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要約

このプロトコルは、成体マウスの後味乳頭から単離された味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養および処理するための方法を提示する。

要約

味覚は舌の味覚芽によって媒介され、急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成されています。この継続的な売上高は、局所的な前駆細胞によって動力を与えられ、多数の医療によって混乱を招きやすい味覚機能を提供し、生活の質に深刻な影響を与えます。したがって、薬物治療の文脈でこのプロセスを研究することは、味前駆物質機能とTRC産生が影響を受けるかどうか、そしてどのように影響を受けるかを理解するために不可欠です。倫理的な懸念と人間の味の組織の限られた可用性を考えると、マウスモデルは、人間と同様の味覚システムを持つ、一般的に使用されています。時間がかかり、高価で、高スループットの研究に適していない in vivo 方法と比較して、マウスリングアルガノイドは、多くの複製と少ないマウスで実験を迅速に実行することができます。ここで、以前に公開されたプロトコルが適応され、成体マウスの周回乳頭(CVP)から分離された味覚前駆細胞からオルガノイドの味覚を生成するための標準化された方法が提示されている。CVP発現LGR5中の前駆細胞を味わい、Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 アレルを運ぶマウスからEGFP蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して単離することができる。並べ替えられた細胞は、マトリックスゲルベースの3D培養システムにメッキされ、12日間培養されます。オルガノイドは、増殖を介して培養期間の最初の6日間増殖し、その間に非味上皮細胞と共に3つの味細胞タイプすべてを生成する分化段階に入る。オルガノイドは、12日目の成熟時、またはRNA発現および免疫組織化学分析のための成長過程でいつでも収穫することができる。成体幹細胞から言語性オルガノイドを生産するための培養方法を標準化することは、味覚機能障害を経験している患者を助けるために戦いの強力な薬物スクリーニングツールとして再現性を向上させ、言語オルガノイドを進めます。

概要

げっ歯類では、舌の後臭中線で舌の舌の前に分布する乳頭の真菌、両側葉乳頭、ならびに単一の周回乳頭(CVP)に舌の味覚芽が収容される。各味覚芽は、50〜100の短命で急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成され、I型グリア様支持細胞、甘味、苦い、旨味を検出するII型細胞、酸味2、3、4を検出するIII型細胞が含まれる。マウスCVPにおいて、基底層に沿ったLGR5+幹細胞は、非味の上皮細胞と同様に、すべてのTRCタイプを産生する5。味覚系統を更新する場合、LGR5娘細胞は、味覚芽に入り、3つのTRCタイプ6のいずれかに分化することができる、まず、味覚後前駆細胞(IV型細胞)として指定される。TRCの急速な回転は、放射線および特定の薬物療法を含む治療によって中断されやすい味覚システムをレンダリングします7,8,9,10 ,11,12,13.したがって、味覚機能の制御とTRC分化のコンテキストで味覚システムを研究することは、味覚機能障害を軽減または予防する方法を理解するために不可欠である。

マウスは、ヒト14、15、16と同様に組織された味覚システムを有するため、味覚科学におけるインビボ研究の伝統的なモデルである。しかし、マウスは維持コストが高く、作業に時間がかかるため、高スループット研究には適していません。これを克服するために、インビトロオルガノイド培養方法が近年開発されている。味オルガノイドは、天然のCVP組織から生成することができ、単離マウスCVP上皮培養ex vivo17からオルガノイドが芽を出すプロセスである。これらのオルガノイドは、インビボ味覚システムと一致する多層上皮を示す。ex vivo CVP培養を必要としないオルガノイドを生成するより効率的な方法は、2014年18年にRenらによって開発されました。腸オルガノイドを成長させるために最初に開発された方法および培養培地を適応させ、マウスCVPから単一のLgr5-GFP+前駆細胞を単離し、マトリックスゲル19にめっきした。培養の最初の6日間に増殖するこれらの単一細胞は、8日目頃に分化し始め、培養期間の終わりまでに非味覚上皮細胞および3種類のTRCタイプ18、20すべてを含む。現在までに、言語オルガノイドモデルシステムを利用した複数の研究が17、18、20、21、22に掲載されています。しかしながら、これらのオルガノイドを生成するために使用される方法と培養条件は、出版物によって異なる(補足表1)。したがって、これらの方法は、ここで調整され、成人マウスCVPのLGR5+前駆体に由来する言語オルガノイドの培養のための詳細な標準化されたプロトコルを提示するように最適化されている。

言語オルガノイドは、味細胞の発達と再生を駆動する細胞生物学的プロセスを研究するためのユニークなモデルを提供します。イン ビトロ オルガノイドモデルの活用に向けて、言語オルガノイドの応用が拡大し、ラボが増える中、再現性を高めるために標準化されたプロトコルの開発と採用に取り組む分野が重要です。味覚科学の中で標準的なツールとして言語オルガノイドを確立することは、単一の幹細胞が成体味システムの分化された細胞を生成する方法を引き離す高スループット研究を可能にする。さらに、舌間オルガノイドは、味の恒常性に影響を与える可能性のある薬物を迅速にスクリーニングするために使用することができ、動物モデルでより徹底的に調査することができます。このアプローチは、最終的には、将来の薬物レシピエントの生活の質を向上させる治療法を考案するための努力を強化します。

プロトコル

すべての動物の手順は、実験動物のケアと使用ガイド、動物福祉法、公衆衛生サービスポリシーに従ってAAALAC認定施設で行われ、コロラド大学アンシュッツ医療キャンパスの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルで使用されるLgr5EGFP-IRES-CreERT2 マウスは、ジャクソン研究所、ストック第008875からである。

注:プロトコルのスムーズかつタイムリーな進行を確実にするために、次の手順を開始する前に完了する必要があります:37 °Cに水浴を設定し、 遠心分離機を4°Cに設定し、10mg/mLディスパス、コラゲナーゼ、エラスターゼストック溶液( 材料表を参照)から注入と解離酵素溶液を作り、-20°C冷凍庫(48ウェルプレートに必要な約750 μL)からマトリックスゲルを取り除き、氷にバイアルを浸して解凍します。少なくとも3〜4時間、希釈されていないFBSのプレコートマイクロ遠心チューブを、少なくとも30分間室温で穏やかに揺動させることで(組織採取用の2つの2つの2mLチューブ、解離された細胞用の2つの1.5mLチューブ、および細胞ソーターからの単一細胞の収集のための1つの1.5 mLチューブ;使用前に余分なFBSを除去する)。

1. CVP上皮の単離

注:フル48ウェルプレートに十分なLGR5+セルを得るために、同じチューブに3つのLgr5-EGFP CMPを収集し、同時に処理します。重要なのは、少なくとも1つの野生型のリッターのCVPを別のチューブで並行して収穫して処理し、FACSパラメータを設定するためのゲート制御としてそれを利用する(代表的な結果を参照)。

  1. IACUCの規則に従ってCO2 窒息でマウスを安楽死させ、続いて両側性回膜切除術、頸椎脱臼、切断、または排泄などの承認された二次的方法を行う。
  2. 大きな無菌解剖はさみを使用して頬を切断し、顎を壊します。舌を持ち上げ、舌を切り取り、舌を口腔の床から分離します。舌を切り取り、無菌の氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)でCa2+ とMg2+を収集します。
  3. カミソリの刃で間臼歯の前部を切り取ることによって前舌を取り除き、捨てる(図1A、破線)。後舌から髪と余分な液体を取り除くために繊細なタスクワイプを使用してください。
  4. 1 mL シリンジに200-300 μLの注射酵素溶液(最終濃度:2 mg/mL-I コラゲラーゼ、5 mg/mL ジスパーゼ II を Ca2+/Mg2+-dPBS で充填し、 10 mg/mL ストック溶液から希釈し、CVP(図1B、1B、)の前部になるまで、30 G x 1/2 針をインターモルエミデンス (図 1B、黒矢印) のすぐ上に挿入します。 ブラックボックス)。下の下の、下のCVPの側端に酵素溶液を注入し、下皮と下層組織(層状層、筋肉)の間に。注射が行われると、ゆっくりと、継続的に舌から注射器を引き出します。
  5. 正確に33分間室温で無菌Ca2+/Mg2+フリーdPBSで舌をインキュベートします。
  6. 上皮に二国間で小さな切り傷を加え、余分な細かい解剖はさみを使用してCVPの前部に切り、細かい鉗子で持ち上げて上皮をそっと剥がします。トレンチ上皮が下層の結合組織から解放されたら、FBSであらかじめコーティングされた空の2 mLマイクロ遠心チューブに入れる。CVP上皮を剥離する前または後に上皮のトリミングを行います(図1C,D)。

2. CVP上皮の解離

注: CVP 上皮とめっきの解離は 図 2にグラフィカルに表されています。

  1. 解離酵素カクテル(最終濃度:2mg/mLタイプIコラゲターゼ、2mg/mLエラスターゼ、および5mg/mLディスパーゼIIをCa2+/Mg 2+含有dPBSで、10mg/mLストック溶液から希釈)を皮をむいたCVPエピテリア(CVPあたり200μL)を含むチューブに加えます。37°Cの水浴で45分間インキュベートします。渦は15分ごとに短時間。
    注:プレウォーム0.25%トリプシン-EDTAは、酵素カクテルインキュベーションの最後の15分の間に37°C水浴中に。
  2. インキュベートに続いて、渦(3パルス)をガラスパスツールピペットで1分間トリチュレートします。組織片が沈着した後、ピペットは解化細胞の最初のコレクションを含む上清を、遺伝子型に対応する新しいFBSコーティングされた1.5 mLマイクロ遠心分離管に入る。残りの組織片をさらに工程2.3に記載されるように処理する。以下に。
    1. 上清を370xgで5分間、ペレット細胞に4°C回転させます。
    2. 得られた上清を除去し、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)バッファ(1 mM EDTA、25 mM HEPES(pH 7.0)および1%FBSのCa2+/Mg2+-free PBS(CVPあたり50 μL)で細胞ペレットを再懸濁します。氷の上に保管してください。
  3. ステップ2.2.1および2.2.2を実施しながら、ステップ2.2から残りの組織片を解離し、前もって加えた0.25%トリプシン-EDTA(CVPあたり200μL)を元の2mLマイクロ遠心チューブに加え、37°Cの水浴に30分間インキュベートします。渦は10分ごとに短時間。
  4. インキュベーションに続いて、組織片(3パルス)を含むチューブをボルテックスし、ガラスパスツールピペットで1分間トリチュレートします。組織片が沈着した後、ステップ2.2.2から細胞を含む1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに上清をピペットする。残りの組織片を含むチューブを捨てます。
    1. 370 x g で 5 分間解約した細胞と 4 °C の細胞をペレットセルにスピンします。
    2. FACSバッファ(CVPあたり100 μL)の上清を取り除き、細胞ペレットを再懸濁します。氷の上に保管してください。
  5. 30 μm ナイロン メッシュフィルタを通してセルを通過し、FACS の前に DAPI (λ放出= 450 nm) をセル混合物に追加します。緑色蛍光タンパク質チャネル(λ励起= 488 nm;λ放出=530nm)を使用してFACSを介してLgr5-GFP+細胞を単離する。100 μm のノズルを使用して、300 μL の Ca2+/Mg2+フリー dPBS を含む新しい FBS コーティングされた 1.5 mL マイクロ遠心チューブに細胞を並べ替えます。めっきするまで氷の上に細胞を置きます。

3. Lgr5-EGFP細胞のめっき

  1. フローサイトメーターから受け取ったLGR5+細胞懸濁液の体積を決定します。
  2. ソーターから得られた細胞数に基づいて、μL当たりの細胞数を計算します。次に、めっきに必要な数の細胞を得るために必要な体積を決定し(48ウェルプレートのウェルあたり200細胞を使用します)、その総懸濁細胞の体積を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
  3. 370 x g で 5 分間、ペレット細胞に 4 °C (ペレットが見えない場合があります) にチューブを回転させます。上清を取り除き、チューブを氷の上に置きます。
  4. 適切な量のマトリックスゲル(48ウェルプレートの場合はウェルあたり15 μL)で細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。ピペットを上下に緩やかにして、マトリックスゲルで細胞を完全に分配します。各ウェルの中央に15μLのマトリックスゲル/セル混合物を入れます。メッキ中にマイクロ遠心チューブを氷の上に50 mLの円錐チューブに入れたままにして、マトリックスゲルがゲル化するのを防ぎます。ウェル全体の細胞の均等な分布を確保するために、3つのウェルごとに上下にピペットを介してメッキ全体でマトリックスゲル/細胞混合物を混合し続けます。
  5. プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2、湿度95%)に10分間置き、マトリックスゲル化を可能にします。次に、300 μL の室温 WENRAS + Y27632 培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。

4. オルガノイドメンテナンス

注:オルガノイドは、組換えEGFおよびWnt3a、ノギン、およびR-spondin23を含む50%のコンディショニング培地を含む従来のオルガノイド培地(WENR)で増殖される。A8301およびSB202190は、培養期間の最初の6日間に対して、成長を最適化するために添加される(WENRAS培地)(図5)、次いで分化を促進するために除去される(WENR培地)20。Y27632は、生存を促進するために培養の最初の2日間に添加される。カルチャのタイムラインに関連するメディア条件を 図 4に示します。

  1. めっきの2日後、1 mL ピペットを使用して各ウェルからWENRAS + Y27632培地を取り出し、クロスコンタミネーションを防ぎます。ウェルの側面に300 μLのWENRAS培地を加えて、マトリックスゲルを破壊しないようにします。プレートをインキュベーターに戻します。
  2. カルチャ段階に適したメディアを使用して、2 日ごとにメディアを変更します (図 4)。オルガノイドは、オルガノイドが収穫する準備ができている12日目まで維持します。

5. RNA処理

  1. RNA用オルガノイドの収穫
    1. 48ウェルプレートを氷の上に30分間置き、マトリックスゲルを脱重化します。
    2. 1 mL ピペットを使用して、オルガノイドメディアを引き上げます。次に、媒体がウェルに戻されると、ピペットの先端を使用して、マトリックスゲルを引っ掻いてさらに分解します。1つの管の3つの井戸の内容物をプールする1.5 mLのマイクロ遠心分離管に内容物を移す。室温で300×gで5分間チューブを遠心分離します。
    3. オルガノイドを除去することなく、できるだけ多くのメディア上清を除去する。その後、室温で300 x g で5分間チューブを再びスピンダウンします。
    4. 残りの培地を取り出し、オルガノイドを350μLのリシスバッファー+βメルカプトエタノール(βME)(1mLのリシスバッファーあたり10 μL βME)で再懸濁します。サンプルを氷の上に置き、すぐにRNA抽出を行うか、-80°Cで保存します。
  2. 定量的RT-PCR分析
    1. 分光光度計を介してRNA量を測定します。cDNA合成キットを使用してRNAを逆転写します。
    2. 200 nM 事前検証されたフォワードプライマーとリバースプライマー(表1)と蛍光PCRマスターミックスを用いて、5 ng RNAに相当するcDNAを混合します。qRT-PCR反応を40サイクルで実行します:95°Cで15 s、60sの場合は60°Cを実行します。

6. 免疫染色化学

  1. オルガノイドの収穫と固定
    1. 氷の上に48ウェルプレートを30分間置き、マトリックスゲルを緩めます。
    2. オルガノイド培地を取り出し、各井戸に400μLの氷冷PBSを加えます。その後、PBSを取り除き、400 μLの氷冷細胞回収液を各ウェルに追加します。4°Cで30分間静かに揺れる。
    3. PBSで1%BSAで1mLピペットチップをコーティングし、ウェルの内容物を上下に軽くピペットしてマトリックスゲルを分解します。オルガノイドを氷の上に置かれた1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。
    4. 300 μL PBS + 1% BSA でそれぞれを十分にすすい、残りのオルガノイドを対応するチューブに移します。各チューブから細胞回収液/PBS+BSAを除去します。400 μLの氷冷PBSを加え、別の氷冷PBSリンスで繰り返します。
    5. PBSを取り除き、300 μL氷冷4%PFA(0.1 M PB)でオルガノイドを20分間固定し、室温でインキュベートします。400 μL の氷冷PBSで PFA とオルガノイドをすすい取ります。
    6. PBS を削除します。その後、400 μL PBS + 1% BSA を追加します。4 °Cで保管。
  2. 免疫蛍光染色
    1. オルガノイドを500 μL PBS + 1% BSAでリンスします。次いで、ブロッキング溶液中のオルガノイド(5%正常ヤギまたはロバ血清、1%ウシ血清アルブミン、0.3%トリトンX100中1x1xPBS pH 7.3)を2時間インキュベートし、室温で穏やかに揺れる。
    2. 一次抗体溶液(ブロッキング溶液で希釈された一次抗体)を加え、4°Cで3泊静かにロックします。
    3. オルガノイドを500 μL PBS + 0.2% トリトンで1時間4倍洗浄し、室温で穏やかに揺れる。二次抗体溶液(ブロッキング溶液で希釈された二次抗体)とロックオルガノイドを一晩加え、光から保護し、4°Cで保護する。
    4. オルガノイドを500 μL PBS + 0.2% トリトンで3倍洗浄し、光から保護し、室温で穏やかに揺れる。DAPIでインキュベート 1:10,000 0.1 M PB で 0.1 M PB で 20 分間、ロッキングし、室温で覆います。
    5. オルガノイド3倍を0.1M PBで20分間洗い、穏やかに揺れ、室温で覆います。
  3. 逆焦点顕微鏡用オルガノイドのスライド取り付け。
    注: スライドの取り付けプロセスのステップバイステップの画像を 図 7に示します。
    1. 顕微鏡スライド上に、非毒性モデリング粘土の厚さ22 x 22mm角の周長から約1mmを作成します。
    2. マイクロ遠心分離チューブから0.1 M PBを取り出し、オルガノイドを好みの100 μLの取り付け媒体で静かに再懸濁します。その後、粘土の正方形の中心に移ります。
    3. 土の土が土の上に近くなるまで粘土の正方形を埋めます。その後、22 x 22 mm の正方形のカバースリップを粘土の上に置き、カバースリップの側面をしっかりと押し下げてシールします。メーカーの指示に従って治し(ここでは、1〜2日間室温)、4°Cで保管してください。

結果

マウスは、舌の後に位置する1つのCVPを有し、そこからLGR5+ 幹細胞を単離することができる(図1A、ブラックボックス)。CVPの下および周辺の酵素溶液の注入(図1B)は、上皮のわずかな腫脹および結合組織の消化をもたらす。十分な消化は、33分のインキュベーションに続いて達成され、これは基底組織からCVP上皮を容易に分離する?...

ディスカッション

ここで報告されているのは、成人マウス味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養、維持、処理するための効率的かつ容易に再現可能な方法である。8〜20週齢のLgr5-EGFPマウスの3つのCvPsを使用すると、実験用に約10,000 GFP+細胞を得るのに十分であり、その結果、48ウェルプレートのウェルあたり200細胞の密度で50のウェルがメッキされることがわかりました。CVPトレンチ上皮...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、WNR条件付きメディアと貴重な議論を提供してくれたピーター・デンプシー博士とモニカ・ブラウン(コロラド大学アンシュッツ医療キャンパスオルガノイドと組織モデリング共有リソース)に感謝したいと考えています。また、コロラド大学がんセンターの細胞技術とフローサイトメトリー共有リソース、特にドミトリー・バトゥリンの細胞選別の専門知識に感謝します。この作品は、次の資金を提供しました: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1、DC012383-S2、NIH/NCI R21 CA236480からLABへ、R21DC016131およびR21DC016131-02S1からDG、およびF32 DC015958からEJGへ。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgGMolecular ProbesA11056, RRID: AB_1426281:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgGMolecular ProbesA11010, RRID:AB_25340771:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgGInvitrogenA11075, RRID:AB_25341191:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgGMolecular ProbesA31573, RRID:AB_25361831:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgGMolecular ProbesA21247, RRID:AB_1417781:2000
DAPI (for FACS)Thermo Fischer62247
DAPI (for immunohistochemistry)InvitrogenD3571, RRID:AB_23074451:10000
Goat anti-CAR4R&D SystemsAF2414, RRID:AB_20703321:50
Guinea pig anti-KRT13Acris AntibodiesBP5076, RRID:AB_9796081:250
Rabbit anti-GUSTDUCINSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-395, RRID:AB_6736781:250
Rabbit anti-NTPDASE2CHUQmN2-36LI6, RRID:AB_28004551:300
Rat anti-KRT8DSHBTROMA-IS, RRID: AB_5318261:100
Equipment
2D rockerBenchmark Scientific Inc.BR2000
3D RotatorLab-Line Instruments4630
Big-Digit Timer/StopwatchFisher ScientificS407992
CentrifugeEppendorf5415D
CO2 tankAirgasCD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 IncubatorThermo Scientific4110184 L, Polished Stainless Steel
IncucyteSartoriusModel: S3Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100Cytomation IncModel: S13211997 Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital ShakerNew Brunswick ScientificExcella E1
Real-Time PCR SystemApplied Biosystems4376600
Refrigerated CentrifugeEppendorf5417R
SpectrophotometerThermo ScientificND-1000
 StereomicroscopeZeissStemi SV6
Thermal CyclerBio-Rad580BR
VortexFisher Scientific12-812
Water bathPrecision51220073
Media
A83 01SigmaSML0788-5MGStock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B27 SupplementGibco17504044Stock concentration 50X, final concentration 1X
GentamicinGibco15750-060Stock concentration 1000X, final concentration 1X
GlutamaxGibco35050061Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPESGibco15630080Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGFPeprotech315-09-1MGStock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine NogginPeprotech250-38Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteineSigmaA9165Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
NicotinamideSigmaN0636-100gStock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/StrepGibco15140-122Stock concentration 100X, final concentration 1X
PrimocinInvivoGenant-pm-1Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190R&D Systems1264Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned mediaReceived from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ugAPExBIOA3008-10Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB SyringeBD Syringe309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%SigmaM3148-25MLβ-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge TubesUSA Scientific1420-2700
48-well platesThermo Scientific150687
5 3/4 inch Pasteur PipetsFisherbrand12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)Sigma Life ScienceA9647-100G
Buffer RLT Lysis bufferQIAGEN1015750
Cell Recovery SolutionCorning354253
Cohan-Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type ISigma Life ScienceC0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, PathclearR&D Systems3533-005-02Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)Sigma-Aldrich (Roche)4942078001
Disposable FiltersSysmex04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)Gibco10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ Sigma Life SciencesD8662-500ML
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)PromegaV4231
Elastase LyophilizedWorthington BiochemicalLS002292
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140-079
Fluoromount GSouthernBiotech0100-01
HEPES SolutionSigma Life ScienceH3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTAThermo Scientific25200-056
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1706691
Modeling Clay, GraySargent Art22-4084
NeedleBD Syringe305106
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
Normal Goat SerumJackson ImmunoResearch005-000-121
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PowerSYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
RNeasy Micro KitQIAGEN74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf022363204
Sodium ChlorideFisher Chemical7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrousFisher Chemical7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrousFisher Bioreagents7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Surgical Scissors - SharpFine Science Tools14002-14
Triton X-100Sigma Life ScienceT8787-100ML
VWR micro cover glassVWR4836606722x22mm

参考文献

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