JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol, yetişkin farelerin arka tat papillasından izole edilmiş tat kök hücrelerinden elde edilen dil organoidlerini kültleme ve işleme için bir yöntem sunar.

Özet

Tat alma duyusu, hızla yenilenen tat reseptör hücrelerinden (WC' ler) oluşan dildeki tat tomurcukları ile aracılık eder. Bu sürekli ciro, yerel ata hücreleri tarafından desteklenmektedir ve tat fonksiyonunu çok sayıda tıbbi tedavi ile bozulmaya eğilimli hale getirir ve bu da yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler. Bu nedenle, bu sürecin ilaç tedavisi bağlamında incelenmesi, tat progenitör fonksiyonunun ve TRC üretiminin etkilenip etkilenmediğini ve nasıl etkilendiğini anlamak için hayati öneme sahiptir. Etik kaygılar ve insan tat dokusunun sınırlı kullanılabilirliği göz önüne alındığında, insanlara benzer bir tat sistemine sahip fare modelleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Zaman alıcı, pahalı ve yüksek verim çalışmalarına uygun olmayan in vivo yöntemlerle karşılaştırıldığında, murine lingual organoidler deneylerin birçok çoğaltma ve daha az fare ile hızlı bir şekilde çalıştırılmasını sağlayabilir. Burada, daha önce yayınlanan protokoller uyarlanmıştır ve yetişkin farelerin sirkülatör papillasından (CVP) izole edilmiş tat progenitör hücrelerinden tat organoidleri üretmek için standartlaştırılmış bir yöntem sunulmuştur. CVP ekspres LGR5'teki progenitör hücreleri tadın ve LGR5EGFP-IRES-CreERT2 alel taşıyan farelerden EGFP floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) ile izole edilebilir. Sıralanmış hücreler matris jel tabanlı bir 3D kültür sistemi üzerine kaplanır ve 12 gün boyunca kültürlenir. Organoidler kültür döneminin ilk 6 günü çoğalma yoluyla genişler ve daha sonra tatsız epitel hücreleri ile birlikte üç tat hücresi tipini de ürettikleri bir farklılaşma evresi girerler. Organoidler, RNA ekspresyasyonu ve immünohistokimyasal analiz için büyüme sürecinde 12. Yetişkin kök hücrelerden lingual organoid üretimi için kültür yöntemlerinin standartlaştırılması, tekrarlanabilirliği artıracak ve dilsel organoidleri tat işlev bozukluğu yaşayan hastalara yardımcı olmak için mücadelede güçlü bir ilaç tarama aracı olarak ilerletecektir.

Giriş

Kemirgenlerde, dil tat tomurcukları, ön, bilateral tay papilla posteriorly dağıtılan mantar biçimi papillaların yanı sıra dilin posterodorsal orta hattında tek bir circumvallate papilla (CVP) ile barındırılır1. Her tat tostu, tip I glial benzeri destek hücreleri, tatlı, acı ve umamiyi algılayan tip II hücreleri ve ekşi2, 3,4'üalgılayan tip III hücrelerini içeren 50-100 kısa ömürlü, hızla yenilenen tat reseptör hücrelerinden (WC) oluşur. Fare CVP'sinde, BAZAL lamina boyunca LGR5+ kök hücreler tüm TRC tiplerini ve tatsız epitel hücrelerini üretir5. Tat soyunun yenilenmesinde, LGR5 kız hücreleri ilk olarak bir tat tokasına giren ve üç TRC tip6'danherhangi birine farklılaşabilen mitotik tat öncül hücreleri (tip IV hücreleri) olarak belirtilir. TRC'lerin hızlı cirosu, radyasyon ve bazı ilaç tedavileri 7 , 8 , 9 , 10,11,12,13dahil olmak üzere tıbbi tedavilerle tat sistemini bozulmaya açık hale getirir. Bu nedenle, tat kök hücre regülasyonu ve TRC farklılaşması bağlamında tat sistemini incelemek, tat disfonksiyonunun nasıl azaltılacağını veya önlenebileceğini anlamak için hayati öneme sahiptir.

Fareler, insanlara benzer şekilde düzenlenmiş bir tat sistemine sahip oldukları için tat biliminde in vivo çalışmalar için geleneksel bir modeldir14,15,16. Bununla birlikte, fareler yüksek verim çalışmaları için ideal değildir, çünkü bakımı pahalıdır ve çalışmak için zaman alıcıdır. Bunun üstesinden gelmek için son yıllarda in vitro organoid kültürü yöntemleri geliştirilmiştir. Tat organoidleri, organoidlerin izole fare CVP epitel kültürlü ex vivo17'dentomurcukladığı bir işlem olan yerel CVP dokusundan üretilebilir. Bu organoidler in vivo tat sistemi ile uyumlu çok katmanlı bir epitel gösterir. Ex vivo CVP kültürü gerektirmeyen organoidleri üretmenin daha verimli bir yolu Ren veark. İlk olarak bağırsak organoidlerini büyütmek için geliştirilen yöntemleri ve kültür medyasını uyarlayarak, fare CVP'sinden tek lgr5-GFP+ progenitör hücreleri izole ettiler ve matris jel19ile kapladılar. Bu tek hücreler, kültürün ilk 6 günü boyunca çoğalan,8. Bugüne kadar lingual organoid model sistemini kullanan birden fazla çalışma yayınlanmıştır17,18,20,21,22; ancak, bu organoidleri oluşturmak için kullanılan yöntemler ve kültür koşulları yayınlar arasında farklılık gösterir (Tamamlayıcı Tablo 1). Bu nedenle, bu yöntemler, yetişkin fare CVP'nin LGR5+ atalarından türetilen lingual organoidlerin kültürü için ayrıntılı bir standartlaştırılmış protokol sunmak için burada ayarlanmış ve optimize edilmiştir.

Lingual organoidler, tat hücresi gelişimini ve yenilenmesini sağlayan hücre biyolojik süreçlerini incelemek için benzersiz bir model sağlar. Lingual organoidlerin uygulamaları genişledikçe ve daha fazla laboratuvar in vitro organoid modellerini kullanmaya doğru ilerledikçe, alanın tekrarlanabilirliği artırmak için standartlaştırılmış protokoller geliştirmeye ve benimsemeye çaba göstermesi önemlidir. Dil organoidlerinin tat bilimi içinde standart bir araç olarak kurulması, tek kök hücrelerin yetişkin tat sisteminin farklılaştırılmış hücrelerini nasıl ürettiğini birbirinden ayıran yüksek verim çalışmalarına olanak sağlayacaktır. Ek olarak, lingual organoidler, tat homeostazı üzerindeki potansiyel etkiler için ilaçları hızlı bir şekilde taramak için kullanılabilir ve daha sonra hayvan modellerinde daha ayrıntılı olarak araştırılabilir. Bu yaklaşım nihayetinde gelecekteki ilaç alıcıları için yaşam kalitesini artıran tedaviler tasarlama çabalarını artıracaktır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi, Hayvan Refahı Yasası ve Halk Sağlığı Hizmet Politikasına uygun olarak AAALAC onaylı bir tesiste gerçekleştirildi ve Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan LGR5EGFP-IRES-CreERT2 fareleri Jackson Laboratuvarı, Stok No. 008875'dandır.

NOT: Protokolün sorunsuz ve zamanında ilerlemesini sağlamak için aşağıdaki adımlar başlamadan önce tamamlanmalıdır: su banyounu 37 °C'ye ayarlayın, santrifüjü 4 °C'ye ayarlayın, 10 mg/mL Dispase, Collagenase ve Elastase stok çözeltilerinden enjeksiyon ve ayrışma enzimi çözümleri yapın (bkz. Malzeme Tablosu),matris jelini -20 °C dondurucudan çıkarın (~48 kuyu plakası için gerekli 750 μL) ve şişeyi buzun içine batırarak çözün en az 3-4 saat, sulandırılmamış FBS'deki ön kat mikrosantrifüj tüpleri, oda sıcaklığında en az 30 dakika hafifçe sallanarak (doku toplama için iki 2 mL tüp, ayrışmış hücreler için iki 1,5 mL tüp ve hücre sıralayıcısından tek hücre toplanması için bir 1,5 mL tüp; kullanmadan önce fazla FBS'yi çıkarın).

1. CVP epitelinin izolasyonu

NOT: Tam 48 kuyu plakası için yeterli LGR5+ hücresi elde etmek için, aynı tüpte üç Adet Lgr5-EGFP CVP toplayın ve aynı anda işleyin. Daha da önemlisi, en az bir vahşi tip çöp arkadaşının CVP'sini ayrı bir tüpte paralel olarak hasat edin ve işleyin ve FACS parametrelerini ayarlamak için bir gating kontrolü olarak kullanın (bkz. Temsili Sonuçlar).

  1. Fareleri IACUC yönetmeliklerine göre CO2 boğulması ile ötenazi yapın, ardından bilateral torakotomi, servikal çıkık, kafa kesme veya exsanguination gibi onaylanmış ikincil bir yöntem.
  2. Yanakları kesmek ve çeneyi kırmak için büyük steril diseksiyon makası kullanın. Dili kaldırın ve dili ağız boşluğunun zemininden ayırmak için dil frenulumunun kesilmesini kesin. Dili kesin ve steril buz gibi Dulbecco'nun Fosfat tamponlu salininde (dPBS) Ca2+ ve Mg2+ile toplayın.
  3. Intermolar seçkinliğin sadece ön kısmını jiletle keserek ön dili çıkarın ve atın (Şekil 1A, kesik çizgi). Arka dilden herhangi bir saç ve fazla sıvı çıkarmak için hassas bir görev mendili kullanın.
  4. 1 mL şırıngayı 200-300 μL enjeksiyon enzim çözeltisi ile doldurun (son konsantrasyon: 2 mg/mL tip-I Collagenase ve 5 mg/mL Dispase II içinde Ca2+/Mg2+içeren dPBS, 10 mg/mL stok çözeltisinden seyreltilmiştir) ve cvp'ye sadece ön gelene kadar intermolar eminence'ın hemen üzerine 30 G x1/2iğne yerleştirin (Şekil 1B,siyah ok), kara kutu). Enzim çözeltisini cvp'nin altına ve yan kenarlarına epitel ve alttaki dokular (lamina propria, kas) arasına enjekte edin. Enjeksiyon yapılırken şırınnayı dilden yavaşça ve sürekli olarak çekin.
  5. Dili steril Ca2+/ Mg2 +- oda sıcaklığında tam olarak 33 dakika boyunca serbest dPBS'de kuluçkaya yatırın.
  6. Ekstra ince diseksiyon makası kullanarak epitelde iki taraflı ve CVP'ye sadece ön olarak küçük kesikler yapın ve epitelleri ince epuslarla kaldırarak hafifçe soyun. Hendek epitel alttaki bağ dokusundan arındırıldıktan sonra, FBS ile önceden kaplanmış boş bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. CVP epitelini ayırmadan önce veya sonra epitel kırpmayı yapın (Şekil 1C, D).

2. CVP epitelinin ayrışması

NOT: CVP epitel ve kaplamasının ayrışması Şekil 2'degrafiksel olarak temsil edilmektedir.

  1. Soyulmuş CVP epitel içeren tüplere (son konsantrasyon: 2 mg/mL tip-I Collagenase, 2 mg/mL Elastase ve Ca2+/Mg2+-içeren dPBS içeren dPBS'de 5 mg/mL Dispaz II) soyulmuş CVP epitel içeren tüplere (son konsantrasyon: 2 mg/mL tip-IL Elastaz) ekleyin. 37 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika kuluçkaya yaslanın. Girdap kısaca her 15 dakikada bir.
    NOT: Enzim kokteyl inkübasyonunun son 15 dakikası boyunca 37 °C su banyosunda ön ısıtma% 0.25 Trypsin-EDTA.
  2. Kuluçkadan sonra, girdap (üç darbe) daha sonra 1 dakika boyunca bir cam Pasteur pipet ile üçe üçe üçlenir. Doku parçaları yerleştikten sonra, ayrışmış hücrelerin ilk koleksiyonunu içeren süpernatantı, genotipe karşılık gelen yeni FBS kaplı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Kalan doku parçalarını adım 2.3'te açıklandığı gibi daha fazla işleyin. aşağıda.
    1. Süpernatant'ı 370 x g'da 5 dakika ve pelet hücrelerine 4 °C'de döndürün.
    2. Ortaya çıkan süpernatantı çıkarın ve hücre peletini Floresan-Aktif Hücre Sıralama (FACS) Tamponunda (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) ve Ca2+/Mg 2+ -free PBS'de%1FBS (CVP başına 50 μL)) yeniden dürtme. Buzda sakla.
  3. 2.2.1 ve 2.2.2 adımlarını gerçekleştirirken, orijinal 2 mL mikrosantrifüj tüplerine önceden ısıtılmış %0.25 trypsin-EDTA (CVP başına 200 μL) ekleyerek kalan doku parçalarını adım 2.2'den ayırın ve 37 °C su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Girdap kısaca her 10 dakikada bir.
  4. Kuluçkadan sonra, doku parçaları (üç darbe) içeren tüpü girdaplayın, ardından 1 dakika boyunca bir cam Pasteur pipet ile üçe bölün. Doku parçaları yerleştikten sonra, süpernatantı adım 2.2.2'den hücreleri içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Kalan doku parçalarını içeren tüpleri atın.
    1. 370 x g'da 5 dakika ve pelet hücrelerine 4 °C'de ayrışmış hücrelere sahip tüpleri döndürün.
    2. FACS Buffer'daki (CVP başına 100 μL) süpernatant ve resuspend hücre peletlerini çıkarın. Buzda sakla.
  5. Hücreleri 30 μm naylon ağ filtresinden geçirin ve FACS'den önce hücre karışımlarına DAPI (emisyon= 450 nm) ekleyin. Yeşil floresan protein kanalını kullanarak LGR5-GFP+ hücrelerini FACS aracılığıyla izole edin (φekscitasyon = 488 nm; φemisyon = 530 nm). 100 μm nozul kullanarak hücreleri, 300 μL Ca 2+ /Mg 2 + serbest dPBS içeren taze bir FBS kaplı1,5mL mikrosantrifüj tüpüne ayırın. Hücreleri kaplayana kadar buza yerleştirin.

3. Lgr5-EGFP hücrelerinin kaplaması

  1. Akış sitometresinden alınan LGR5+ hücre süspansiyonunun hacmini belirleyin.
  2. Sıralayıcıdan elde edilen hücre sayısına bağlı olarak, μL başına hücre sayısını hesaplayın. Ardından, kaplama için istenen sayıda hücre elde etmek için gereken hacmi belirleyin (48 kuyu plakasının kuyusu başına 200 hücre kullanıyoruz) ve askıya alınan hücrelerin toplam hacmini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  3. Tüpü 370 x g'da 5 dakika ve pelet hücrelerine 4 °C'de döndürün (pelet görünmeyebilir). Üst saltantayı çıkarın ve tüpü buza yerleştirin.
  4. Hücre peletini uygun miktarda matris jelinde (48 kuyu plakası için kuyu başına 15 μL) hafifçe yeniden kullanın; hücreleri matris jelinde iyice dağıtmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet. Her kuyunun ortasına 15 μL matris jel/hücre karışımı yerleştirin. Matris jelinin jelleşmesini önlemek için kaplama sırasında mikrosantrifüj tüpünü 50 mL konik bir tüpte buz üzerinde tutun. Hücrelerin kuyular arasında eşit bir dağılımını sağlamak için her üç kuyuda yukarı ve aşağı pipetleme yaparak kaplama boyunca matris jel / hücre karışımını karıştırmaya devam edin.
  5. Matris jelleşmesini sağlamak için plakayı 10 dakika boyunca inkübatöre (%37 °C, %5 CO2, ~%95 nem) yerleştirin. Ardından, her kuyuya 300 μL oda sıcaklığı WENRAS + Y27632 ortam ekleyin ve plakayı inkübatöre geri verin.

4. Organoid bakımı

NOT: Organoidler, rekombinant EGF ve Wnt3a, Noggin ve R-spondin23içeren% 50 şartlandırılmış medyadan oluşan geleneksel organoid medyada (WENR) yetiştirilir. İlaçlar A8301 ve SB202190 büyümeyi optimize etmek için kültür döneminin ilk 6 günü için eklenir (WENRAS medya) (Şekil 5), daha sonra farklılaşmayı teşvik etmek için kaldırılır (WENR medya)20. Y27632, hayatta kalmayı teşvik etmek için kültürün ilk 2 günü için eklenir. Kültür zaman çizelgesine göre ortam koşulları Şekil 4'te sunulmuştur.

  1. Kaplamadan iki gün sonra, WENRAS + Y27632 ortamlarını 1 mL pipet kullanarak her kuyudan çıkarın ve çapraz kontaminasyon olmamasını sağlayın. Matris jelini bozmamak için kuyunun kenarına 300 μL WENRAS ortamı ekleyin. Plakayı inkübatöre geri verin.
  2. Kültür aşaması için uygun ortamı kullanarak medyayı her 2 günde bir değiştirin (Şekil 4). Organoidleri, organoidlerin hasat etmeye hazır olduğu 12 güne kadar koruyun.

5. RNA işleme

  1. RNA için organoidlerin toplanması
    1. Matris jelini depolimerize etmek için 30 dakika boyunca 48 kuyu plakasını buza yerleştirin.
    2. 1 mL pipet kullanarak organoid ortamı yukarı çekin; daha sonra, ortam kuyuya geri döndükçe, matris jelini çizmek ve daha fazla parçalamak için pipetin ucunu kullanın. İçeriği 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın, üç kuyunun içeriğini bir tüpte bire birin. Tüpleri oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika santrifüj edin.
    3. Herhangi bir organoid çıkarmadan mümkün olduğunca fazla medya süpernatantı çıkarın; ardından, oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika boyunca tüpleri tekrar aşağı çevirin.
    4. Kalan ortamı çıkarın ve organoidleri 350 μL lizis tamponu + β-mercaptoethanol (βME) (1 mL lizis tamponu başına 10 μL βME) içinde yeniden söyün. Numuneleri hemen RNA ekstraksiyonu için buza yerleştirin veya -80 °C'de saklayın.
  2. Nicel RT-PCR analizi
    1. Spektrofotometre ile RNA miktarını ölçün. CDNA Sentez Kiti kullanarak RNA'yı ters yazıya dök.
    2. 5 ng RNA'ya eşdeğer cDNA'yı 200 nM önceden doğrulanmış ileri ve ters astarlar (Tablo 1) ve floresan PCR Master Mix ile karıştırın. qRT-PCR reaksiyonlarını 40 döngü boyunca çalıştırın: 15 s için 95 °C, ardından 60 s için 60 °C.

6. İmmünohistokinoloji

  1. Organoidlerin toplanması ve sabitlenerek sabitlenerek
    1. Matris jelini gevşetmek için 30 dakika boyunca 48 kuyu plakası buzun üzerine yerleştirin.
    2. Organoid ortamı çıkarın ve her kuyuya 400 μL buz gibi PBS ekleyin. Ardından, PBS'yi çıkarın ve her kuyuya 400 μL buz gibi Hücre Kurtarma Çözümü ekleyin. 30 dakika boyunca 4 °C'de hafifçe sallayın.
    3. PBS'de % 1 BSA ile 1 mL pipet ucu kaplayın ve matris jelini parçalamak için kuyunun içeriğini hafifçe yukarı ve aşağı borulayın. Organoidleri buza yerleştirilen 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    4. Her kuyuyu 300 μL PBS + %1 BSA ile durulayın ve kalan organoidleri ilgili tüplere aktarın. Her tüpten Hücre Kurtarma Çözümü/PBS + BSA'yı çıkarın. 400 μL buz gibi PBS ekleyin, ardından başka bir buz gibi PBS durulama ile tekrarlayın.
    5. PBS'yi çıkarın ve organoidleri oda sıcaklığında inkübasyon yaparak 20 dakika boyunca 300 μL buz gibi% 4 PFA (0,1 M PB'de) ile sabitlayın. PFA'yı çıkarın ve organoidleri 400 μL buz gibi PBS ile durulayın.
    6. PBS'yi kaldırın; ardından, 400 μL PBS + % 1 BSA ekleyin. 4 °C'de saklayın.
  2. İmmünofluoresans boyama
    1. Organoidleri 500 μL PBS + % 1 BSA'da durulayın. Daha sonra, organoidleri blokaj çözeltisinde kuluçkaya yatırın (%5 normal keçi veya eşek serumu, %1 sığır serum albümini, %0,3 Triton X 100 in 1x PBS pH 7,3) 2 saat boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallayın.
    2. Birincil antikor çözeltisini (blokaj çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikorlar) ekleyin ve 4 °C'de 3 gece boyunca hafifçe sallayın.
    3. Organoidleri 500 μL PBS + % 0,2 Triton ile 1 saat boyunca 4x yıkayın, oda sıcaklığında hafifçe sallayın. İkincil antikor çözeltisi (blokaj çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorlar) ve kaya organoidlerini bir gecede 4 °C'de ışıktan korunarak ekleyin.
    4. Organoidleri 500 μL PBS + % 0,2 Triton ile 1 saat boyunca 3x yıkayın, ışıktan kornun ve oda sıcaklığında hafifçe sallayın. DAPI ile kuluçkaya yaslanın 1:10.000 0.1 M PB'de 20 dakika boyunca seyreltilir, sallanır ve oda sıcaklığında kaplanır.
    5. Organoidleri 0,1 M PB ile 20 dakika boyunca 3x yıkayın, hafifçe sallayın ve oda sıcaklığında örtün.
  3. Ters konfokal mikroskopi için organoidlerin slayt montajı.
    NOT: Slayt montaj işleminin adım adım resimleri Şekil 7'de gösterilmiştir.
    1. Mikroskop kaydırağı üzerinde toksik olmayan modelleme kilinin ~1 mm kalınlığında 22 x 22 mm karelik bir çevresi oluşturun.
    2. Mikrosantrifüj tüpünden 0,1 M PB çıkarın ve organoidleri 100 μL montaj ortamında hafifçe yeniden diriltin; daha sonra kil meydanının ortasına aktarın.
    3. Montaj ortamı neredeyse zirveye gelene kadar kil karesini doldurun. Ardından, kil üzerine 22 x 22 mm kare kapak kapağı yerleştirin ve kapatmak için kapak kılıfının kenarlarına sıkıca bastırın. Üreticinin talimatlarına göre kürlesin (burada, 1-2 gün oda sıcaklığında) ve 4 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Fareler, LGR5+ kök hücrelerin izole edilebileceği dil üzerinde arka tarafta bulunan bir CVP'ye sahiptir (Şekil 1A, kara kutu). CVP altında ve çevresinde bir enzim çözeltisinin enjeksiyonu (Şekil 1B) epitelin hafif şişmesine ve bağ dokusunun sindirimine neden olur. CVP epitelinin alttaki dokudan kolayca ayrılmasını sağlayan 33 dakikalık bir inkübasyonun ardından yeterli sindirim elde edilir. CVP epitelini soymaya ç...

Tartışmalar

Burada bildirilen, yetişkin fare tadı kök hücrelerinden elde edilen lingual organoidleri kültleme, sürdürme ve işleme için etkili ve kolayca tekrarlanabilir bir yöntemdir. 8 ila 20 haftalık Lgr5-EGFP farelerinin üç CVP kullanmanın deneysel kullanım için ~ 10.000 GFP+ hücre elde etmek için yeterli olduğu ve 48 kuyu plakalarında kuyu başına 200 hücre yoğunluğunda 50 kuyu ile sonuçlandığını buldu. CVP hendek epitelinin çıkarılması, lingual epitelin taze yapılmış Dispa...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, WNR şartlı medya ve değerli tartışmalar sağladıkları için Dr. Peter Dempsey ve Monica Brown'a (Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü Organoid ve Doku Modelleme Paylaşılan Kaynağı) teşekkür eder. Ayrıca Colorado Üniversitesi Kanser Merkezi Hücre Teknolojileri ve Akış Sitometrisi Paylaşılan Kaynaklarına, özellikle Dmitry Baturin'e hücre sıralama uzmanlığı için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma şu şekilde finanse edildi: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 ve NIH/NCI R21 CA236480'den LAB'ye ve R21DC016131 ve R21DC016131-02S1'den DG'ye ve F32 DC015958'den EJG'ye.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgGMolecular ProbesA11056, RRID: AB_1426281:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgGMolecular ProbesA11010, RRID:AB_25340771:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgGInvitrogenA11075, RRID:AB_25341191:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgGMolecular ProbesA31573, RRID:AB_25361831:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgGMolecular ProbesA21247, RRID:AB_1417781:2000
DAPI (for FACS)Thermo Fischer62247
DAPI (for immunohistochemistry)InvitrogenD3571, RRID:AB_23074451:10000
Goat anti-CAR4R&D SystemsAF2414, RRID:AB_20703321:50
Guinea pig anti-KRT13Acris AntibodiesBP5076, RRID:AB_9796081:250
Rabbit anti-GUSTDUCINSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-395, RRID:AB_6736781:250
Rabbit anti-NTPDASE2CHUQmN2-36LI6, RRID:AB_28004551:300
Rat anti-KRT8DSHBTROMA-IS, RRID: AB_5318261:100
Equipment
2D rockerBenchmark Scientific Inc.BR2000
3D RotatorLab-Line Instruments4630
Big-Digit Timer/StopwatchFisher ScientificS407992
CentrifugeEppendorf5415D
CO2 tankAirgasCD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 IncubatorThermo Scientific4110184 L, Polished Stainless Steel
IncucyteSartoriusModel: S3Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100Cytomation IncModel: S13211997 Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital ShakerNew Brunswick ScientificExcella E1
Real-Time PCR SystemApplied Biosystems4376600
Refrigerated CentrifugeEppendorf5417R
SpectrophotometerThermo ScientificND-1000
 StereomicroscopeZeissStemi SV6
Thermal CyclerBio-Rad580BR
VortexFisher Scientific12-812
Water bathPrecision51220073
Media
A83 01SigmaSML0788-5MGStock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B27 SupplementGibco17504044Stock concentration 50X, final concentration 1X
GentamicinGibco15750-060Stock concentration 1000X, final concentration 1X
GlutamaxGibco35050061Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPESGibco15630080Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGFPeprotech315-09-1MGStock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine NogginPeprotech250-38Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteineSigmaA9165Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
NicotinamideSigmaN0636-100gStock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/StrepGibco15140-122Stock concentration 100X, final concentration 1X
PrimocinInvivoGenant-pm-1Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190R&D Systems1264Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned mediaReceived from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ugAPExBIOA3008-10Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB SyringeBD Syringe309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%SigmaM3148-25MLβ-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge TubesUSA Scientific1420-2700
48-well platesThermo Scientific150687
5 3/4 inch Pasteur PipetsFisherbrand12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)Sigma Life ScienceA9647-100G
Buffer RLT Lysis bufferQIAGEN1015750
Cell Recovery SolutionCorning354253
Cohan-Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type ISigma Life ScienceC0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, PathclearR&D Systems3533-005-02Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)Sigma-Aldrich (Roche)4942078001
Disposable FiltersSysmex04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)Gibco10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ Sigma Life SciencesD8662-500ML
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)PromegaV4231
Elastase LyophilizedWorthington BiochemicalLS002292
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140-079
Fluoromount GSouthernBiotech0100-01
HEPES SolutionSigma Life ScienceH3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTAThermo Scientific25200-056
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1706691
Modeling Clay, GraySargent Art22-4084
NeedleBD Syringe305106
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
Normal Goat SerumJackson ImmunoResearch005-000-121
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PowerSYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
RNeasy Micro KitQIAGEN74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf022363204
Sodium ChlorideFisher Chemical7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrousFisher Chemical7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrousFisher Bioreagents7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Surgical Scissors - SharpFine Science Tools14002-14
Triton X-100Sigma Life ScienceT8787-100ML
VWR micro cover glassVWR4836606722x22mm

Referanslar

  1. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
  2. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  3. Finger, T. E., Silver, W. L. . The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).
  4. Barlow, L. A., Klein, O. D. Developing and regenerating a sense of taste. Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).
  5. Yee, K. K., et al. Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue. Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).
  6. Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).
  7. Deshpande, T. S., et al. Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review. Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).
  8. Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review. Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).
  9. Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. Drug-induced taste disorders. Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).
  10. Kumari, A., et al. Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).
  11. Ermilov, A. N., et al. Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling. PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).
  12. Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice. Scientific Reports. 9, 17934 (2019).
  13. Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).
  14. Ohla, K., et al. Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals. Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).
  15. Chaudhari, N., Roper, S. D. The cell biology of taste. The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).
  16. Breslin, P. A., Spector, A. C. Mammalian taste perception. Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).
  17. Aihara, E., et al. Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid. Scientific Reports. 5, 17185 (2015).
  18. Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).
  20. Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7, 4004 (2017).
  21. Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids. Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).
  22. Lin, X., et al. R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).
  23. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  24. Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. . Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).
  25. Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
  26. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  28. Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).
  29. Ekert, J. E., et al. Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).
  30. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  31. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  32. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  33. Castillo-Azofeifa, D., et al. Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance. Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).
  34. Vintschgau, M. v., Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).
  35. Liu, H. X., et al. Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance. Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).
  36. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
  37. Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature. Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 170gustasyondilyeti kin k k h creleriin vitroLGR5FACSyenileme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır