Génération et culture d’organoïdes linguals dérivés de cellules souches du goût de souris adultes

Résumé

Le protocole présente une méthode de culture et de traitement des organoïdes linguaux dérivés de cellules souches gustatives isolées de la papille gustative postérieure de souris adultes.

Résumé

Le sens du goût est médié par les papilles gustatives sur la langue, qui sont composées de cellules réceptrices du goût (CRT) qui se renouvellent rapidement. Ce renouvellement continu est alimenté par des cellules progénigènes locales et rend la fonction gustative sujette à la perturbation par une multitude de traitements médicaux, ce qui à son tour affecte gravement la qualité de vie. Ainsi, l’étude de ce processus dans le contexte du traitement médicamenteux est essentielle pour comprendre si et comment la fonction progéniteur du goût et la production de CCR sont affectées. Compte tenu des préoccupations éthiques et de la disponibilité limitée des tissus du goût humain, les modèles murins, qui ont un système gustatif similaire à celui des humains, sont couramment utilisés. Par rapport aux méthodes in vivo, qui prennent beaucoup de temps, sont coûteuses et ne se prêtent pas à des études à haut débit, les organoïdes linguaux murins peuvent permettre d’exécuter rapidement des expériences avec de nombreux répliquants et moins de souris. Ici, des protocoles précédemment publiés ont été adaptés et une méthode standardisée pour générer des organoïdes du goût à partir de cellules progénitres du goût isolées de la papille circumvallate (CVP) de souris adultes est présentée. Les cellules progénitaires du CVP expriment LGR5 et peuvent être isolées via le tri cellulaire activé par fluorescence EGFP (FACS) de souris porteuses d’un allèle^{Lgr5 EGFP-IRES-CreERT2.} Les cellules triées sont plaquées sur un système de culture 3D à base de gel matriciel et cultivées pendant 12 jours. Les organoïdes se développent pendant les 6 premiers jours de la période de culture par prolifération, puis entrent dans une phase de différenciation, au cours de laquelle ils génèrent les trois types de cellules gustatives ainsi que des cellules épithéliales sans goût. Les organoïdes peuvent être prélevés à maturation au jour 12 ou à tout moment pendant le processus de croissance pour l’expression de l’ARN et l’analyse immunohistochimique. La normalisation des méthodes de culture pour la production d’organoïdes linguaux à partir de cellules souches adultes améliorera la reproductibilité et fera progresser les organoïdes linguaux en tant qu’outil puissant de dépistage des médicaments dans la lutte contre les patients souffrant de dysfonctionnement du goût.

Introduction

Chez les rongeurs, les papilles gustatives linguales sont logées dans des papilles fongiformes réparties antérieurement, des papilles foliées bilatérales postérieures, ainsi que dans une papille circumvallate unique (CVP) à la ligne médiane postodorale de la langue¹. Chaque papille gustative est composée de 50 à 100 cellules réceptrices du goût (CRT) à courte durée de vie et à renouvellement rapide, qui comprennent des cellules de soutien de type I gliales, des cellules de type II qui détectent les cellules douces, amères et umami, et des cellules de type III qui détectent les cellules^{acides 2,3,4.} Chez la souris CVP, les cellules souches LGR5⁺ le long de la lame basale produisent tous les types de TRC ainsi que des cellules épithéliales sans goût⁵. Lors du renouvellement de la lignée gustative, les cellules filles LGR5 sont d’abord spécifiées comme des cellules précurseurs du goût post-mitotique (cellules de type IV) qui pénètrent dans une papille gustative et sont capables de se différencier dans l’un des trois types de TRC⁶. Le renouvellement rapide des CT rend le système gustatif sensible à la perturbation par les traitements médicaux, y compris les radiations et certaines pharmacothérapies^{7,8,9,10,11,12,13}. Ainsi, l’étude du système gustatif dans le contexte de la régulation des cellules souches du goût et de la différenciation de la CVR est essentielle pour comprendre comment atténuer ou prévenir le dysfonctionnement du goût.

Les souris sont un modèle traditionnel pour les études in vivo en science du goût car elles ont un système gustatif organisé de la même manière que les humains^14,15,16. Cependant, les souris ne sont pas idéales pour les études à haut débit, car elles sont coûteuses à entretenir et prennent beaucoup de temps à travailler. Pour surmonter ce problème, des méthodes de culture organoïde in vitro ont été développées ces dernières années. Les organoïdes gustatifs peuvent être générés à partir de tissu CVP natif, un processus dans lequel les organoïdes bourgeonnent à partir de l’épithélium CVP isolé de souris cultivé ex vivo¹⁷. Ces organoïdes présentent un épithélium multicouche compatible avec le système gustatif in vivo. Un moyen plus efficace de générer des organoïdes qui ne nécessitent pas de culture ex vivo de CVP a été développé par Ren etal. en 2014¹⁸. Adaptant les méthodes et les milieux de culture d’abord développés pour développer des organoïdes intestinaux, ils ont isolé des cellules progéniatrices Lgr5-GFP⁺ uniques de souris CVP et les ont plaquées dans un gel matriciel¹⁹. Ces cellules uniques ont généré des organoïdes linguaux qui prolifèrent au cours des 6 premiers jours de culture, commencent à se différencier vers le jour 8 et, à la fin de la période de culture, contiennent des cellules épithéliales sans goût et les trois types de CCR^18,20. À ce jour, de multiples études utilisant le système de modèle organoïde lingual ont été publiées^{17,18,20,21,22}; toutefois, les méthodes et les conditions de culture utilisées pour générer ces organoïdes varient d’une publication à l’autre(tableau supplémentaire 1). Ainsi, ces méthodes ont été ajustées et optimisées ici pour présenter un protocole standardisé détaillé pour la culture d’organoïdes linguaux dérivés de LGR5⁺ progéniteurs de CVP de souris adultes.

Les organoïdes linguaux fournissent un modèle unique pour l’étude des processus biologiques cellulaires qui stimulent le développement et le renouvellement des cellules gustatives. Alors que les applications des organoïdes linguaux se développent et que de plus en plus de laboratoires s’orientent vers l’utilisation de modèles organoïdes in vitro, il est important que le domaine s’efforce de développer et d’adopter des protocoles standardisés pour améliorer la reproductibilité. L’établissement des organoïdes linguaux en tant qu’outil standard dans la science du goût permettrait des études à haut débit qui démêlent comment les cellules souches uniques génèrent les cellules différenciées du système gustatif adulte. De plus, des organoïdes linguaux pourraient être utilisés pour dépister rapidement les médicaments pour les impacts potentiels sur l’homéostasie du goût, qui pourraient ensuite être étudiés plus en profondeur dans des modèles animaux. En fin de compte, cette approche renforcera les efforts visant à concevoir des thérapies qui améliorent la qualité de vie des futurs receveurs de médicaments.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été effectuées dans un établissement accrédité par l’AAALAC conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, à la Loi sur le bien-être des animaux et à la Politique des services de santé publique, et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado. Les souris Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2} utilisées dans ce protocole proviennent du Jackson Laboratory, stock n° 008875.

REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées avant de commencer pour assurer une progression en douceur et en temps opportun du protocole: mettre le bain-marie à 37 ° C, régler la centrifugeuse à 4 ° C, faire des solutions enzymatiques d’injection et de dissociation à partir des solutions de 10 mg / mL Dispase, Collagénase et Elastase (voir tableau des matériaux),retirer le gel matriciel du congélateur à -20 ° C (~ 750 μL nécessaire pour une plaque de 48 puits) et décongeler en immergeant le flacon dans de la glace pour à au moins 3-4 h, tubes de microcentrifugation pré-enduits dans des FBS non dilués en se balançant doucement à température ambiante pendant au moins 30 min (deux tubes de 2 mL pour la collecte de tissus, deux tubes de 1,5 mL pour les cellules dissociées et un tube de 1,5 mL pour la collecte de cellules individuelles à partir du trieur de cellules; éliminer l’excès de FBS avant utilisation).

1. Isolement de l’épithélium CVP

REMARQUE: Pour obtenir suffisamment de cellules LGR5⁺ pour une plaque complète de 48 puits, collectez trois CVP Lgr5-EGFP dans le même tube et traitez simultanément. Il est important de récolter et de traiter le CVP d’au moins un compagnon de litière de type sauvage en parallèle dans un tube séparé et de l’utiliser comme contrôle de contrôle pour définir les paramètres FACS (voir Résultats représentatifs).

1. Euthanasier les souris avec une asphyxie au CO₂ conformément à la réglementation de l’IACUC, suivie d’une méthode secondaire approuvée telle que la thoracotomie bilatérale, la luxation cervicale, la décapitation ou l’exsanguination.
2. Utilisez de gros ciseaux de dissection stériles pour couper les joues et casser la mâchoire. Soulevez la langue et coupez le frein linguale pour séparer la langue du sol de la cavité buccale. Découpez la langue et recueillez-la dans la solution saline tamponnée au phosphate (dPBS) stérile et glacée de Dulbecco avec Du²⁺ et Mg^2+.
3. Retirez et jetez la langue antérieure en coupant juste avant l’éminence intermolaire avec une lame de rasoir(Figure 1A,ligne pointillée). Utilisez une lingette délicate pour enlever les poils et l’excès de liquide de la langue postérieure.
4. Remplir la seringue de 1 mL avec 200-300 μL de solution enzymatique injectable (concentration finale : 2 mg/mL de collagénase de type I et 5 mg/mL de Dispase II dans du dPBS contenant du Ca²⁺/Mg^2+,dilué à partir de solutions mères de 10 mg/mL) et insérer une aiguille de 30 G x 1/2 juste au-dessus de l’éminence intermolaire (Figure 1B, flèche noire) jusqu’à ce qu’elle soit juste avant le CVP ( Figure1B, boîte noire). Injecter la solution enzymatique sous et sur les bords latéraux du CVP entre l’épithélium et les tissus sous-jacents (lamina propria, muscle). Retirez la seringue lentement et continuellement de la langue pendant l’injection.
5. Incuber la langue dans du dPBS stérile sans Ca²⁺/ Mg²⁺à température ambiante pendant 33 min avec précision.
6. Faites de petites coupures dans l’épithélium bilatéralement et juste avant le CVP à l’aide de ciseaux à dissection extra fins, et pelez doucement l’épithélium en le soulevant avec une pince fine. Une fois que l’épithélium de tranchée est libre du tissu conjonctif sous-jacent, placez-le dans un tube de microcentrifugation vide de 2 mL pré-enduit de FBS. Effectuer la coupe épithéliale avant ou après le détachement de l’épithélium CVP (Figure 1C, D).

2. Dissociation de l’épithélium CVP

REMARQUE: La dissociation de l’épithélium CVP et le placage sont représentés graphiquement à la figure 2.

1. Ajouter le cocktail enzymatique de dissociation (concentration finale : 2 mg/mL de collagénase de type I, 2 mg/mL d’élastase et 5 mg/mL de Dispase II dans du dPBS contenant du Ca²⁺/Mg^2+,dilué à partir de solutions d’essai de 10 mg/mL) dans des tubes contenant de l’épithélium CVP pelé (200 μL par CVP). Incuber au bain-marie à 37 °C pendant 45 min. Vortex brièvement toutes les 15 minutes.
   REMARQUE: Pré-pré-pré-température 0,25% de trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 ° C pendant les 15 dernières minutes d’incubation du cocktail enzymatique.
2. Après incubation, vortex (trois impulsions) puis trituration avec une pipette Pasteur en verre pendant 1 min. Une fois les morceaux de tissus réglés, pipeter le surnageant contenant la première collection de cellules dissociées, dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL revêtus de FBS correspondant au génotype. Traiter les morceaux de tissu restants comme décrit à l’étape 2.3. sous.
   1. Faire tourner le surnageant pendant 5 min à 370 x g et 4 °C sur des cellules à granulés.
   2. Retirez le surnageant résultant et ressuspendez la pastille cellulaire dans un tampon facS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7,0) et 1 % FBS dans Ca²⁺/ Mg²⁺PBS libre (50 μL par CVP)). Conserver sur la glace.
3. Lors de l’exécution des étapes 2.2.1 et 2.2.2, dissocier les morceaux de tissu restants de l’étape 2.2 en ajoutant de la trypsine-EDTA préchauffée à 0,25 % (200 μL par CVP) aux tubes de microcentrifuge de 2 mL d’origine et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min. Vortex brièvement toutes les 10 minutes.
4. Après incubation, vortex le tube contenant des morceaux de tissu (trois impulsions) puis triturer avec une pipette Pasteur en verre pendant 1 min. Une fois les morceaux de tissus réglés, pipeter le surnageant dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL contenant les cellules de l’étape 2.2.2. Jetez les tubes contenant les morceaux de tissu restants.
   1. Faire tourner les tubes avec des cellules dissociées pendant 5 min à 370 x g et 4 °C en cellules à granulés.
   2. Retirez le surnageant et resuspendez les pastilles de cellules dans le tampon FACS (100 μL par CVP). Conserver sur la glace.
5. Faire passer les cellules à travers un filtre à mailles de nylon de 30 μm et ajouter du DAPI_(émission λ = 450 nm) aux mélanges cellulaires avant le FACS. Isoler les cellules Lgr5-GFP⁺ via FACS en utilisant le canal protéique fluorescent vert_(excitation λ = 488 nm;_émission λ = 530 nm). Trier les cellules à l’aide d’une buse de 100 μm dans un tube de microcentrifugationfrais de 1,5 mL revêtu de FBS contenant 300 μL de dPBS libre de Ca²⁺ / Mg 2 +. Placez les cellules sur de la glace jusqu’au placage.

3. Placage des cellules Lgr5-EGFP

1. Déterminer le volume de suspension cellulaire LGR5⁺ reçue du cytomètre en flux.
2. En fonction du nombre de cellules obtenues à partir du trieur, calculez le nombre de cellules par μL. Ensuite, déterminez le volume nécessaire pour obtenir le nombre souhaité de cellules pour le placage (nous utilisons 200 cellules par puits d’une plaque de 48 puits) et transférez ce volume total de cellules en suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation.
3. Faire tourner le tube pendant 5 min à 370 x g et 4 °C sur des cellules à granulés (les granulés peuvent ne pas être visibles). Retirez le surnageant et placez le tube sur de la glace.
4. Remettez doucement en place la pastille cellulaire dans la quantité appropriée de gel matriciel (15 μL par puits pour les plaques de 48 puits); pipettez doucement de haut en bas pour bien répartir les cellules dans un gel matriciel. Placer 15 μL de mélange de gel matriciel/cellule au centre de chaque puits. Gardez le tube de microcentrifugation sur la glace dans un tube conique de 50 mL pendant le placage pour empêcher le gel matriciel de geler. Continuer à mélanger le mélange de gel matriciel et de mélange cellulaire tout au long du placage en pipetant de haut en bas tous les trois puits pour assurer une répartition uniforme des cellules entre les puits.
5. Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C, 5% co_2,~95% d’humidité) pendant 10 min pour permettre la gélification du gel matriciel. Ensuite, ajoutez 300 μL de milieu WENRAS + Y27632 à température ambiante à chaque puits et retournez la plaque à l’incubateur.

4. Entretien organoïde

REMARQUE: Les organoïdes sont cultivés dans des milieux organoïdes conventionnels (WENR) comprenant de l’EGF recombinant et des milieux conditionnés à 50% contenant Wnt3a, Noggin et R-spondin²³. Les médicaments A8301 et SB202190 sont ajoutés pendant les 6 premiers jours de la période de culture pour optimiser la croissance (supports WENRAS)(Figure 5),puis retirés pour favoriser la différenciation (supports WENR)²⁰. Y27632 est ajouté pour les 2 premiers jours de culture afin de favoriser la survie. Les conditions des médias par rapport à la chronologie de la culture sont présentées à la figure 4.

1. Deux jours après le placage, retirer les milieux WENRAS + Y27632 de chaque puits à l’aide d’une pipette de 1 mL, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de contamination croisée. Ajouter 300 μL de milieu WENRAS sur le côté du puits pour ne pas perturber le gel matriciel. Re renvoyer la plaque à l’incubateur.
2. Changez le média tous les 2 jours, en utilisant le support approprié pour l’étape de culture (Figure 4). Conservez les organoïdes jusqu’au jour 12, lorsque les organoïdes sont prêts à être prélevés.

5. Traitement de l’ARN

1. Prélèvement d’organoïdes pour l’ARN
   1. Placer la plaque de 48 puits sur la glace pendant 30 min pour dépolymériser le gel matriciel.
   2. À l’aide d’une pipette de 1 mL, tirer le milieu organoïde vers le haut; puis, lorsque le média est renvoyé au puits, utilisez l’extrémité de la pipette pour rayer et briser davantage le gel matriciel. Transférer le contenu dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, en remettant en commun le contenu de trois puits dans un tube. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 300 x g à température ambiante.
   3. Enlever autant de surnageant de milieu que possible sans enlever d’organoïdes; puis, faites tourner à nouveau les tubes pendant 5 min à 300 x g à température ambiante.
   4. Retirer le milieu restant et ressuspender les organoïdes dans un tampon de lyse de 350 μL + β-mercaptoéthanol (βME) (10 μL βME par tampon de lyse de 1 mL). Placer les échantillons sur de la glace pour une extraction immédiate de l’ARN ou les conserver à -80 °C.
2. Analyse quantitative RT-PCR
   1. Mesurer la quantité d’ARN via un spectrophotomètre. Transcrire l’ARN à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc.
   2. Mélanger l’ADNc équivalent à 5 ng d’ARN avec 200 nM d’amorces avant et arrière pré-validées(Tableau 1)et un mélange maître de PCR fluorescent. Exécutez la réaction qRT-PCR pendant 40 cycles à : 95 °C pendant 15 s, puis 60 °C pendant 60 s.

6. Immunohistochimie

1. Prélèvement et fixation des organoïdes
   1. Placez la plaque de 48 puits sur la glace pendant 30 minutes pour desserrer le gel matriciel.
   2. Retirez le milieu organoïde et ajoutez 400 μL de PBS glacé à chaque puits. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 400 μL de solution de récupération cellulaire glacée à chaque puits. Basculez doucement à 4 °C pendant 30 min.
   3. Enduisez une pointe de pipet de 1 mL avec 1% de BSA dans du PBS, et pipetez doucement le contenu du puits de haut en bas pour briser le gel de matrice. Transférer les organoïdes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL placé sur de la glace.
   4. Rincez chaque puits avec 300 μL PBS + 1% BSA et transférez les organoïdes restants dans les tubes correspondants. Retirez la solution de récupération cellulaire / PBS + BSA de chaque tube. Ajouter 400 μL de PBS glacé, puis répéter avec un autre rinçage PBS glacé.
   5. Retirez le PBS et fixez les organoïdes avec 300 μL de PFA glacé à 4 % (dans 0,1 M PB) pendant 20 min, en incubant à température ambiante. Retirez le PFA et rincez les organoïdes avec du PBS glacé de 400 μL.
   6. Supprimer PBS; ensuite, ajoutez 400 μL PBS + 1% BSA. Conserver à 4 °C.
2. Coloration par immunofluorescence
   1. Rincer les organoïdes dans 500 μL PBS + 1% BSA. Ensuite, incuber les organoïdes dans une solution bloquante (5% de sérum normal de chèvre ou d’âne, 1% d’albumine sérique bovine, 0,3% de Triton X 100 dans 1x PBS pH 7,3) pendant 2 h, en se balançant doucement à température ambiante.
   2. Ajouter la solution d’anticorps primaires (anticorps primaires dilués dans une solution bloquante) et faire basculer doucement pendant 3 nuits à 4 °C.
   3. Laver les organoïdes 4x pendant 1 h avec 500 μL PBS + 0,2% Triton, en berçant doucement à température ambiante. Ajouter la solution d’anticorps secondaires (anticorps secondaires dilués dans une solution bloquante) et les organoïdes de roche pendant la nuit, à l’abri de la lumière, à 4 °C.
   4. Laver les organoïdes 3x pendant 1 h avec 500 μL PBS + 0,2% Triton, à l’abri de la lumière et en se balançant doucement à température ambiante. Incuber avec du DAPI dilué 1:10 000 dans 0,1 M PB pendant 20 min, berçant et recouvert à température ambiante.
   5. Laver les organoïdes 3x pendant 20 min avec 0,1 M PB, en les berçant doucement et en les recouvrant à température ambiante.
3. Montage sur glissière d’organoïdes pour la microscopie confocale inversée.
   REMARQUE : des images étape par étape du processus de montage des diapositives sont illustrées à la figure 7.
   1. Créez un périmètre carré d’environ 1 mm d’épaisseur 22 x 22 mm de pâte à modeler non toxique sur une lame de microscope.
   2. Retirer 0,1 M PB du tube de microcentrifugation et ressuspender doucement les organoïdes dans le milieu de montage de 100 μL de votre choix; puis, transfert au centre du carré d’argile.
   3. Remplissez le carré d’argile jusqu’à ce que le support de montage soit presque au sommet. Ensuite, placez un couvercle carré de 22 x 22 mm sur de l’argile et appuyez fermement sur les côtés du couvercle pour sceller. Laissez-le durcir selon les instructions du fabricant (ici, température ambiante pendant 1-2 jours) et conserver à 4 ° C.

Résultats

Les souris ont un CVP, situé postérieurement sur la langue, à partir duquel les cellules souches LGR5⁺ peuvent être isolées (Figure 1A, boîte noire). L’injection d’une solution enzymatique sous et autour du CVP(Figure 1B)entraîne un léger gonflement de l’épithélium et la digestion du tissu conjonctif. Une digestion suffisante est obtenue après une incubation de 33 minutes, ce qui permet de séparer facilement l’épi...

Discussion

Il est rapporté ici une méthode efficace et facilement reproductible pour la culture, le maintien et le traitement des organoïdes linguaux dérivés de cellules souches de goût de souris adultes. Il a été constaté que l’utilisation de trois CV de souris Lgr5-EGFP âgées de 8 à 20 semaines est suffisante pour obtenir environ 10 000 cellules GFP⁺ à usage expérimental, ce qui donne 50 puits plaqués à une densité de 200 cellules par puits dans des plaques de 48 puits. L’élimination de l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG	Molecular Probes	A11056, RRID: AB_142628	1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A11010, RRID:AB_2534077	1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG	Invitrogen	A11075, RRID:AB_2534119	1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A31573, RRID:AB_2536183	1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG	Molecular Probes	A21247, RRID:AB_141778	1:2000
DAPI (for FACS)	Thermo Fischer	62247
DAPI (for immunohistochemistry)	Invitrogen	D3571, RRID:AB_2307445	1:10000
Goat anti-CAR4	R&D Systems	AF2414, RRID:AB_2070332	1:50
Guinea pig anti-KRT13	Acris Antibodies	BP5076, RRID:AB_979608	1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-395, RRID:AB_673678	1:250
Rabbit anti-NTPDASE2	CHUQ	mN2-36LI6, RRID:AB_2800455	1:300
Rat anti-KRT8	DSHB	TROMA-IS, RRID: AB_531826	1:100
Equipment
2D rocker	Benchmark Scientific Inc.	BR2000
3D Rotator	Lab-Line Instruments	4630
Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	S407992
Centrifuge	Eppendorf	5415D
CO2 tank	Airgas	CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4110	184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte	Sartorius	Model: S3	Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100	Cytomation Inc	Model: S13211997	Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E1
Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5417R
Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Thermal Cycler	Bio-Rad	580BR
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Water bath	Precision	51220073
Media
A83 01	Sigma	SML0788-5MG	Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 Supplement	Gibco	17504044	Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin	Gibco	15750-060	Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax	Gibco	35050061	Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES	Gibco	15630080	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF	Peprotech	315-09-1MG	Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin	Peprotech	250-38	Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100g	Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190	R&D Systems	1264	Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media			Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug	APExBIO	A3008-10	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%	Sigma	M3148-25ML	β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1420-2700
48-well plates	Thermo Scientific	150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets	Fisherbrand	12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Life Science	A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer	QIAGEN	1015750
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I	Sigma Life Science	C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear	R&D Systems	3533-005-02	Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001
Disposable Filters	Sysmex	04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)	Gibco	10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)	Promega	V4231
Elastase Lyophilized	Worthington Biochemical	LS002292
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
HEPES Solution	Sigma Life Science	H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA	Thermo Scientific	25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1706691
Modeling Clay, Gray	Sargent Art	22-4084
Needle	BD Syringe	305106
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
RNeasy Micro Kit	QIAGEN	74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	022363204
Sodium Chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher Chemical	7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous	Fisher Bioreagents	7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Triton X-100	Sigma Life Science	T8787-100ML
VWR micro cover glass	VWR	48366067	22x22mm