneğin, transgenik manipülasyonlar) veya in vivo manipülasyonlardan sonra (örneğin, farmakolojik tedaviler veya klinik bozuklukları incelemek için uygun kemirgen modelleri) nörokimyasal dinamikleri (dorsal, orta ve ventral hipokampusta) araştıran birkaç ex vivo yaklaşıma izin verebilir. Hipokampusu kemirgen beyninden diseke ettikten sonra, septo-temporal eksen boyunca (300 μm kalınlığında) enine dilimler elde edildi. Bu AHS, hipokampusun farklı kısımlarını içerir ve bireysel bir nörokimyasal araştırmaya tabi tutulmuştur (örnek olarak: ilgili substratlarını kullanan nörotransmitter taşıyıcıları). Hipokampus yüksek yoğunluklu uyarıcı sinapslar sunduğundan ve glutamat beyindeki en önemli nörotransmitter olduğundan, glutamaterjik sistem in vivo gözlenen fenomenler için ilginç bir hedeftir. Bu nedenle, mevcut protokol, L-[3H]-Glutamat kullanarak ex vivo AHS'de glutamat alımını keşfetmek için ayrıntılı adımlar sağlar. Hipokampal fonksiyonu araştırmak için bu protokolün kullanılması, glutamat metabolizmasının nöroproteksiyon veya nörotoksisite mekanizmaları üzerindeki etkisini daha iyi anlamaya yardımcı olabilir.

Giriş

Yüksek bilişsel işlevlerin bulunduğu her yarım kürenin medial temporal lobunun derinliklerine gömülü bir beyin yapısı olan hipokampus, merkezi sinir sisteminin (CNS) en çok çalışılan varlıklarından biridir. Hipokampusun işlevi, bildirimsel ve uzamsal hafıza ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bu yapı aynı zamanda duygusal davranışta ve hipotalamik fonksiyonların düzenlenmesinde de rol oynar 1,2,3,4. Doğrulandıktan sonra, bu bölgede önemli hafıza oluşumu ve depolama mekanizmaları gerçekleşir ve alan hipokampal bölgeyi derinlemesine araştırmaya başlar. Buna göre, Alzheimer hastalığı, epilepsi, majör depresyon ve stres gibi hipokampal işlevlerle ilgili insan serebral bozukluklarına benzeyen hayvan modellerinin kullanımı artmaya devam ediyor.

Kemirgenlerde hipokampus, medial septumun yakınından başlayarak ventral temporal kortekse doğru eğri şekilli bir yapıdır. Uzunlamasına ekseni boyunca, hipokampus, her biri belirli devre1 ile ilgili üç farklı bölgeye ayrılabilir. Üst kısım dorsal/septal hipokampusu, alt kısım ventral/temporal hipokampusu oluşturur ve aralarındaki alan orta hipokampus olarak kabul edilir. Her bir parçaya hücresel projeksiyonlardaki farklılıkların yanı sıra her biri tarafından işlenen belirli bilişsel yönlerin raporlarını kapsayan kapsamlı bir literatür bulunmaktadır 5,6. İç organizasyonu ile ilgili olarak, hipokampal bölgeler fonksiyonel alanlarına göre ayrılabilir. Cornu ammonis (CA) alanı CA1, CA2 ve CA3 olarak alt bölümlere ayrılır ve hipokampusun üst kısmı boyunca, en iç hipokampal kısımlar olan dentat girus (DG) ve subiculumun üzerine uzanır (Şekil 1). Bu bölgelerde bulunan sinapslar, yaşam boyunca nörojenik ve plastik süreçler göstererek sürekli yeniden düzenlenir3. Birkaç çalışma, hipokampustaki farklı deneysel manipülasyonların bilişsel engellilik ile sonuçlandığını göstermiştir7. Biyokimyasal ve moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi ile ilgili olarak, akut beyin dilimlerini kullanan teknikler, hipokampusun farklı yönleri hakkındaki bilgileri geliştirmek için mükemmel bir araçtır.

Kesinliği ve tekrarlanabilirliği nedeniyle, nörotransmisyonla ilgili olayların (enzim aktivitesi, alım veya salım) yönlerini araştıran birçok çalışma, doku kıyıcı 8,9,10,11,12 ile elde edilen rezeke hipokampustan enine AHS kullanmıştır. Bu dilimleme tekniği ve ardından alım değerlendirmesi, hipokampal dokudan taşıyıcı aktivitenin korunmasını gerektiren karmaşık nörokimyasal deneyler için uygundur. Bunun için, vibratomdan daha hızlı olduğu ve AHS'yi deneysel kullanım için uygun bir zamanda uygun doğrulukla sağladığı için bir doku kıyıcının kullanılması tercih edilir.

Beyindeki uyarıcı nörotransmisyon, hipokampus da dahil olmak üzere en bol bulunan nörotransmitter olan glutamat tarafından gerçekleştirilir ve bu da büyük ölçüde glutamat sinyaline bağlıdır13,14. Bu nörotransmitter bolluğu, hücre dışı ortamda sıkı bir şekilde kontrol edilir. Bununla birlikte, hücre içi veziküllerin içinde 100 mM'ye kadar ulaşabilir15. Sinaptik yarıkta salındıktan sonra, glutamat metabolize edilmez ve genellikle glutamat14,16'nın aşırı yüklenmesine bir yanıt olarak tetiklenen eksitotoksisiteyi önlemek için çıkarılması gerekir. Toksisiteyi normal sinyallemeden ayıran tek mekanizma, büyük ölçüde glial hücrelerin 14,17,18,19 plazma zarlarında bulunan proteinlerin aktivitesi yoluyla sodyuma bağımlı taşımadır. Bu taşıyıcılar [GLAST (EAAT1) ve GLT-1(EAAT2)] hücre dışı glutamat seviyelerini sıkı bir şekilde düzenler ve DNA transkripsiyonu, mRNA ekleme ve bozunması, protein sentezi ve hedefleme, amino asit taşıma aktivitesi ve iyon kanalı aktiviteleri gibi çok çeşitli faktörler tarafından modüle edilebilir 20,21,22,23. Buna göre, aktiviteleri, glutamat olarak radyoaktif işaretli substratın taşınması ile ölçülebilir.

Radyoaktif işaretli substratların kullanımı, hücre zarları boyunca taşıma gibi dinamik mekanizmaların izlenmesine izin verdiklerinden, taşıyıcı aktivitenin ölçülmesi için tercih edilen bir yöntemi temsil eder. Yüksek hassasiyet ve özgüllüklerinin yanı sıra, radyoizleyici deneylerinin avantajları arasında, kütle spektrometresi24 gibi rakip teknolojilere kıyasla basitlikleri ve küçük maliyetleri yer alır. Ayrıca, sadece küçük miktarlarda izleyici kullanılarak, substratların fizyolojik seviyeleri değiştirilmez, böylece gerçek metabolik aktivite senaryosunun daha temsili bir resmini sağlar.

Ex vivo deneysel yaklaşımların mevcudiyeti, yeni moleküler hedeflerin tanımlanması ve ilaç keşif faaliyetleri üzerine temel araştırmaları desteklemek için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, glutamaterjik sistem homeostazı için glutamat alımının önemi ve hipokampusta glutamaterjik sinapsların yüksek baskınlığı göz önüne alındığında, bu protokol, rezeke edilen hipokampustan enine AHS kullanılarak hızlı ve çoğaltılması kolay bir yöntemle glutamat alım aktivitesinin nasıl değerlendirileceğini göstermektedir. Bu tahlil, kantitatif karşılaştırmalara ve sonuçların net bir şekilde görselleştirilmesine izin veren ve çok çeşitli reaksiyon koşullarında25 spesifik veya özelleştirilmiş substratlarla kullanım için modifiye edilebilen radyoaktif işaretli L-[3H]-Glutamat kullanır.

Akut beyin dilimleri birçok avantaj sunar ve farmakolojik ve genetik manipülasyonlar altında fonksiyon değişikliğini desteklemek için kullanılmıştır 26,27,28. Kullanımları aşağıdakilerden yararlanır: (i) nörokimyasal işlevselliğin korunması ve hücreden hücreye etkileşimler; (ii) nöronal ve glial fonksiyonların altında yatan yolakları araştırmak için çok sayıda farmakolojik ve genetik manipülasyon gerçekleştirme imkanı; (iii) hücre dışı ortamın hassas kontrolü; ve (iv) dilimleme yöntemine bağlı olarak aynı dilimde tutulan farklı hipokampal alanlara (CA1, CA3 veya DG gibi) iyi deneysel erişim. Farklı dilim hazırlama protokollerinin maruz kalan hipokampal bölgeleri değiştirebileceği göz önüne alındığında, bu protokol rezeke edilmiş hipokampustan transvers AHS elde etmek için standart bir teknik önermektedir. Bu gerçekleştirmesi basit protokol, kemirgen modellerinde kullanılabilir ve farklı arka planlarda veya in vivo manipülasyonlardan sonra nörokimyasal dinamikleri araştıran birkaç ex vivo yaklaşıma izin verebilir29,30 (Şekil 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm prosedürler NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi ve yerel Etik Kurul tarafından onaylandı (proje onayı # 33732/CEUA-UFRGS). Rahatsızlığı ve deneylerde kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.

1. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinin Hazırlanması (HBSS)

  1. 1 L'lik bir behere yaklaşık 0,5 L steril veya çift damıtılmış su ekleyin ve manyetik bir karıştırıcı üzerinde kuvvetlice karıştırmaya başlayın. Aşağıdaki HBSS bileşenlerini ekleyin (mM cinsinden): 137 NaCl, 0.63 Na2HPO4, 4.17 NaHCO3, 5.36 KCl, 0.44 KH2PO4, 0.41 MgSO4, 0.49 MgCl2, 5.55 D-Glikoz (bakınız Tablo 1).
  2. Çökelmeyi önlemek için 1,26 mM CaCl2 eklemeden önce pH'ı NaOH veya HCl ile 7,4'eayarlayın . Bu tuzu çok yavaş ve çalkalayarak ekleyin. Steril veya çift damıtılmış su ile 1 L hacme getirin. Bu tampon, dokuyu yıkamak ve deney sırasında AHS'yi canlı bir durumda tutmak için kullanılacaktır. Fizyolojik bir pH ve ozmotik basıncı korurken inorganik iyonlar sağlayacaktır.
    NOT: İki değerlikli katyonların eklenmesi, çökelmeyi önlemek için pH'ın titrasyonundan sonra yapılır.
  3. HBSS'nin iki farklı fraksiyonunu ayırın: biri 37 ° C'de bir su banyosunda tutulacak ve alım paradigması sırasında kullanılacak, diğeri buz gibi soğuk tutulacak (4 ° C) ve deneyden önce ve sonra yıkamalar için kullanılacaktır.
    NOT: Her tuzun stok çözeltilerini hazırlamak ve kullanılana kadar donmuş halde tutmak, dondurucuda (-20 °C) saklamak ve birkaç hafta içinde kullanmak mümkündür.

2. Sodyum İçermeyen HBSS'nin Hazırlanması

  1. Sodyum içermeyen HBSS için bileşenleri karıştırmadan önce, önceden iki başka çözelti hazırlayın: Glucamine-HCl (137 mM) ve Glucamine-HEPES (4.17 mM). Glucamine-HCl çözeltisini elde etmek için NMDG bazı ve HCl'nin eşmolar konsantrasyonlarını karıştırın. NMDG-HEPES çözeltisini elde etmek için aynı işlemi 2.0 M HEPES serbest asit ile yapın (bkz. Tablo 2).
  2. 0,5 L'lik bir behere yaklaşık 0,2 L steril veya çift damıtılmış su ekleyin ve manyetik bir karıştırıcıda kuvvetlice karıştırmaya başlayın. Aşağıdaki tampon bileşenlerini ekleyin (mM cinsinden): 137 Glucamine-HCl, 4.17 Glucamine-HEPES, 5.36 KCl, 0.44 KH2PO4, 1.26 MgSO4, 0.41 MgCl2 ve 5.55 D-Glukoz (bkz. Tablo 2).
  3. KOH veya HCl ile pH'ı 7.4'e ayarlayın ve karıştırmaya devam edin. 1.26 mM CaCl2'yi çok yavaş ve çalkalama altında ekleyin. Çözeltiyi steril veya çift damıtılmış su ile 0,3 L hacme getirin.
    NOT: Bu tampon, sodyuma bağımlı olmayan glutamat alımını ölçmek için kullanılacaktır, bu da pasif/spesifik olmayan glutamat alımının ölçülmesine izin verecektir. Deneyden sonra, sodyuma bağlı alımı belirlemek için bu parametre toplam glutamat alımından çıkarılır.
  4. Hazırlandıktan sonra, bu tampon dondurucuda (-20 °C) stoklanabilir ve daha sonra sonraki deneylerde kullanılabilir. Aynı şey NMDG çözümleri için de geçerli.
  5. Deney sırasında her zaman sodyum içermeyen HBSS'yi buz gibi soğuk tutun.

3. Sıçanlardan hipokampus diseksiyonu için materyalin düzenlenmesi

  1. Deneye başlamadan önce lavabonun yanındaki diseksiyon alanını düzenleyin. Tezgahı temiz tutmak için lavaboya sıçanlar için özel bir giyotin yerleştirin (fareler için keskin makas kullanmak mümkün olacaktır).
  2. Beynin çıkarılması ve hipokampal diseksiyon için cerrahi aletleri ve diğer malzemeleri kullanım sırasına göre ve ihtiyaç duyulan yere mümkün olduğunca yakın düzenleyin (bkz . Petri kabını bir buz kovasına yerleştirin. Ayrıca, karkasın atılması için yakınınızda bir plastik torba bulundurun.
  3. Her iki HBSS çözeltisini de kullanım için önerilen konsantrasyonda hazırlayın. Sodyum içermeyen HBSS, deneyden önce dondurulabilir ve çözülebilir.
    1. Sodyum içeren HBSS'yi daha önce önerildiği gibi iki ayrı parçaya ayırın: biri 37 ° C'de ve diğeri diseksiyon için kullanılacak olan 4 ° C'de ısıtılır. Sodyum içermeyen HBSS'yi çözün ve 4 ° C'de tutun.
  4. Anesteziyi indüklemek için% 3 izofluran31 kullanın. Deneye başlamadan önce, kornea refleksinin olmadığını ve arka pençenin nosiseptif stimülasyonunu doğruladığınızdan emin olun.
    NOT: Uygun anestezik ilacı seçmeye dikkat edin, çünkü araştırılacak herhangi bir parametreye müdahale etmemelidir. Bu protokol için inhalan anestezik (örn., izofluran)32.

