A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
جيل وثقافة Organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار
In This Article
Summary
يقدم البروتوكول طريقة لزراعة ومعالجة الأجهزة العضوية اللغوية المشتقة من الخلايا الجذعية المذاق المعزولة عن حليمة الذوق الخلفي للفئران البالغة.
Abstract
يتم التوسط في حاسة الذوق من قبل براعم الذوق على اللسان ، والتي تتكون من خلايا مستقبلات الذوق المتجددة بسرعة (TRCs). هذا الدوران المستمر مدعوم من خلايا السلف المحلية ويجعل وظيفة الذوق عرضة للاضطراب من قبل العديد من العلاجات الطبية ، والتي بدورها تؤثر بشدة على نوعية الحياة. وبالتالي، فإن دراسة هذه العملية في سياق العلاج من المخدرات أمر حيوي لفهم ما إذا كانت وظيفة سلف الذوق وإنتاج TRC تتأثر وكيفية ذلك. وبالنظر إلى المخاوف الأخلاقية والتوافر المحدود لأنسجة الذوق البشري ، فإن نماذج الماوس ، التي لديها نظام طعم مشابه للبشر ، تستخدم عادة. بالمقارنة مع أساليب الجسم الحي ، والتي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وغير قابلة للدراسات عالية الإنتاجية ، يمكن أن تمكن الأجهزة اللغوية المورين من تشغيل التجارب بسرعة مع العديد من التكرارات وعدد أقل من الفئران. هنا، تم تكييف البروتوكولات المنشورة سابقا ويتم تقديم طريقة موحدة لتوليد الأجهزة العضوية الذوق من خلايا السلف الذوق معزولة عن الحليمة المحيطة (CVP) من الفئران البالغة. خلايا السلف الذوق في CVP التعبير LGR5 ويمكن عزلها عن طريق EGFP تفلور تنشيط فرز الخلايا (FACS) من الفئران التي تحمل Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 أليل. يتم صفيحة الخلايا المفرزة على نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قائم على هلام المصفوفة ومثقفة لمدة 12 يوما. الأجهزة العضوية توسيع لأول 6 أيام من فترة الثقافة عن طريق الانتشار ومن ثم الدخول في مرحلة التمايز، والتي تولد جميع أنواع الخلايا طعم ثلاثة جنبا إلى جنب مع الخلايا الظهارية غير الذوق. يمكن حصاد الأجهزة العضوية عند النضج في اليوم 12 أو في أي وقت أثناء عملية النمو للتعبير عن الحمض النووي الريبي والتحليل الكيميائي المناعي. توحيد أساليب الثقافة لإنتاج organoids لغوية من الخلايا الجذعية الكبار سوف يحسن استنساخ وتقدم organoids اللغوية كأداة قوية لفحص المخدرات في الكفاح من أجل مساعدة المرضى الذين يعانون من خلل الذوق.
Introduction
في القوارض ، يتم إيواء براعم الذوق اللغوي في حليمة فطرية موزعة بشكل مسبق ، حليمة مناجاة ثنائية الخلفي ، وكذلك حليمة محيطة واحدة (CVP) في خط الوسط الملصقات لللسان1. ويتكون كل برعم طعم من 50-100 قصيرة الأجل، وتجديد سريع خلايا مستقبلات الذوق (TRCs)، والتي تشمل نوع الأول مثل خلايا الدعم glial، نوع الخلايا الثانية التي تكشف الحلو، المر، وumami، والخلايا من النوع الثالث التي تكشف الحامض2،3،4. في CVP الماوس، LGR5+ الخلايا الجذعية على طول الصفيحة القاعدية تنتج جميع أنواع TRC وكذلك الخلايا الظهارية غير الذوق5. عند تجديد نسب الذوق ، يتم تحديد خلايا ابنة LGR5 لأول مرة كخلايا سلائف طعم ما بعد الميتوتيك (خلايا النوع الرابع) التي تدخل برعم الذوق وقادرة على التفريق في أي من أنواع TRCالثلاثة 6. دوران سريع من TRCs يجعل نظام الذوق عرضة للاضطراب من قبل العلاجات الطبية، بما في ذلك الإشعاع وبعض العلاجات الدوائية7،8،9،10،11،12،13. وبالتالي ، فإن دراسة نظام الذوق في سياق تنظيم الخلايا الجذعية الذوق والتمايز TRC أمر حيوي لفهم كيفية التخفيف من أو منع خلل الذوق.
الفئران هي نموذج تقليدي لدراسات الجسم الحي في علم الذوق حيث أن لديها نظام الذوق نظمت على نحو مماثل للبشر14،15،16. ومع ذلك ، فإن الفئران ليست مثالية لدراسات الإنتاجية العالية ، لأنها مكلفة للحفاظ عليها وتستغرق وقتا طويلا للعمل معها. للتغلب على ذلك، تم تطوير أساليب في المختبر زراعة الجهازية في السنوات الأخيرة. يمكن أن تولد الأجهزة العضوية الذوق من الأنسجة CVP الأصلية، وهي العملية التي الأجهزة برعم قبالة من ظهارة CVP الماوس معزولة مثقف ex vivo17. هذه organoids عرض ظهارة متعددة الطبقات تتفق مع نظام الذوق في الجسم الحي. تم تطوير طريقة أكثر كفاءة لتوليد organoids التي لا تتطلب ثقافة CVP الجسم الحي السابق من قبل رين وآخرون. تكييف أساليب والثقافة وسائل الإعلام وضعت لأول مرة لتنمو organoids المعوية، فإنها عزل Lgr5-GFP واحد+ خلايا السلف من CVP الماوس ومطلي لهم في هلام مصفوفة19. ولدت هذه الخلايا وحيدة organoids اللغوية التي تتكاثر خلال الأيام ال 6 الأولى من الثقافة، وتبدأ في التفريق حول اليوم 8، وبحلول نهاية فترة الثقافة تحتوي على خلايا الظهارية غير الذوق وجميع أنواع TRCالثلاثة 18،20. حتى الآن، وقد نشرت دراسات متعددة باستخدام نظام نموذج organoid لغوي17،18،20،21،22؛ ومع ذلك، تختلف الأساليب والظروف الثقافية المستخدمة لتوليد هذه الأجهزة العضوية عبر المنشورات(الجدول التكميلي 1). وهكذا، تم تعديل هذه الأساليب وتحسينها هنا لتقديم بروتوكول موحد مفصل لثقافة organoids اللغوية المستمدة من LGR5+ السلف من CVP الماوس الكبار.
توفر الأجهزة العضوية اللغوية نموذجا فريدا لدراسة العمليات البيولوجية للخلايا التي تقود تطور خلايا الذوق وتجديدها. مع توسع تطبيقات الأجهزة العضوية اللغوية والتحرك نحو استخدام المزيد من المختبرات في نماذج الجهازية المختبرية ، من المهم أن يسعى المجال إلى تطوير واعتماد بروتوكولات موحدة لتحسين القابلية للاستنساخ. إن إنشاء أعضاء لغوية كأداة قياسية في علم الذوق من شأنه أن يمكن دراسات الإنتاجية العالية التي تتباعد كيف تولد الخلايا الجذعية المفردة الخلايا المتمايزة لنظام ذوق البالغين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الأجهزة اللغوية لفحص الأدوية بسرعة للتأثيرات المحتملة على التوازن الذوقي ، والتي يمكن بعد ذلك التحقيق فيها بشكل أكثر شمولا في النماذج الحيوانية. وسيعزز هذا النهج في نهاية المطاف الجهود الرامية إلى ابتكار علاجات تحسن نوعية حياة متلقي الأدوية في المستقبل.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية في منشأة معتمدة من AAALAC وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر ، وقانون رعاية الحيوان ، وسياسة خدمة الصحة العامة ، ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في حرم جامعة كولورادو أنشوتز الطبي. Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول هي من مختبر جاكسون، المخزون رقم 008875.
ملاحظة: يجب إكمال الخطوات التالية قبل البدء لضمان التقدم السلس وفي الوقت المناسب للبروتوكول: تعيين حمام مائي إلى 37 درجة مئوية، تعيين الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية، وجعل الحقن وحلول إنزيم التفكك من 10 ملغم / مل ديسباس، Collagenase، وحلول المخزون Elastase (انظر جدول المواد)،وإزالة هلام مصفوفة من -20 درجة مئوية الفريزر (~ 750 ميكرولتر اللازمة للوحة 48 بئر) وذوبان عن طريق غمر القارورة في الجليد لفي ما لا يقل عن 3-4 ساعة، أنابيب الطرد المركزي الدقيق قبل معطف في FBS غير مخففة عن طريق هزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل (أنبوبين 2 مل لجمع الأنسجة، واثنين من أنابيب 1.5 مل للخلايا المفككة، وأنبوب واحد 1.5 مل لجمع خلايا واحدة من فرز الخلايا؛ إزالة FBS الزائدة قبل الاستخدام).
1. عزل ظهارة CVP
ملاحظة: للحصول على ما يكفي LGR5+ خلايا لوحة كاملة 48 جيدا، وجمع ثلاثة LGR5-EGFP CVPs في نفس الأنبوب وعملية في وقت واحد. الأهم من ذلك، حصاد ومعالجة CVP من نوع واحد على الأقل البرية littermate بالتوازي في أنبوب منفصل والاستفادة منه كتحكم في gating لتعيين المعلمات FACS (انظر النتائج التمثيلية).
- قتل الفئران مع الاختناق CO2 وفقا للوائح IACUC، تليها طريقة ثانوية معتمدة مثل استئصال الصدر الثنائي، خلع عنق الرحم، قطع الرأس، أو exsanguination.
- استخدام مقص تشريح معقم كبير لقطع الخدين وكسر الفك. رفع اللسان وقطع الفرينوم اللغوي لفصل اللسان عن أرضية تجويف الفم. قطع اللسان وجمعه في العقيمة الجليد الباردة دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (dPBS) مع Ca2 + و Mg2 +.
- إزالة وتجاهل اللسان الأمامي عن طريق قطع فقط الأمامية من سماحة بين النجوم مع شفرة حلاقة (الشكل 1A، خط متقطع ). استخدام مسح مهمة حساسة لإزالة أي شعر والسائل الزائد من اللسان الخلفي.
- ملء 1 مل حقنة مع 200-300 ميكرولتر من محلول إنزيم الحقن (التركيز النهائي: 2 ملغم / مل نوع I Collagenase و 5 ملغ / مل Dispase II في Ca2 +/ Mg2 +- تحتوي على dPBS ، مخفف من 10 ملغ / مل حلول الأسهم) وإدراج إبرة 30 G × 1/2 فقط فوق سماحة بين الكائنات(الشكل 1B، السهم الأسود)حتى مجرد الأمامية إلى CVP ( الشكل1B، الصندوق الأسود). حقن محلول الانزيم تحت وعلى الحواف الجانبية للCVP بين الظهارة والأنسجة الكامنة (الصفيحة البربريا, العضلات). سحب الحقنة ببطء وباستمرار من اللسان كما يتم تنفيذ الحقن.
- احتضان اللسان في Ca2+/ Mg2 +خالية dPBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 33 دقيقة على وجه التحديد.
- إجراء تخفيضات صغيرة في الظهارة ثنائيا وفقط الأمامية إلى CVP باستخدام مقص تشريح غرامة اضافية، وتقشير بلطف الظهارة عن طريق رفعه مع ملقط غرامة. بمجرد أن تكون ظهارة الخندق خالية من النسيج الضام الأساسي ، ضعه في أنبوب طرد دقيق فارغ سعة 2 مل مغلف مسبقا ب FBS. هل التشذيب الظهاري قبل أو بعد فصل ظهارة CVP (الشكل 1C، D).
2. تفكك ظهارة CVP
ملاحظة: يتم تمثيل فصل ظهارة CVP والطلاء بيانيا في الشكل 2.
- إضافة كوكتيل إنزيم الفصام (التركيز النهائي: 2 ملغم/مل من النوع I Collagenase، 2 ملغم/مل إيلاستاز، و5 ملغم/مل ديسباس الثاني في Ca2+/Mg2+-تحتوي على dPBS، مخففة من 10 ملغم/مل من حلول المخزون) إلى أنابيب تحتوي على ظهارة CVP مقشرة (200 ميكرولتر لكل CVP). احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. دوامة لفترة وجيزة كل 15 دقيقة.
ملاحظة: ما قبل الحرب 0.25٪ تريبسين-EDTA في 37 °C حمام مائي خلال آخر 15 دقيقة من حضانة كوكتيل انزيم. - بعد الحضانة، دوامة (ثلاث نبضات) ثم triturate مع ماصة باستور الزجاج لمدة 1 دقيقة. بعد أن تستقر قطع الأنسجة ، ماصة الناسخة التي تحتوي على المجموعة الأولى من الخلايا المفككة ، إلى أنابيب طرد ميكروروكتري 1.5 مل جديدة مغلفة ب FBS تتوافق مع النمط الجيني. معالجة قطع الأنسجة المتبقية كذلك كما هو موضح في الخطوة 2.3. ادناه.
- تدور supernatant لمدة 5 دقائق في 370 × ز و 4 درجة مئوية لخلايا بيليه.
- إزالة supernatant الناتجة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في فلورسينس تنشيط فرز الخلية (FACS) العازلة (1 mM EDTA، 25 mM HEPES (الرقم الحموضة 7.0) و 1٪ FBS في كا2 +/ ملغ2 +- برنامج تلفزيوني مجاني (50 ميكرولتر لكل CVP)). تخزين على الجليد.
- أثناء تنفيذ الخطوتين 2.2.1 و 2.2.2، قم بفك قطع الأنسجة المتبقية من الخطوة 2.2 بإضافة أنابيب طرد مركزي دقيقة مسبقة الدفء بنسبة 0.25٪ من التريبسين-EDTA (200 ميكرولتر لكل CVP) إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق الأصلية سعة 2 مل واحتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. دوامة لفترة وجيزة كل 10 دقيقة.
- بعد الحضانة، دوامة الأنبوب الذي يحتوي على قطع الأنسجة (ثلاث نبضات) ثم triturate مع ماصة باستور الزجاج لمدة 1 دقيقة. بعد أن تستقر قطع الأنسجة، تقوم ماصة المصبوبة العملاقة في أنابيب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل التي تحتوي على خلايا من الخطوة 2.2.2. تجاهل الأنابيب التي تحتوي على قطع الأنسجة المتبقية.
- تدور الأنابيب مع الخلايا المفككة لمدة 5 دقائق في 370 × ز و 4 درجة مئوية لخلايا بيليه.
- إزالة الكريات الخلية الفائقة وإعادة الإنفاق في المخزن المؤقت FACS (100 ميكرولتر لكل CVP). تخزين على الجليد.
- تمرير الخلايا من خلال مرشح شبكة النايلون 30 ميكرومتر وإضافة DAPI (λالانبعاثات = 450 نانومتر) إلى خليط الخلية قبل FACS. عزل Lgr5-GFP+ الخلايا عبر FACS باستخدام قناة البروتين الفلوري الأخضر (λالإثارة = 488 نانومتر؛λ الانبعاثات = 530 نانومتر). فرز الخلايا باستخدام فوهة 100 ميكرومتر في أنبوب طارد دقيق جديد مغلف ب FBS 1.5 مل يحتوي على 300 ميكرولتر من Ca2 +/ Mg2 + dPBS مجانا. ضع الخلايا على الجليد حتى الطلاء.
3. طلاء Lgr5-EGFP الخلايا
- تحديد حجم LGR5+ تعليق الخلية الواردة من تدفق الخلايا.
- استنادا إلى عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من الفرز، احسب عدد الخلايا لكل ميكرولتر. ثم، تحديد حجم اللازمة للحصول على العدد المطلوب من الخلايا للطلاء (نستخدم 200 خلية لكل بئر من لوحة 48 جيدا) ونقل هذا الحجم الإجمالي من الخلايا المعلقة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد.
- تدور أنبوب لمدة 5 دقائق في 370 × ز و 4 درجة مئوية لخلايا بيليه (بيليه قد لا تكون مرئية). إزالة supernatant ووضع الأنبوب على الجليد.
- إعادة إنفاق بيليه الخلية بلطف في الكمية المناسبة من هلام المصفوفة (15 ميكرولتر لكل بئر لصفائح 48 بئرا)؛ ماصة صعودا وهبوطا بلطف لتوزيع الخلايا بدقة في هلام مصفوفة. ضع 15 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة / الخلية في وسط كل بئر. الحفاظ على أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد في أنبوب مخروطي 50 مل أثناء الطلاء لمنع هلام مصفوفة من التبلور. الاستمرار في خلط مصفوفة هلام / خليط الخلية في جميع أنحاء الطلاء عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا كل ثلاثة آبار لضمان توزيع متساو للخلايا عبر الآبار.
- ضع اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2، ~ 95٪ رطوبة) لمدة 10 دقائق للسماح بجل المصفوفة. ثم، إضافة 300 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة WENRAS + Y27632 وسائل الإعلام إلى كل بئر والعودة لوحة إلى الحاضنة.
4. صيانة الجهاز
ملاحظة: تزرع Organoids في الوسائط العضوية التقليدية (WENR) التي تضم EGF المؤتلف و 50٪ وسائط مكيفة تحتوي على Wnt3a و Noggin و R-spondin23. يتم إضافة الأدوية A8301 و SB202190 لأول 6 أيام من فترة الثقافة لتحسين النمو (وسائل الإعلام WENRAS) (الشكل 5)، ثم إزالتها لتعزيز التمايز (WENR وسائل الإعلام)20. يضاف Y27632 لأول يومين من الثقافة لتعزيز البقاء على قيد الحياة. يتم عرض شروط الوسائط المتعلقة بالجدول الزمني للثقافة في الشكل 4.
- بعد يومين من الطلاء، قم بإزالة وسائط WENRAS + Y27632 من كل بئر باستخدام ماصة 1 مل، مما يضمن عدم وجود تلوث متقاطع. إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام WENRAS أسفل الجانب من البئر لعدم تعطيل هلام مصفوفة. أعد الطبق إلى الحاضنة.
- تغيير وسائل الإعلام كل يومين، وذلك باستخدام وسائل الإعلام المناسبة لمرحلة الثقافة (الشكل 4). الحفاظ على organoids حتى اليوم 12، عندما تكون الأجهزة العضوية جاهزة للحصاد.
5. تجهيز الحمض النووي الريبي
- حصاد الأجهزة العضوية للجيش الملكي النيبالي
- ضع طبق 48 جيدا على الجليد لمدة 30 دقيقة لإزالة غمر هلام المصفوفة.
- باستخدام ماصة 1 مل، سحب ما يصل وسائل الإعلام organoid. ثم، كما يتم إرجاع وسائل الإعلام إلى البئر، واستخدام غيض من ماصة إلى الصفر وتفكك مزيد من هلام مصفوفة. نقل المحتويات إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق، وتجميع محتويات ثلاثة آبار في أنبوب واحد. طرد الأنابيب لمدة 5 دقائق في 300 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة أكبر قدر ممكن من وسائل الإعلام العملاقة دون إزالة أي organoids؛ ثم، تدور أسفل أنابيب مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 300 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الوسائط المتبقية وإعادة إنفاق الأجهزة العضوية في 350 μL تحلل العازلة + β ميركابتوثانول (βME) (10 ميكرولتر βME لكل 1 مل تحلل العازلة). ضع العينات على الجليد لاستخراج الحمض النووي الريبي الفوري أو تخزينها عند -80 درجة مئوية.
- تحليل ال RT-PCR الكمي
- قياس كمية الحمض النووي الريبي عن طريق مطياف. عكس نسخ الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة توليف cDNA.
- مزيج cDNA يعادل 5 نانوغرام الجيش الملكي النيبالي مع 200 nM التحقق مسبقا إلى الأمام وعكس التمهيديات (الجدول 1) والفلورسنت PCR ماجستير ميكس. تشغيل رد فعل qRT-PCR لمدة 40 دورة في: 95 درجة مئوية لمدة 15 s، ثم 60 درجة مئوية لمدة 60 s.
6. الكيمياء المناعية
- حصاد وإصلاح الأجهزة العضوية
- ضع طبق 48 جيدا على الجليد لمدة 30 دقيقة لتخفيف هلام المصفوفة.
- إزالة الوسائط organoid وإضافة 400 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني إلى كل بئر. ثم، إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 400 ميكرولتر من الجليد الباردة حل استعادة الخلايا إلى كل بئر. صخرة بلطف في 4 °C لمدة 30 دقيقة.
- معطف تلميح ماصة 1 مل مع 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني، ومحتويات pipet بلطف من البئر صعودا وهبوطا لتفريق هلام مصفوفة. نقل organoids إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق وضعت على الجليد.
- شطف كل بئر مع 300 μL PBS + 1٪ BSA ونقل أي organoids المتبقية إلى الأنابيب المقابلة. إزالة حل استعادة الخلية / برنامج تلفزيوني + BSA من كل أنبوب. إضافة 400 ميكروغرام من الجليد الباردة PBS، ثم كرر مع آخر الجليد الباردة PBS شطف.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإصلاح organoids مع 300 ميكرولتر الجليد الباردة 4٪ PFA (في 0.1 M PB) لمدة 20 دقيقة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة. إزالة PFA وشطف organoids مع 400 ميكرولتر الجليد الباردة PBS.
- إزالة برنامج تلفزيوني; ثم، إضافة 400 μL PBS + 1٪ BSA. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- تلطيخ الفلورة المناعية
- شطف organoids في 500 μL PBS + 1٪ BSA. ثم، احتضان organoids في حل حجب (5٪ الماعز العادي أو مصل الحمير، 1٪ ألبوم مصل البقر، 0.3٪ تريتون X 100 في 1x PBS pH 7.3) لمدة 2 ساعة، هزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة الحل الأساسي للأجسام المضادة (الأجسام المضادة الأولية المخففة في حل حجب) والصخور بلطف لمدة 3 ليال في 4 درجة مئوية.
- غسل organoids 4x ل 1 ساعة مع 500 μL PBS + 0.2٪ تريتون، هزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة. إضافة حل الأجسام المضادة الثانوية (الأجسام المضادة الثانوية المخففة في حل حجب) والأعضاء الصخرية بين عشية وضحاها، محمية من الضوء، في 4 درجة مئوية.
- غسل organoids 3x ل 1 ساعة مع 500 μL PBS + 0.2٪ تريتون، محمية من الضوء وهزاز بلطف في درجة حرارة الغرفة. حضانة مع DAPI المخفف 1:10،000 في 0.1 M PB لمدة 20 دقيقة، هزاز ومغطاة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل organoids 3x لمدة 20 دقيقة مع 0.1 M PB، هزاز بلطف ومغطاة في درجة حرارة الغرفة.
- تصاعد الشريحة من organoids للمجهر الكونفوجال مقلوب.
ملاحظة: تظهر الصور خطوة بخطوة لعملية تصاعد الشرائح في الشكل 7.- إنشاء ~ 1 مم سميكة 22 × 22 ملم محيط مربع من الطين النمذجة غير سامة على شريحة المجهر.
- إزالة 0.1 M PB من أنبوب الطرد المركزي الدقيق, و العضويات resuspend بلطف في 100 ميكرولتر تصاعد المتوسطة من الاختيار; ثم، نقل إلى وسط الساحة الطينية.
- ملء مربع الطين حتى المتوسطة المتصاعدة تقريبا إلى الأعلى. ثم ضع 22 × 22 مم مربع يغطي على الطين واضغط لأسفل بقوة على جانبي غطاء لختم. السماح لها علاج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (هنا، ودرجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 أيام) وتخزينها في 4 °C.
النتائج
الفئران لديها CVP واحد، وتقع الخلفي على اللسان، والتي يمكن عزل LGR5+ الخلايا الجذعية (الشكل 1A،الصندوق الأسود). حقن محلول إنزيم تحت وحول CVP(الشكل 1B)يؤدي إلى تورم طفيف في الظهارة وهضم النسيج الضام. يتم تحقيق هضم كاف بعد حضانة 33 دقيقة ، مما يسمح بفصل ?...
Discussion
وذكرت هنا هو وسيلة فعالة وقابلة للتكرار بسهولة لزراعة وصيانة ومعالجة organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار. ووجد أن استخدام ثلاثة CVPs من 8 إلى 20 أسبوعا Lgr5-فئران EGFP كافية للحصول على ~ 10000 GFP+ الخلايا للاستخدام التجريبي ، مما أدى إلى 50 بئرا مطلية بكثافة 200 خلية لك...
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر الدكتور بيتر ديمبسي ومونيكا براون (جامعة كولورادو Anschutz الطبية الحرم الجامعي Organoid والأنسجة النمذجة الموارد المشتركة) لتوفير وسائل الإعلام WNR مشروطة ومناقشات قيمة. نشكر أيضا جامعة كولورادو تقنيات الخلايا مركز السرطان وتدفق الموارد المشتركة قياس الخلايا، وخاصة ديمتري باتورين، لخبرة فرز الخلايا. تم تمويل هذا العمل من قبل: NIH/NIDCD R01 DC012383، DC012383-S1، DC012383-S2، والمعاهد القومية للصحة/NCI R21 CA236480 إلى LAB، وR21DC016131 وR21DC016131-02S1 إلى DG، وF32 DC015958 إلى EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
References
- Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Finger, T. E., Silver, W. L. . The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).
- Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
- Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).
- Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
- Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
- Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
- Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
- Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
- Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
- Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
- Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
- Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
- Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
- Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
- Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
- Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
- Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
- Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. . Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).
- Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
- Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).
- Vintschgau, M. v., Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
- Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved