성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양

요약

이 프로토콜은 성인 마우스의 후미 유두로부터 분리된 맛 줄기 세포로부터 추출한 언어 오르가노이드를 배양하고 가공하는 방법을 제시한다.

초록

맛의 감각은 빠르게 갱신 맛 수용체 세포 (TrC)로 구성된 혀의 미각에 의해 매개된다. 이 지속적인 회전율은 현지 선조 세포에 의해 구동되고 차례로 심각하게 삶의 질에 영향을 미치는 의료 치료의 무리에 의해 중단되기 쉬운 맛 기능을 렌더링합니다. 따라서 약물 치료의 맥락에서이 과정을 연구하는 것은 맛 선조 기능과 TRC 생산이 어떻게 영향을 받는지 이해하는 데 필수적입니다. 인간의 취향 조직의 윤리적 우려와 제한된 가용성을 감안할 때, 인간과 유사한 맛 시스템을 가진 마우스 모델은 일반적으로 사용됩니다. 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 높은 처리량 연구에 순종하지 않는 생체 내 방법과 비교하여 뮤린 언어 오르가노이드는 많은 복제및 적은 마우스로 실험을 신속하게 실행할 수 있습니다. 여기서, 이전에 발표된 프로토콜은 성인 마우스의 외면 유두(CVP)로부터 분리된 미각 전구 세포로부터 미각 오르가노이드를 생성하는 표준화된 방법이 제시되고 있다. CVP에서 미각 전구는 LGR5를 발현하고 LGR5^{EGFP-IRES-CreERT2} 항성을 운반하는 마우스로부터 EGFP 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 통해 분리될 수 있다. 선별된 세포는 매트릭스 젤 계 3D 배양 시스템에 도금되어 12일 동안 배양된다. 오르가노이드는 증식을 통해 배양 기간의 첫 6일 동안 확장한 다음 분화 단계에 들어가 비미미맛 상피 세포와 함께 세 가지 맛 세포 유형을 모두 생성합니다. 오르가노이드는 RNA 발현 및 면역 조직화학 분석을 위한 성장 과정에서 12일째 또는 언제든지 성숙시 수확될 수 있다. 성인 줄기 세포에서 언어 오르가노이드의 생산을위한 문화 방법을 표준화하면 맛 기능 장애를 경험하는 환자를 돕기 위해 싸움에서 강력한 약물 선별 도구로 재현성을 향상시키고 언어 오르가노이드를 발전시킬 것입니다.

서문

설치류에서, 언어 미각은 앞쪽으로 분포된 곰팡이 형태의 유두, 양측 단풍 유두 후방, 혀^1의후방 에 있는 단일 둘레 유두(CVP)에 보관된다. 각 미각은 50-100의 단명, 빠르게 갱신하는 미각 수용체 세포(TrC)로 구성되어 있으며, 여기에는 I형 I 신경교식 지지 세포, 달콤하고 쓴 맛, 감칠맛을 감지하는 II형 세포, 신맛을 감지하는 III 세포^{유형 2,3,4.} 마우스 CVP에서, 기저 라미나를 따라 LGR5⁺ 줄기 세포는 모든 TRC 유형뿐만 아니라 비맛 상피 세포를^생성5. 미각 계보를 갱신할 때, LGR5 딸 세포는 먼저 미토틱 미각 전구체 세포(type IV 세포)로 지정되어 미각을 입력하고 3가지 TRC 유형 중 하나로 분화할 수 있는^6. TrC의 급속한 회전율은 방사선 및 특정 약물치료^{7,8,9,10,11,12,13을}포함한 의료 치료에 의한 중단에 취약한 맛 시스템을 렌더링합니다. 따라서, 맛 줄기 세포 조절 및 TRC 분화의 맥락에서 맛 시스템을 연구하는 것은 맛 기능 장애를 완화하거나 방지하는 방법을 이해하는 데 필수적이다.