4. Fareye ötenazi yapmak

  1. Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi (NIH Yayınları No. 8023, 1978'de revize edilmiştir) tarafından onaylanmış yöntemleri kullanarak kemirgeni ötenazi yapın.
  2. Bir giyotin kullanarak, ilk servikal omurdan hemen önce farenin başını kesin.
  3. Başınızı soğuk tuzlu su çözeltisiyle nemlendirilmiş temiz bir kağıt havluya yerleştirin. Cerrahi makas boyutu S ile kafa derisini ve kafatasının üst yüzeyindeki dikişleri tamamen açığa çıkarmayı amaçlayan kutanöz kası tamamen çıkarın. Bu prosedürü, oksipital kemiğin yakınından başlayarak ve burun kemiğine arkaya doğru ilerleyerek dikkatli bir şekilde başlatın.
    NOT: Deneysel modelin fare olması durumunda, kafayı çıkarmak için keskin bir makas kullanın. Fazla dokuyu dışlamak için kafatasının hemen arkasını kestiğinizden emin olun.

5. Sıçan beyninin çıkarılması

  1. Beyin çıkarma işlemini mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin. Uygun bir kemik pense ile, farenin kafatasındaki her iki deliği birleştiren her iki göz deliği arasında tek bir kesim yapın. Daha sonra, cerrahi makas boyutu S'nin bir ucunu foramen magnum'a yerleştirin ve kafatasına yanal olarak tek bir kesi yapın. Diğer taraf için tekrarlayın.
  2. Kafatası plakalarını oksipital plakadan, daha sonra parietal plakaların orta hat sütürü boyunca ve son olarak buruna doğru ön plakaya kesin. Kemirgenin başının sıkıca tutulduğundan ve altındaki dokuya zarar vermemek için basıncın beyinden uzağa yönlendirildiğinden emin olun.
    NOT: Altındaki dokuya zarar vermemek için basıncın beyinden uzağa yönlendirilmesi kritik derecede önemlidir. Genç sıçanlarda ve farelerde, kafatasını küçük cerrahi makasla kesmek mümkündür.
  3. Bir spatula veya forseps kullanarak oksipital ve parietal plakaları her iki yarım küreden nazikçe çıkarın. Kafatası kemiklerine yapışabilecek ve beynin yüzeyi boyunca gerilmiş olabilecek herhangi bir dura maddesi olup olmadığını dikkatlice inceleyin.
  4. İnce çift uçlu spatula ile beyni hemen çıkarın ve tüm beyni nazikçe filtre kağıdı ile kaplı buz gibi bir Petri kabına yerleştirin. Plastik Pasteur pipeti ile buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin. Hemen aşağıda açıklandığı gibi hipokampusu her iki beyin yarım küresinden çıkarmaya başlayın.
  5. # 11 neşter bıçağı ile beyinciği tüm beyinden dikkatlice inceleyin. Serebral hemisferleri tamamen ayırmak için, intrahemisferik fissür boyunca bir neşter bıçağı çalıştırın. Plastik Pasteur pipeti ile dokuyu ıslak tutmak ve korumak için buz gibi soğuk HBSS tamponu ile sık sık nemlendirin.
  6. Her yarım küreyi ayrı ayrı alın, beyin sapını ve orta beyni üstteki korteksten bir İris makası ile rezeke edin. Dikkatlice, cerrahi makas ile beyin sapı/orta beyin/talamusu kesin, ince bir fırça ile bu beyin yapılarını aşağı doğru itin ve çekin. Aşağıda hipokampus (medial yüzey) ve lateral ventrikülü gözlemlemek mümkün olacaktır. Hipokampuslu korteks artık beyin sapından bağımsız olmalıdır.

6. Sıçanlardan hipokampi diseksiyonu

  1. Hipokampusu rezeke etmek için, parietal korteks aşağı bakacak şekilde koronal düzlemde bir beyin yarım küresi koyun. Şu anda, hipokampusun dibinde sığ bir hiperbol oluşturan beyaz fimbria liflerini gözlemlemek mümkündür.
  2. Çok dikkatli bir şekilde, baskın olmayan el ile beyin dokusunu ince cımbızla sabitleyin. Baskın elinizle, diğer cımbızları hipokampusun kaudal ucunun altına yerleştirin.
  3. Medial beyaz cevher yollarını sabitleyerek, cımbızı beynin geri kalanından nazikçe ayırmak için tamamen hipokampusun altına yerleştirin. İkinci ucu hafifçe öne ve yana doğru hareket ettirirken baskı uygulayın. Düzgün yapılırsa, hipokampus filtre kağıdının üzerine inmelidir.
  4. Hipokampus diseksiyonunu bitirmek için, yedek dokuyu aynı cımbızla (genellikle kalan korteks, kan damarları ve beyaz madde) çıkarın. İkinci yarımküre için aynı metodolojiyi tekrarlayın.
  5. Her iki hipokampus da çıkarıldıktan sonra, buz kovasına yerleştirilmiş HBSS ile bir Petri kabına aktarın ve doku kıyıcıdaki bıçağın üzerindeki kesme masası alanına aktarın. Araştırmanın ayrı ayrı analiz edilmesini gerektirmesi durumunda, dorsal ve ventral alanları doğru bir şekilde tanımladığınızdan emin olun.
    NOT: Diseksiyon sırasında hipokampusun ventral ve dorsal kısımlarını her zaman ayırt etmek önemlidir. Bunu yaparak, ön uç yukarı bakacak olacaktır33. Hipokampusun bu kısmı arka uçtan biraz daha incedir.

7. Dilim hazırlama

NOT: Cerrahi materyali bench üzerinde düzenlerken (2. seans), rezeke edilen hipokampustan enine dilimi elde etmek için doku kıyıcısını hazırlayın.

  1. Kullanmadan önce doku kıyıcıdaki parametreleri ayarlayın. Doğrayıcı, 100 ila 400 μm arasındaki dilimleri kesebilir; 300 μm'ye ayarlayın. Ek olarak, dilimleme işlemi sırasında doku bütünlüğünü koruduğu için dakikada 60-80 vuruş aralığı önerilir.
  2. 2. seansta gerçekleştirilen tüm işlemlerden sonra, hipokampus beyinden rezeke edildikten ve pürüzsüz bir polipropilen desteğin üzerine soğuk tuzlu su çözeltisi ile nemlendirilmiş filtre kağıdına yerleştirildikten sonra, doğrama işlemine göndermeden önce her bir hipokampusu filtre kağıdı üzerinde hizalayın.
  3. Hipokampusu, septo-temporal eksen boyunca enine hipokampus dilimlerini elde etmek için doku kıyıcısından dairesel paslanmaz çelik kesme tablasının üzerine, kesme bıçaklarına dik olarak yerleştirin. Doğrama işlemine başlamadan önce, bıçağı izopropil alkol kullanarak hafifçe nemlendirin. Bu prosedür, dokunun bıçağa yapışmasını önleyerek daha düzgün ve hassas bir dilimleme sağlar.
  4. Ekipmanı açtıktan sonra, doğrama kolundaki bıçak kaldırılıp düşürülecek ve dokuyu seçilen kalınlıkta dilimleyecektir. Bu hızlı bir işlemdir ve normalde doku bir dakika sonra düzgün bir şekilde dilimlenir. Kesme masasında düzgün bir şekilde ayrı tutulurlarsa aynı anda birden fazla hipokampus doğramak mümkündür.
  5. Dilimleri ayırmak için, dilimlenmiş her bir numuneyi çift uçlu spatula kullanarak doku doğrayıcıdan dikkatlice alın ve buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi içeren bir Petri kabına daldırın. İki ince fırça kullanarak hipokampusu nazikçe sıkıştırın ve dilimleri ayırın. Bu işlem boyunca dilim bütünlüğünü korumaya dikkat edin.
    1. Bu deneyi üç kopya halinde gerçekleştirin, bu nedenle her örnekten 6 dilim seçin: toplam glutamat alımı için 3 dilim ve spesifik olmayan alım için 3 dilim.
  6. Fırça ile, her dilimi Petri kabından nazikçe aşağıdakileri içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın: (i) 1 mL HBSS; ve (ii) 1 mL HBSS sodyum içermez. Uygun deney grupları ile kuyuyu/plakayı tanımlayın ve analizi en az üç nüsha halinde gerçekleştirin.
    NOT: Zaman sınırlı bir sorun nedeniyle, deney üç kopya halinde gerçekleştirilirse, hayvan/grup sayısını bir seferde yalnızca 6 ile sınırlar (5 dakikalık alımda hayvan başına bir hipokampus). Bu, L- [3H] -Glutamatın tüm dilimler inkübe edilene kadar her 15 saniyede bir uygulanacağı anlamına gelir. Reaksiyonu durdurmak için, tüm numunelerin 5 dakikalık bir inkübasyon süresine maruz kalmasını sağlamak için aynı aralığa uyulmalıdır.

8. Glutamat alım testi

  1. İlgili tamponda (HBSS veya sodyum içermeyen HBSS) dilimlerin stabilizasyonu sırasında, L- [3H] -Glutamat'ı steril su içinde 4.5 μCi/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek radyoaktif içeren çözeltiyi, dilim başına 20 μL artı bir miktar fazlalığa izin veren bir son hacimde hazırlayın, bu da partinin sonunda radyoaktif girdi eksikliğini önleyecektir, çünkü başlangıçta her dilime dakikada kaç parçalanma (DPM) sunulduğunu ölçmek gerekecektir.
    NOT: Her 24 oyuklu plaka için, L- [3H] -Glutamat alımı için gereken toplam inkübasyon süresi (5 dakika) ve aşağıda açıklandığı gibi her 20 μL alikotu (her oyukta 0.33 μCi) pipetleme süresi nedeniyle 500 μL 4.5 μCi / mL L-[3H]- Glutamat hazırlanması önerilir. L- [3H] -Glutamatın stok konsantrasyonu genellikle 1.0 mCi / mL'dir, bu nedenle dilimlere uygulamak için 1:200 seyreltme hazırlayın.
  2. HBSS'de 15 dakikalık ön inkübasyondan sonra, tamponu bir Pasteur pipeti ile tamamen çıkarın ve aşağıdakilerden birinin 280 μL'lik dilimlerine ekleyerek değiştirin: (i) toplam alım için düzenli HBSS (37 °C); veya (ii) spesifik olmayan alım için sodyum içermeyen HBSS (4 ° C). Toplam alımın 37 °C'de bir ısıtma plakası üzerinde yapılması gerektiğini, spesifik olmayan alımın ise buz üzerinde gerçekleştirildiğini fark etmek önemlidir.
  3. Bir zamanlayıcı hazırlayın ve bir dilim içeren ilk kuyucuğa 20 μL giriş eklerken deneyin başlangıcını ayarlayın. 15 - 20 s bekleyin (plakadaki dilim sayısına bağlı olarak) ve radyoaktif girişi bir sonraki kuyucuğa ekleyin ve dilim içeren kuyucukların sonuna kadar bu şekilde devam edin. Her zaman toplam inkübasyon süresini (5 dakika) göz önünde bulundurarak tüm kuyucuklara 20 μL girdi dağıtın.
  4. Plakadaki dilimleri içeren oyukların her biri doldurulduktan sonra, ilk dilimin L- [3H] -Glutamat ile 5 dakikalık inkübasyonun tamamlanmasını bekleyin. Ardından, inkübasyon ortamını hemen radyoaktif atıklar için uygun bir şişeye çıkarın.
  5. Çıkarma işleminden hemen sonra, hızlı bir şekilde 300 μL buz gibi soğuk HBSS ekleyin ve yavaşça çıkarın. Bu işlemi her bir kuyucukta iki kez daha tekrarlayın ve her dilim için üç yıkama tamamlayın. Spesifik olmayan alım ölçümüne ayrılmış dilimleri yıkamak için sodyum içermeyen HBSS'yi kullandığınızdan emin olun. Tabaktaki tüm dilimleri yıkadıktan sonra, her bir kuyucuğa 300 μL 0.5 M NaOH ekleyin ve plakayı parafilm ile korunarak gece boyunca 4 °C'de saklayın.

9. Radyoaktif L-[3H]-Glutamatın sayılması

  1. Ertesi gün, deneyde dilimler kadar çok tüpü etiketleyin ve kuyu içeriğini her tüpe toplayın. Dilimlerin lizis çözeltisinde tamamen çözündüğünden emin olun. Gerekirse, 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 26 gauge bir iğne kullanarak numuneyi homojenize edin.
  2. Yaklaşık 1,5 mL'lik bir nihai hacme 1,2 mL sintilasyon sıvısı ekleyin ve tüm numuneleri bir girdapta homojenize edin ve her biri 60 saniye boyunca bir sintilasyon sayacında okuyun.
    NOT: Algılama parametrelerinin trityum olarak ayarlandığından ve sonucun DPM cinsinden teslim edileceğinden emin olun.

10. Hesaplamalar

  1. Sintilasyon sayacı tarafından verilen sonuçları, dilim içinde sıkışan reaktif tarafından yayılan radyoaktiviteye dönüştürün ve alınan glutamat miktarını temsil eder. Spesifik olmayan alım için elde edilen değeri, normal HBSS ile elde edilen sonuçtan düşürün. Bir μCi, 2,22×106 DPM'ye eşdeğerdir.
  2. μCi miktarını ve orijinal [3H]L-Glutamat konsantrasyonunu (bilgiler genellikle reaktifin şişesinde veya veri sayfasında sağlanır) bilerek, her dilim tarafından yakalanan L-[3H]-Glutamat'ı hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Glutamat alımı, beyindeki nörotransmisyonu kontrol eden en önemli mekanizmalardan biridir. Hipokampus, özellikle, beyindeki hafıza, biliş ve duyguları birbirine bağlayan önemli bir merkez olan glutamat sinyallemesinde kritik bir yerdir. Protokolü takiben, temsili sonuçlar elde etmek için yetişkin erkek Wistar sıçanları kullanıldı. Hayvanlar bilinçlerini kaybedene kadar% 3 izofluran kullanılarak uyuşturuldu. Beyin diseke edildikten sonra, hipokampus çıkarıldı ve ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sunulan protokol, hipokampal dilimler kullanılarak gerçekleştirilmesi kolay bir glutamat alım değerlendirmesini göstermektedir. Sonuçlar, AHS'nin düzenli olarak yaklaşık 60 fmol radyoaktif işaretli L-[3H]-Glutamat aldığını, dilimin kalınlığının (protein miktarı) L-[3H]-Glutamat alımını etkilemediğini (veriler gösterilmemiştir) ve hipokampusun dorsal, orta ve ventral kısımlarının, saf yetişkin erkek Wistar sıçanlarından elde edildi?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Brezilya Ulusal Bilim ve Teknoloji Enstitüsü Eksitotoksisite ve Nöroproteksiyon [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0] ve [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
#11 scalpel bladeSwann-Morton525
100 mm glass petri dishCommon suppliers
110 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001110
42.5 mm diameter Whatman FilterSigma AldrichWHA1001042
24-well cell culture plateFalcon353047
BeckerCommon suppliers
Blades for the tissue chopperWilkinson3241
Bone rongeurErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-Aspartic acidPerkinElmerNET581001MC11.3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-GlucoseSigma AldrichG8270
N-Methyl-D- GlucamineSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Iris scissorsErwin Guth8,00,040
IsofluraneCristalia (São Paulo, Brazil)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-Glutamic AcidPerkinElmerNET490005MC49.7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Plastic Pasteur pipetteCommon suppliers
Scintillation liquidPerkinElmer1200.437 for 1 x 5 LiterOptiphase HiSafe 3
Small surgical scissorsErwin Guth8,00,040
Small tweezersErwin Guth6,00,131
Spare chopping discs for the chopperCommon suppliers
Standard scissorsErwin Guth8,00,010
Thin brushes (size 0 or 2)Common suppliers
Thin double-ended spatulaErwin Guth470.260E
Tissue ChopperTed Pella, Inc.10180

