从成年小鼠味干细胞中衍生的语言器官的生成与培养

摘要

该协议提出了一种培养和处理从成年小鼠后味分离出的味觉干细胞中提取的语言器官的方法。

摘要

味觉由舌头上的味蕾进行介质，由快速更新的味道受体细胞（TRCs）组成。这种持续的周转是由局部祖细胞驱动的，使味觉功能容易受到多种药物治疗的干扰，进而严重影响生活质量。因此，在药物治疗的背景下研究这个过程对于了解是否以及如何影响味觉祖传功能和 TRC 生产至关重要。鉴于伦理问题和人类味觉组织的有限可用性，通常使用与人类相似的味觉系统。与 活体 方法相比，这种方法既费时又昂贵，而且不适合高通量研究，而穆林语言器官可以使实验在许多复制物和更少的小鼠下快速运行。在这里，先前公布的协议已经调整，并提出了一个标准化的方法，从从成年小鼠的环状（ CVP ）分离的味觉祖细胞生成味觉器官。品尝CVP表达LGR5中的祖细胞，可以通过EGFP荧光激活细胞分拣（FACS）从携带^{Lgr5EGFP-IRES-CreERT2} 等位基因的小鼠身上分离出来。分拣的细胞被镀在基于基质凝胶的3D培养系统上，培养12天。器官通过增殖在培养期的前6天扩张，然后进入分化阶段，在此期间，它们与非味上皮细胞一起产生所有三种味觉细胞类型。器官可在第12天成熟时或在RNA表达和免疫组织化学分析的生长过程中随时采集。标准化从成人干细胞中生产语言器官的培养方法将提高可重复性，并推动语言器官作为一种强大的药物筛选工具，帮助体验味觉障碍的患者。

引言

在啮齿动物中，语言味蕾被安置在真菌状的中，前分布，双边叶状后部，以及舌头¹后部中线的单个环状（ CVP ）。每个味蕾由50-100个短寿命、快速更新的味觉受体细胞（TRCs）组成，其中包括I型胶质状支持细胞、检测甜、苦和乌玛米的II型细胞，以及检测酸^2、3、4的III型细胞。在小鼠CVP中，LGR5⁺干细胞沿基底拉米纳产生所有TRC类型以及非味上皮细胞^5。更新味觉血统时，LGR5女儿细胞首先被指定为进入味蕾并能够分化为三种 TRC 类型⁶中的任何一种的后味觉前体细胞（IV 型细胞）。TRC的迅速更替使味觉系统容易受到医疗的干扰，包括放射和某些药物疗法^{7，8，9，10，11，12，13。}

研究方案

所有动物程序均在AAALAC认可的设施内按照《实验室动物护理和使用指南》、《动物福利法》和《公共卫生服务政策》执行，并经科罗拉多大学安舒茨医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本协议中使用的Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2} 小鼠来自杰克逊实验室，库存号008875。

注：在开始之前应完成以下步骤，以确保协议的顺利和及时进展：将水浴设置为 37 °C， 将离心机设置为 4 °C，将注射和分离酶溶液从 10 毫克/mL 脱脂、拼贴酶和弹性酶库存溶液（参见 材料表）中取出基质凝胶从 -20 °C 冰柜中取出（48 井板所需的 ±750 μL），然后通过将小瓶浸入冰中解冻。至少 3-4 小时，未稀释的 FBS 中的预涂层微中心管，在室温下轻轻摇晃至少 30 分钟（两个 2 mL 管用于组织收集，两个 1.5 mL 管用于分离细胞，一个 1.5 mL 管用于从细胞分拣机收集单个细胞;使用前去除多余的 FBS）。

1. CVP 上皮的分离

注：要获得足够的LGR5⁺ 细胞，以获得一个完整的48井板，收集三个Lgr5-EGFP CVP在同一管和过程同时。重要的是，在单独的管子中并行采集和处理至少一个野生类型的垃圾的CVP，并利用它作为一个鳄鱼控制来设置FACS参数（见 ....

结果

老鼠有一个CVP，位于舌头的后部，LGR5⁺ 干细胞可以从中分离出来（图1A，黑匣子）。在 CVP （图 1B）下和周围注射酶溶液会导致上皮轻微肿胀和结缔组织的消化。经过33分钟的孵化后，可以实现充分的消化，从而可以轻松地将CVP上皮与底层组织分离。在尝试剥去 CVP 上皮时，应在距离 CVP 足够远的地方进行切割，以确保战壕不会中断?.......

讨论

这里报道的是一种高效且易于重复的方法，用于培养、维持和处理从成年小鼠味干细胞中提取的语言器官。研究发现，使用3个CVP从8至20周大的Lgr5-EGFP小鼠足以获得€10，000 GFP⁺ 细胞进行实验使用，导致50口井镀在密度为200细胞每井在48井板。通过注射新制作的 Dispase II 和 I 型拼贴液，然后进行 33 分钟的孵化，优化了 CVP 沟渠上皮的去除。然而，更短的潜伏时间，旧的酶，不同的批次?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG	Molecular Probes	A11056, RRID: AB_142628	1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A11010, RRID:AB_2534077	1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG	Invitrogen	A11075, RRID:AB_2534119	1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A31573, RRID:AB_2536183	1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG	Molecular Probes	A21247, RRID:AB_141778	1:2000
DAPI (for FACS)	Thermo Fischer	62247
DAPI (for immunohistochemistry)	Invitrogen	D3571, RRID:AB_2307445	1:10000
Goat anti-CAR4	R&D Systems	AF2414, RRID:AB_2070332	1:50
Guinea pig anti-KRT13	Acris Antibodies	BP5076, RRID:AB_979608	1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-395, RRID:AB_673678	1:250
Rabbit anti-NTPDASE2	CHUQ	mN2-36LI6, RRID:AB_2800455	1:300
Rat anti-KRT8	DSHB	TROMA-IS, RRID: AB_531826	1:100
Equipment
2D rocker	Benchmark Scientific Inc.	BR2000
3D Rotator	Lab-Line Instruments	4630
Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	S407992
Centrifuge	Eppendorf	5415D
CO2 tank	Airgas	CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4110	184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte	Sartorius	Model: S3	Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100	Cytomation Inc	Model: S13211997	Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E1
Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5417R
Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Thermal Cycler	Bio-Rad	580BR
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Water bath	Precision	51220073
Media
A83 01	Sigma	SML0788-5MG	Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 Supplement	Gibco	17504044	Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin	Gibco	15750-060	Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax	Gibco	35050061	Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES	Gibco	15630080	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF	Peprotech	315-09-1MG	Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin	Peprotech	250-38	Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100g	Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190	R&D Systems	1264	Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media			Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug	APExBIO	A3008-10	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%	Sigma	M3148-25ML	β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1420-2700
48-well plates	Thermo Scientific	150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets	Fisherbrand	12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Life Science	A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer	QIAGEN	1015750
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I	Sigma Life Science	C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear	R&D Systems	3533-005-02	Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001
Disposable Filters	Sysmex	04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)	Gibco	10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)	Promega	V4231
Elastase Lyophilized	Worthington Biochemical	LS002292
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
HEPES Solution	Sigma Life Science	H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA	Thermo Scientific	25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1706691
Modeling Clay, Gray	Sargent Art	22-4084
Needle	BD Syringe	305106
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
RNeasy Micro Kit	QIAGEN	74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	022363204
Sodium Chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher Chemical	7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous	Fisher Bioreagents	7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Triton X-100	Sigma Life Science	T8787-100ML
VWR micro cover glass	VWR	48366067	22x22mm