마우스는인간^{14, 15,16과}유사하게 조직된 맛 체계를 갖기 때문에 맛 과학에서 생체 내 연구를 위한 전통적인 모델이다. 그러나, 마우스는 높은 처리량 연구 결과, 유지 보수 비용이 많이 들고 작업하는 데 시간이 많이 걸리기 때문에 이상적이지 않습니다. 이를 극복하기 위해, 체외 오르간 배양 방법은 최근 몇 년 동안 개발되었다. 미각 오르가노이드는 네이티브 CVP 조직에서 생성될 수 있으며, 오가노이드가 분리된 마우스 CVP 상피 배양ex ex vivo^17로부터싹을 떼어낸 과정이다. 이 오르가노이드는 생체 내 맛 시스템과 일치하는 다층 상피를 표시합니다. ex vivo CVP 문화를 필요로하지 않는 오르가노이드를 생성하는 보다 효율적인 방법은 2014년^Renetal.에 의해 개발되었다. 장 가구를 성장시키기 위해 처음 개발된 적응 방법 및 배양 배지는 마우스 CVP에서 단일 Lgr5-GFP⁺ 전구 세포를 분리하고 매트릭스^{젤(19)에서}도금하였다. 이러한 단일 세포는 배양의 첫 6일 동안 증식하는 언어 오르가노이드를 생성하고, 8일째에 분화하기 시작하고, 배양 기간이 끝날 때까지 비미미피상피세포와 3가지 TRC 유형^18,20을모두 함유하고 있다. 현재까지, 언어 오르가노이드 모델 시스템을 활용한 다중 연구가^{17,18,20,21,22를}발표했다. 그러나 이러한 오르가노이드를 생성하는 데 사용되는 방법 및 문화 조건은 간행물마다 다릅니다(보충표 1). 따라서, 이러한 방법은 LGR5⁺ 성인 마우스 CVP의 선조로부터 유래된 언어 오르가노이드의 배양에 대한 상세한 표준화 된 프로토콜을 제시하기 위해 여기에 조정 및 최적화되었습니다.

언어 오르가노이드는 맛 세포 발달과 갱신을 주도하는 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 독특한 모델을 제공합니다. 언어 오르가노이드의 응용 프로그램이 확장되고 더 많은 실험실이 체외 오르간 형 모델을 활용하는 방향으로 이동함에 따라, 현장은 재현성을 향상시키기 위해 표준화 된 프로토콜을 개발하고 채택하기 위해 노력하는 것이 중요합니다. 맛 과학 내의 표준 도구로 언어 오르가노이드를 확립하면 단일 줄기 세포가 성인 맛 시스템의 분화 된 세포를 생성하는 방법을 따로 애타게하는 높은 처리량 연구를 가능하게합니다. 추가적으로, 언어 오르가노이드는 맛 항상성에 잠재적인 충격을 위해 약물을 신속하게 검사하기 위하여 이용될 수 있었습니다, 그 때 동물 모형에서 더 철저하게 조사될 수 있었습니다. 이 접근은 궁극적으로 미래 약 수령인을 위한 삶의 질을 향상시키는 치료를 고안하기 위하여 노력을 강화할 것입니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 AAALAC 공인 시설에서 수행되었으며, 콜로라도 안슈츠 의료 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 LGR5^{EGFP-IRES-CreERT2} 마우스는 잭슨 연구소, 주식 번호 008875.

참고 : 프로토콜의 원활하고 시기 적절한 진행을 보장하기 전에 다음 단계를 완료해야합니다 : 37 °C로 수조를 설정, 원심분리기를 4°C로 설정하고, 10 mg/mL 디스파스, 콜라게나아제 및 엘라스타제 스톡 솔루션(재료 표참조)에서 분사 및 해리 효소 용액을 만들고, 매트릭스 젤을 -20°C 냉동고에서 제거(~750 μL)에서 제거하고, 얼음에서 바이크에 의해 해동하여 적어도 3-4 h, 희석되지 않은 FBS의 프리 코트 마이크로 센심 분리기 튜브는 적어도 30 분 동안 실온에서 부드럽게 흔들어서 (조직 수집을위한 2 mL 튜브 2 개, 해리 된 세포를위한 2 개의 1.5 mL 튜브, 셀렉터에서 단일 세포를 수집하기위한 1.5 mL 튜브; 사용하기 전에 초과 FBS를 제거하십시오).

1. CVP 상형의 격리

참고: 전체 48웰 플레이트에 대해 충분한 LGR5⁺ 셀을 얻으려면 동일한 튜브에 3개의 Lgr5-EGFP CVP를 수집하고 동시에 처리합니다. 중요한 것은, 별도의 튜브에서 적어도 하나의 야생 형 쓰레기종의 CVP를 수확하고 처리하고 FACS 매개 변수를 설정하는 게이팅 컨트롤로 활용 (대표 결과참조).

1. IACUC 규정에 따라 CO₂ 질식으로 마우스를 안락사시키고, 양자 투석절제술, 자궁 경부 탈구, 참수 또는 황산과 같은 승인된 보조 방법을 따릅니다.
2. 큰 멸균 해부 가위를 사용하여 뺨을 자르고 턱을 부러뜨리세요. 혀를 들어 올리고 언어 프레이틀룸을 잘라 혀를 구강 바닥에서 분리합니다. 혀를 잘라 Ca^{2 +} Mg 2⁺멸균 얼음 차가운 덜벡코의 인산완충식 식염수 (dPBS)에서 수집합니다.
3. 면도날(도1A,파선 선)으로인터몰라 눈명성의 전방만 절단하여 전방 혀를 제거하고 버립니다. 섬세한 작업 닦아 서 두 어 후혀에서 머리카락과 여분의 액체를 제거 합니다.
4. 1 mL 주사기를 200-300 μL의 주사 효소 용액 (최종 농도: 2 mg / mL 유형-I 콜라게나아제 및 5 mg / mL Dispase II Ca^{2 +}/ Mg²⁺함유 dPBS, 10 mg/mL 스톡 용액으로부터 희석하고 CVP에 단면까지 인터몰러 저명(도1B,검은 화살)바로 위에 30 G x 1/2 바늘을 삽입합니다(도1B, 블랙 박스). 상피와 기본 조직 (라미나 프로프리아, 근육)사이 CVP의 아래와 측면 가장자리에 효소 용액을 주입하십시오. 주사가 수행됨에 따라 혀에서 주사를 천천히 지속적으로 철회하십시오.
5. 멸균 Ca²⁺/Mg 2⁺-무료 dPBS에서 혀를 33 분 동안 실온에서 배양하십시오.
6. 상피 양자간 에서 작은 상처를 만들고 여분의 미세 해부 가위를 사용하여 CVP에 단면만 하고, 미세 한 포셉으로 들어 올려 상피를 부드럽게 벗깁니다. 트렌치 상피가 기본 결합 조직이 없는 후 FBS로 미리 코팅된 빈 2mL 미세 원심 분리기 튜브에 놓습니다. CVP 상피(도1C,D)를분리하기 전이나 후에 상피 트리밍을 수행합니다.

2. CVP 상형절의 해리

참고: CVP 상피 및 도금의 해리는 도 2에서그래픽으로 표시됩니다.

1. 해리 효소 칵테일(최종 농도: 2 mg/mL 타입-I 콜라게나아제, 2 mg/mL 엘라스타제, 5 mg/mL 엘라스타제, 5 mg/mL Dispase II ca²⁺/Mg²⁺-함유 dPBS, 10 mg/mL 스톡 솔루션에서 희석) 껍질을 벗긴 CVP epithelia(CVP epithelia 당 20)를 포함하는 튜브에 추가하십시오. 37°C 수조에서 45분 동안 배양합니다. 15분마다 소용돌이가 잠깐.
   참고: 37°C 수조에서 0.25% 트라이핀-EDTA를 선도하여 효소 칵테일 인큐베이션을 마지막 15분 동안 섭취합니다.
2. 인큐베이션을 따라, 소용돌이 (3 펄스)는 1 분 동안 유리 파스퇴르 파이펫으로 세리라세이터. 조직 조각이 정착한 후, 분리된 세포의 첫 번째 수집을 포함하는 피펫을 새로운 FBS 코팅 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 결합형에 대응하는. 2.3 단계에서 설명된 바와 같이 나머지 조직 조각을 더 처리한다. 아래.
   1. 펠릿 세포에 370 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 상체를 회전합니다.
   2. 생성된 상체를 제거하고 형광 활성화 셀 정렬(FACS) 버퍼(1mM EDTA, 25mM HEPES(pH 7.0) 및 Ca²⁺/Mg²⁺-무료 PBS(CVP당 50μL)의 1% FBS에서 세포 펠릿을 재연한다. 얼음 위에 보관하십시오.
3. 2.2.1 단계 및 2.2.2 단계를 수행하는 동안, 사전 따뜻하게 0.25 % 트립신-EDTA (CVP 당 200 μL)를 원래 2 mL 마이크로 센트 심분리기 튜브에 추가하여 나머지 조직 조각을 2.2 단계에서 분리하고 30 분 동안 37 °C 수로 배양합니다. 10분마다 소용돌이가 잠깐.
4. 인큐베이션에 따라 조직 조각(3펄스)을 함유한 튜브를 소용돌이로 처리한 다음 유리 파스퇴르 파이펫으로 1분 동안 삼중화합니다. 조직 조각이 정착한 후, 2.2.2 단계에서 세포를 포함하는 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브로 피펫. 나머지 조직 조각을 포함하는 튜브를 폐기하십시오.
   1. 370 x g및 4°C에서 5분 동안 해리된 세포로 튜브를 스핀하여 펠릿 세포로 돌보세요.
   2. FACS 버퍼에서 상체를 제거하고 세포 펠릿을 다시 중단하십시오(CVP당 100 μL). 얼음 위에 보관하십시오.
5. 30 μm 나일론 메쉬 필터를 통과하고 FACS 전에 세포 혼합물에 DAPI(λ_방출 = 450 nm)를 추가합니다. 녹색 형광 단백질 채널을 사용하여 FACS를 통해 Lgr5-GFP⁺ 세포를 분리합니다 (λ_여기 = 488 nm; λ_방출 = 530 nm). 100 μm 노즐을 사용하여 Ca 2+ /Mg²⁺무료 dPBS의 300 μL을 포함하는 신선한 FBS 코팅 1.5 mL 마이크로 센세이스분리기^튜브로 세포를 정렬합니다. 도금 될 때까지 얼음에 세포를 놓습니다.

3. Lgr5-EGFP 세포의 도금

1. 유동 세포계로부터 수신된 LGR5⁺ 셀 서스펜션의 부피를 결정한다.
2. 선별기에서 얻은 셀 수에 따라 μL당 셀 수를 계산합니다. 그런 다음, 도금에 필요한 세포의 원하는 수를 결정하는 데 필요한 부피(우리는 48웰 플레이트의 우물당 200개의 세포를 사용) 및 중단된 세포의 총 부피를 새로운 미세원심분리기 튜브로 이송한다.
3. 370 x g및 4°C에서 5분 동안 튜브를 펠릿 세포로 회전시십시오(펠릿이 보이지 않을 수 있음). 상체를 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다.
4. 매트릭스 젤의 적절한 양으로 셀 펠릿을 부드럽게 재연 (48 웰 플레이트에 대한 우물 당 15 μL); 파이펫을 부드럽게 위아래로 사용하여 매트릭스 젤에 세포를 철저히 분배합니다. 각 웰의 중앙에 매트릭스 젤/셀 혼합물 15 μL을 놓습니다. 매트릭스 젤이 젤링되는 것을 방지하기 위해 도금 중에 50mL 원문 튜브에 미세 원심 분리기 튜브를 보관하십시오. 3개의 우물마다 위아래로 파이프를 사용하여 도금 전반에 걸쳐 매트릭스 젤/셀 혼합물을 계속 섞어 우물 전체에 걸쳐 세포의 균일한 분포를 보장합니다.
5. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO_2,~95% 습도)에 10분 간 배치하여 매트릭스 겔링을 허용합니다. 그런 다음 실온 WENRAS + Y27632 용지 300 μL을 각 웰에 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.

4. 오르가노이드 유지 보수

참고: 오르가노이드는 재조합 EGF및 Wnt3a, 노긴 및 R-spondin^23을포함하는 50% 조절된 매체를 포함하는 기존의 오르가노이드 미디어(WENR)에서 재배된다. 약물 A8301 및 SB202190은 성장을 최적화하기 위해 배양 기간의 첫 6일 동안 첨가(WENRAS 미디어)(그림 5),다음 분화(WENR media)^20을촉진하기 위해 제거된다. Y27632는 생존을 촉진하기 위해 문화의 첫 2 일 동안 추가됩니다. 문화 권면에 대한 미디어 조건은 그림 4에표시됩니다.

1. 도금 후 이틀 후, 1mL 파이펫을 사용하여 각 우물에서 WENRAS + Y27632 미디어를 제거하여 교차 오염을 보장합니다. 매트릭스 젤을 방해하지 않도록 웰의 측면에 WENRAS 미디어의 300 μL을 추가합니다. 접시를 인큐베이터에 반환합니다.
2. 문화 단계에 적합한 미디어를 사용하여 2일마다 미디어를변경합니다(그림 4). 오르가노이드가 수확 할 준비가된 12 일까지 오르가노이드를 유지하십시오.

5. RNA 처리

1. RNA를 위한 수확 오르가노이드
   1. 매트릭스 젤을 폴리머로 정합하기 위해 30 분 동안 얼음에 48 웰 플레이트를 놓습니다.
   2. 1mL 파이펫을 사용하여 오르가노이드 미디어를 당깁니다. 그런 다음, 미디어가 우물로 돌아오면 파이펫 끝을 사용하여 매트릭스 젤을 긁어 내고 더 분해하십시오. 내용물들을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 전송하여 3개의 우물의 내용기를 하나의 튜브에 모은다. 실온에서 300 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.
   3. 어떤 오르가노이드를 제거하지 않고 가능한 한 많은 미디어 상체를 제거; 그런 다음 실온에서 300 x g에서 5 분 동안 튜브를 다시 회전시하십시오.
   4. 나머지 매체를 제거하고 350 μL 리시스 버퍼 + β-mercaptoethanol (βME) (1mL 용해 완충제 당 10 μL βME)에서 오르가노이드를 재연한다. 즉각적인 RNA 추출을 위해 샘플을 얼음 에 놓거나 -80 °C에 보관하십시오.
2. 정량적 RT-PCR 분석
   1. 분광광계를 통해 RNA 양을 측정합니다. cDNA 합성 키트를 사용하여 RNA를 역전사한다.
   2. 200 nM 사전 검증 된 전방 및 역 프라이머(표 1)및 형광 PCR 마스터 믹스와 5 ng RNA에 상응하는 cDNA를 혼합합니다. qRT-PCR 반응을 40사이클에서 실행: 15s에 대한 95°C, 60°C는 60s에 대해 실행한다.

6. 면역 화학

1. 오간노이드 수확 및 고정
   1. 매트릭스 젤을 풀기 위해 30 분 동안 얼음에 48 웰 플레이트를 놓습니다.
   2. 오가노이드 미디어를 제거하고 각 우물에 400 μL의 얼음 차가운 PBS를 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 각 우물에 400 μL의 얼음 차가운 세포 회수 솔루션을 추가합니다. 4°C에서 30분간 부드럽게 흔들어 주세요.
   3. PBS에서 1mL 파이펫 팁을 1% BSA로 코팅하고, 웰의 내용물들을 부드럽게 피펫하여 매트릭스 젤을 분해합니다. 내장을 얼음 위에 놓인 1.5mL 마이크로센트심리분리기 튜브로 옮기.
   4. 각각 300 μL PBS + 1% BSA로 잘 헹구고 나머지 오르가노이드를 해당 튜브로 옮기습니다. 각 튜브에서 세포 회수 솔루션/PBS + BSA를 제거합니다. 400 μL의 얼음 차가운 PBS를 추가한 다음 또 다른 얼음 차가운 PBS 헹구기로 반복합니다.
   5. PBS를 제거하고 300 μL 얼음 감기 4 % PFA (0.1 M PB)로 20 분 동안 오르가노이드를 수정하여 실온에서 배양하십시오. PFA를 제거하고 400 μL 얼음 차가운 PBS로 오르가노이드를 헹구세요.
   6. PBS 제거; 그런 다음 400 μL PBS + 1 % BSA를 추가하십시오. 4 °C에 보관하십시오.
2. 면역형광 염색
   1. 500 μL PBS + 1 % BSA에서 내장 오르가노이드를 헹구십시오. 이어서, 블로킹 용액(일반 염소 또는 당나귀 세럼 5%, 소세럼 알부민 1%, 1x PBS pH 7.3에서 0.3% Triton X 100)에서 오르가노이드를 2시간 동안 실내 온도에서 부드럽게 흔들어 놓는다.
   2. 1 차적인 항체 용액 (차단 용액에서 희석 된 1 차 적인 항체)를 추가하고 4 ° C에서 3 박 동안 부드럽게 흔들어.
   3. 500 μL PBS + 0.2 % 트리톤으로 1 시간 동안 4 배 의 오르가노이드를 세척하여 실온에서 부드럽게 흔들십시오. 4°C에서 빛으로부터 보호되는 이차 항체 용액(차단 용액에서 희석된 이차 항체)과 암석 오르가노이드를 하룻밤 사이에 추가합니다.
   4. 500 μL PBS + 0.2 % 트리톤으로 1 시간 동안 3 배 의 오르가노이드를 세척하여 빛으로부터 보호하고 실온에서 부드럽게 흔들십시오. DAPI와 인큐베이션은 0.1 M PB에서 0.10,000을 20분 동안 희석하여 실온에서 흔들리고 덮습니다.
   5. 오가노이드를 0.1M PB로 20분 동안 3배 씻어 내고, 부드럽게 흔들리고 실온에서 덮습니다.
3. 반전 된 공초점 현미경 검사법을 위한 오르가노이드의 슬라이드 장착.
   참고: 슬라이드 장착 프로세스의 단계별 사진은 그림 7에표시됩니다.
   1. 현미경 슬라이드에 무독성 모델링 점토의 ~ 1mm 두께 22 x 22mm 정사각형 둘레를 만듭니다.
   2. 마이크로센티심분리기 튜브에서 0.1 M PB를 제거하고, 선택 된 100 μL 장착 매체에서 유기체를 부드럽게 재중단; 그런 다음 점토 광장의 중심으로 이동합니다.
   3. 마운팅 매체가 거의 맨 위에 오를 때까지 점토 사각형을 채웁니다. 그런 다음 22 x 22mm 정사각형 커버슬립을 점토 위에 놓고 커버슬립의 측면에 단단히 눌러 밀봉합니다. 제조업체의 지침에 따라 치료하여 (여기, 1-2 일 동안 실온) 4 °C에 보관하십시오.

결과

마우스는 1개의 CVP를 가지고 있으며, 혀에 후방으로 위치하며, LGR5⁺ 줄기 세포는 분리될 수 있다(도1A,블랙박스). CVP(도1B)전후의 효소 용액을 주입하면 결합 조직의 상피 및 소화가 약간 부어 오게 됩니다. 충분한 소화는 33 분 배양 후 달성되며, 이는 기본 조직에서 CVP 상피의 쉽게 분리 할 수 있습니다. CVP 상피를 벗기려고 할 때, 트?...

토론

여기에 보고된 효율적이고 쉽게 반복가능한 방법으로 성인 마우스 맛 줄기 세포에서 유래한 언어 오르가노이드를 배양, 유지 및 가공할 수 있다. EGFP마우스는 8~20주 된 Lgr5-EGFP 마우스3개의 CVP를 사용하여 실험용으로 ~10,000GFP+ 세포를 얻기에 충분하여 48웰 플레이트당 200개의 세포밀도로 도금된 50개의 우물을 초래하는 것으로 나타났다. CVP 트렌치 에피테리아의 제거는 갓 만든 디스?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG	Molecular Probes	A11056, RRID: AB_142628	1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A11010, RRID:AB_2534077	1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG	Invitrogen	A11075, RRID:AB_2534119	1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A31573, RRID:AB_2536183	1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG	Molecular Probes	A21247, RRID:AB_141778	1:2000
DAPI (for FACS)	Thermo Fischer	62247
DAPI (for immunohistochemistry)	Invitrogen	D3571, RRID:AB_2307445	1:10000
Goat anti-CAR4	R&D Systems	AF2414, RRID:AB_2070332	1:50
Guinea pig anti-KRT13	Acris Antibodies	BP5076, RRID:AB_979608	1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-395, RRID:AB_673678	1:250
Rabbit anti-NTPDASE2	CHUQ	mN2-36LI6, RRID:AB_2800455	1:300
Rat anti-KRT8	DSHB	TROMA-IS, RRID: AB_531826	1:100
Equipment
2D rocker	Benchmark Scientific Inc.	BR2000
3D Rotator	Lab-Line Instruments	4630
Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	S407992
Centrifuge	Eppendorf	5415D
CO2 tank	Airgas	CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4110	184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte	Sartorius	Model: S3	Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100	Cytomation Inc	Model: S13211997	Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E1
Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5417R
Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Thermal Cycler	Bio-Rad	580BR
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Water bath	Precision	51220073
Media
A83 01	Sigma	SML0788-5MG	Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 Supplement	Gibco	17504044	Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin	Gibco	15750-060	Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax	Gibco	35050061	Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES	Gibco	15630080	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF	Peprotech	315-09-1MG	Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin	Peprotech	250-38	Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100g	Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190	R&D Systems	1264	Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media			Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug	APExBIO	A3008-10	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%	Sigma	M3148-25ML	β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1420-2700
48-well plates	Thermo Scientific	150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets	Fisherbrand	12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Life Science	A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer	QIAGEN	1015750
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I	Sigma Life Science	C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear	R&D Systems	3533-005-02	Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001
Disposable Filters	Sysmex	04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)	Gibco	10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)	Promega	V4231
Elastase Lyophilized	Worthington Biochemical	LS002292
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
HEPES Solution	Sigma Life Science	H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA	Thermo Scientific	25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1706691
Modeling Clay, Gray	Sargent Art	22-4084
Needle	BD Syringe	305106
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
RNeasy Micro Kit	QIAGEN	74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	022363204
Sodium Chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher Chemical	7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous	Fisher Bioreagents	7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Triton X-100	Sigma Life Science	T8787-100ML
VWR micro cover glass	VWR	48366067	22x22mm