Referanslar

  1. Knierim, J. J. The hippocampus. Current Biology. 25 (23), 1116-1121 (2015).
  2. Stella, F., Cerasti, E., Si, B., Jezek, K., Treves, A. Self-organization of multiple spatial and context memories in the hippocampus. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (7), 1609-1625 (2012).
  3. Toyoda, H., et al. Interplay of amygdala and cingulate plasticity in emotional fear. Neural Plasticity. 2011, 813749(2011).
  4. Koehl, M., Abrous, D. N. A new chapter in the field of memory: adult hippocampal neurogenesis. European Journal of Neuroscience. 33 (6), 1101-1114 (2011).
  5. Bannerman, D. M., et al. Regional dissociations within the hippocampus--memory and anxiety. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 28 (3), 273-283 (2004).
  6. Moser, E., Moser, M. B., Andersen, P. Spatial learning impairment parallels the magnitude of dorsal hippocampal lesions, but is hardly present following ventral lesions. Journal of Neuroscience. 13 (9), 3916-3925 (1993).
  7. Spiers, H. J., Bendor, D. Enhance, delete, incept: manipulating hippocampus-dependent memories. Brain Research Bulletin. 105, 2-7 (2014).
  8. Gubert, P., et al. Low concentrations of methamidophos do not alter AChE activity but modulate neurotransmitters uptake in hippocampus and striatum in vitro. Life Sciences. 88 (1-2), 89-95 (2011).
  9. Andersen, J. V., et al. Extensive astrocyte metabolism of gamma-aminobutyric acid (GABA) sustains glutamine synthesis in the mammalian cerebral cortex. Glia. 68 (12), 2601-2612 (2020).
  10. Nonose, Y., et al. Guanosine enhances glutamate uptake and oxidation, preventing oxidative stress in mouse hippocampal slices submitted to high glutamate levels. Brain Research. 1748, 147080(2020).
  11. Rambo, L. M., et al. Creatine increases hippocampal Na(+),K(+)-ATPase activity via NMDA-calcineurin pathway. Brain Research Bulletin. 88 (6), 553-559 (2012).
  12. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  13. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  14. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Progress in Neurobiology. 65 (1), 1(2001).
  15. Featherstone, D. E. Intercellular glutamate signaling in the nervous system and beyond. ACS Chem Neurosci. 1 (1), 4-12 (2010).
  16. Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
  17. Grewer, C., Rauen, T. Electrogenic glutamate transporters in the CNS: molecular mechanism, pre-steady-state kinetics, and their impact on synaptic signaling. Journal of Membrane Biology. 203 (1), 1-20 (2005).
  18. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8 (12), 935-947 (2007).
  19. Vandenberg, R. J., Ryan, R. M. Mechanisms of glutamate transport. Physiological Reviews. 93 (4), 1621-1657 (2013).
  20. Peterson, A. R., Binder, D. K. Post-translational Regulation of GLT-1 in Neurological Diseases and Its Potential as an Effective Therapeutic Target. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 164(2019).
  21. Martinez-Lozada, Z., Guillem, A. M., Robinson, M. B. Transcriptional Regulation of Glutamate Transporters: From Extracellular Signals to Transcription Factors. Advances in Pharmacology. 76, 103-145 (2016).
  22. Carbone, M., Duty, S., Rattray, M. Riluzole elevates GLT-1 activity and levels in striatal astrocytes. Neurochemistry International. 60 (1), 31-38 (2012).
  23. Jimenez, E., et al. Differential regulation of the glutamate transporters GLT-1 and GLAST by GSK3beta. Neurochemistry International. 79, 33-43 (2014).
  24. Wang, C. H., et al. Radiotracer Methodology in the Biological, Environmental and Physical Sciences. , Prentice-hall. (1975).
  25. Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. Journal of Visualized Experiments. (123), e55504(2017).
  26. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309(2014).
  27. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  28. Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Wilde, G. J., Williams, L. R., Iannotti, F. Brain-derived neurotrophic factor, but not neurotrophin-3, prevents ischaemia-induced neuronal cell death in organotypic rat hippocampal slice cultures. Neuroscience Letters. 211 (3), 203-206 (1996).
  29. Paniz, L. G., et al. Neuroprotective effects of guanosine administration on behavioral, brain activity, neurochemical and redox parameters in a rat model of chronic hepatic encephalopathy. Metabolic Brain Disease. 29 (3), 645-654 (2014).
  30. Hansel, G., et al. The potential therapeutic effect of guanosine after cortical focal ischemia in rats. PLoS One. 9 (2), 90693(2014).
  31. Cittolin-Santos, G. F., et al. Neurochemical and Brain Oscillation Abnormalities in an Experimental Model of Acute Liver Failure. Neuroscience. 401, 117-129 (2019).
  32. Westphalen, R. I., Hemmings, H. C. Effects of isoflurane and propofol on glutamate and GABA transporters in isolated cortical nerve terminals. Anesthesiology. 98 (2), 364-372 (2003).
  33. Lee, A. R., Kim, J. H., Cho, E., Kim, M., Park, M. Dorsal and Ventral Hippocampus Differentiate in Functional Pathways and Differentially Associate with Neurological Disease-Related Genes during Postnatal Development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 331(2017).
  34. Thomazi, A. P., et al. Ontogenetic profile of glutamate uptake in brain structures slices from rats: sensitivity to guanosine. Mechanisms of Ageing and Development. 125 (7), 475-481 (2004).
  35. Nonose, Y., et al. Cortical Bilateral Adaptations in Rats Submitted to Focal Cerebral Ischemia: Emphasis on Glial Metabolism. Molecular Neurobiology. 55 (3), 2025-2041 (2018).
  36. Arriza, J. L., et al. Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5559-5569 (1994).
  37. Aggarwal, S., Mortensen, O. V. In Vitro Assays for the Functional Characterization of the Dopamine Transporter (DAT). Current Protocols in Pharmacology. 79, 12(2017).
  38. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  39. Moreira, J. D., et al. Dietary omega-3 fatty acids prevent neonatal seizure-induced early alterations in the hippocampal glutamatergic system and memory deficits in adulthood. Nutritional Neuroscience. , 1-12 (2020).
  40. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  41. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12 (5), 1077-1080 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Glutamat TutulumuRadyoaktif aretli L 3H GlutamatAkut Hipokampal DilimlerKemirgen HipokampusuNa Ba ml Ta y c larN rokimyaGlutamaterjik SistemN rotransmitter Ta y c larSinaptik DevrelerDeneysel ModellerN roproteksiyon MekanizmalarN rotoksisite MekanizmalarEx Vivo Yakla mlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır