Generazione e coltura di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto del topo adulto

Riepilogo

Il protocollo presenta un metodo per la coltivazione e l'elaborazione di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto isolate dalla papilla del gusto posteriore di topi adulti.

Abstract

Il senso del gusto è mediato dalle papille gustative sulla lingua, che sono composte da cellule recettrici del gusto (TRC) che si rinnovano rapidamente. Questo continuo turnover è alimentato da cellule progenitrici locali e rende la funzione del gusto soggetta a interruzioni da parte di una moltitudine di trattamenti medici, che a loro volta hanno un grave impatto sulla qualità della vita. Pertanto, studiare questo processo nel contesto del trattamento farmacologico è vitale per capire se e come la funzione progenitrice del gusto e la produzione di TRC sono influenzate. Date le preoccupazioni etiche e la limitata disponibilità di tessuto gustatico umano, i modelli murini, che hanno un sistema di gusto simile agli esseri umani, sono comunemente usati. Rispetto ai metodi in vivo, che richiedono molto tempo, sono costosi e non suscettibili di studi ad alto rendimento, gli organoidi linguali murini possono consentire di eseguire rapidamente esperimenti con molte repliche e meno topi. Qui, i protocolli precedentemente pubblicati sono stati adattati e viene presentato un metodo standardizzato per generare organoidi del gusto da cellule progenitrici del gusto isolate dalla papilla circumvallata (CVP) di topi adulti. Le cellule progenitrici del gusto nel CVP esprimono LGR5 e possono essere isolate tramite lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza EGFP (FACS) da topi portatori di un allele Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2.} Le cellule ordinate vengono placcate su un sistema di coltura 3D a base di gel a matrice e coltivate per 12 giorni. Gli organoidi si espandono per i primi 6 giorni del periodo di coltura attraverso la proliferazione e poi entrano in una fase di differenziazione, durante la quale generano tutti e tre i tipi di cellule del gusto insieme alle cellule epiteliali non gustative. Gli organoidi possono essere raccolti al momento della maturazione al giorno 12 o in qualsiasi momento durante il processo di crescita per l'espressione dell'RNA e l'analisi immunoistochimica. Standardizzare i metodi di coltura per la produzione di organoidi linguali da cellule staminali adulte migliorerà la riproducibilità e farà progredire gli organoidi linguali come un potente strumento di screening farmacologico nella lotta per aiutare i pazienti che soffrono di disfunzione del gusto.

Introduzione

Nei roditori, le papille gustative linguali sono alloggiate in papille fungiformi distribuite anteriormente, papille fogliate bilaterali posteriormente, nonché una singola papilla circumvallata (CVP) sulla linea mediana posterodorsale della lingua¹. Ogni papille gustatica è composta da 50-100 cellule recettrici del gusto (TRC) di breve durata e in rapido rinnovamento, che includono cellule di supporto gliali di tipo I, cellule di tipo II che rilevano dolci, amare e umami e cellule di tipo III che rilevano acido^2,3,4. Nel topo CVP, le cellule staminali LGR5⁺ lungo la lamina basale producono tutti i tipi di TRC e le cellule epiteliali non gustative⁵. Quando si rinnova il lignaggio del gusto, le cellule figlie LGR5 vengono prima specificate come cellule precursori del gusto post-mitotico (cellule di tipo IV) che entrano in una papille gustatica e sono in grado di differenziarsi in uno qualsiasi dei tre tipi TRC⁶. Il rapido turnover dei TRC rende il sistema gustatico suscettibile di perturbazioni da parte di trattamenti medici, tra cui radiazioni e alcune terapie farmacologiche^{7,8,9,10,11,12,13.} Pertanto, studiare il sistema del gusto nel contesto della regolazione delle cellule staminali del gusto e della differenziazione TRC è vitale per capire come mitigare o prevenire la disfunzione del gusto.

I topi sono un modello tradizionale per studi in vivo nella scienza del gusto poiché hanno un sistema del gusto organizzato in modo simile agli esseri umani^14,15,16. Tuttavia, i topi non sono ideali per studi ad alto rendimento, in quanto sono costosi da mantenere e richiedono molto tempo per lavorare. Per ovviare a questo, negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi di coltura organoide in vitro. Gli organoidi gustazionali possono essere generati dal tessuto CVP nativo, un processo in cui gli organoidi germogliano dall'epitelio CVP di topo isolato coltivato ex vivo¹⁷. Questi organoidi mostrano un epitelio multistrato coerente con il sistema di gusto in vivo. Un modo più efficiente per generare organoidi che non richiedono la coltura CVP ex vivo è stato sviluppato da Ren et al. nel 2014¹⁸. Adattando metodi e mezzi di coltura sviluppati per la prima volta per far crescere organoidi intestinali, hanno isolato singole cellule progenitrici Lgr5-GFP⁺ da CVP di topo e le hanno placcate in gel di matrice¹⁹. Queste singole cellule hanno generato organoidi linguali che proliferano durante i primi 6 giorni di coltura, iniziano a differenziarsi intorno al giorno 8 e alla fine del periodo di coltura contengono cellule epiteliali non gustative e tutti e tre i tipi di TRC^18,20. Ad oggi, sono stati pubblicati diversi studi che utilizzano il sistema di modelli organoidi linguali^{17,18,20,21,22;} tuttavia, i metodi e le condizioni di coltura utilizzati per generare questi organoidi variano da una pubblicazione all'altra (Tabella supplementare 1). Pertanto, questi metodi sono stati adattati e ottimizzati qui per presentare un protocollo standardizzato dettagliato per la coltura di organoidi linguali derivati da LGR5⁺ progenitori di CVP di topo adulto.

Gli organoidi linguali forniscono un modello unico per lo studio dei processi biologici cellulari che guidano lo sviluppo e il rinnovamento delle cellule del gusto. Man mano che le applicazioni degli organoidi linguali si espandono e sempre più laboratori si spostano verso l'utilizzo di modelli organoidi in vitro, è importante che il campo si sforzi di sviluppare e adottare protocolli standardizzati per migliorare la riproducibilità. Stabilire gli organoidi linguali come strumento standard all'interno della scienza del gusto consentirebbe studi ad alto rendimento che separano il modo in cui le singole cellule staminali generano le cellule differenziate del sistema del gusto adulto. Inoltre, gli organoidi linguali potrebbero essere impiegati per esaminare rapidamente i farmaci per potenziali impatti sull'omeostasi del gusto, che potrebbero quindi essere studiati in modo più approfondito in modelli animali. Questo approccio alla fine migliorerà gli sforzi per ideare terapie che migliorino la qualità della vita per i futuri destinatari di farmaci.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in una struttura accreditata AAALAC in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, la legge sul benessere degli animali e la politica del servizio sanitario pubblico e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università del Colorado Anschutz Medical Campus. I topi Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2} utilizzati in questo protocollo provengono da The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.

NOTA: i seguenti passaggi devono essere completati prima di iniziare per garantire una progressione regolare e tempestiva del protocollo: impostare il bagno d'acqua a 37 °C, impostare la centrifuga a 4 °C, effettuare soluzioni enzimatiche di iniezione e dissociazione dalle soluzioni madre di dispasi, collagenasi ed elastasi da 10 mg/mL (vedere Tabella dei materiali),rimuovere il gel della matrice dal congelatore a -20 °C (~750 μL necessario per una piastra a 48 pozzetti) e scongelare immergendo il flaconcino nel ghiaccio per a almeno 3-4 ore, tubi microcentrifuga pre-rivestiti in FBS non diluito oscillando delicatamente a temperatura ambiente per almeno 30 minuti (due tubi da 2 ml per la raccolta dei tessuti, due tubi da 1,5 ml per le cellule dissociate e un tubo da 1,5 ml per la raccolta di singole cellule dalla selezionatrice cellulare; rimuovere l'FBS in eccesso prima dell'uso).

1. Isolamento dell'epitelio CVP

NOTA: Per ottenere un numero sufficiente di cellule LGR5⁺ per una piastra completa a 48 pozzetti, raccogliere tre CVP Lgr5-EGFP nello stesso tubo ed elaborare contemporaneamente. È importante sottolineare che raccogliere ed elaborare il CVP di almeno un cucciolata selvatico in parallelo in un tubo separato e utilizzarlo come controllo di gating per impostare i parametri FACS (vedere Risultati rappresentativi).

1. Eutanasia dei topi con asfissia di CO₂ secondo le normative IACUC, seguita da un metodo secondario approvato come toracotomia bilaterale, lussazione cervicale, decapitazione o dissanguamento.
2. Utilizzare grandi forbici di dissezione sterili per tagliare le guance e rompere la mascella. Sollevare la lingua e tagliare il frenulo linguale per separare la lingua dal pavimento della cavità orale. Ritagliare la lingua e raccoglierla in soluzione salina sterile ghiacciata tamponata con fosfato di Dulbecco (dPBS) con Ca²⁺ e Mg²⁺.
3. Rimuovere e scartare la lingua anteriore tagliando appena anteriormente l'eminenza intermolare con una lama di rasoio (Figura 1A, linea tratteggiata). Utilizzare una delicata salvietta per rimuovere i peli e il liquido in eccesso dalla lingua posteriore.
4. Riempire 1 mL di siringa con 200-300 μL di soluzione enzimatica per iniezione (concentrazione finale: 2 mg/mL di collagenasi di tipo I e 5 mg/mL dispasi II in Ca²⁺/Mg²⁺-contenente dPBS, diluita da 10 mg/mL di soluzioni madri) e inserire un ago da 30 G x 1/2 appena sopra l'eminenza intermolare (Figura 1B, freccia nera) fino a quando appena anteriore al CVP ( Figura1B, scatola nera). Iniettare la soluzione enzimatica sotto e ai bordi laterali del CVP tra l'epitelio e i tessuti sottostanti (lamina propria, muscolo). Prelevare la siringa lentamente e continuamente dalla lingua durante l'iniezione.
5. Incubare la lingua in dPBS sterile senza Ca²⁺/ Mg²⁺a temperatura ambiente per esattamente 33 minuti.
6. Fai piccoli tagli nell'epitelio bilateralmente e appena anteriormente al CVP usando forbici di dissezione extra fini e sbuccia delicatamente l'epitelio sollevandolo con una pinza fine. Una volta che l'epitelio della trincea è libero dal tessuto connettivo sottostante, posizionarlo in un tubo microcentrifuga vuoto da 2 ml pre-rivestito con FBS. Eseguire il taglio epiteliale prima o dopo il distacco dell'epitelio CVP (Figura 1C,D).

2. Dissociazione dell'epitelio CVP

NOTA: La dissociazione dell'epitelio CVP e la placcatura sono rappresentate graficamente nella Figura 2.

1. Aggiungere il cocktail enzimatico di dissociazione (concentrazione finale: 2 mg/mL di collagenasi di tipo I, 2 mg/mL di elastasi e 5 mg/mL di dispasi II in Ca²⁺/Mg²⁺-contenente dPBS, diluito da 10 mg/mL di soluzioni stock) in tubi contenenti epiteli CVP sbucciati (200 μL per CVP). Incubare a bagnomaria a 37 °C per 45 min. Vortice brevemente ogni 15 min.
   NOTA: Pre-riscaldamento 0,25% Tripsina-EDTA a 37 °C a bagnomaria durante gli ultimi 15 minuti di incubazione del cocktail enzimatico.
2. Dopo l'incubazione, vortice (tre impulsi) quindi triturare con una pipetta Pasteur di vetro per 1 min. Dopo che i pezzi di tessuto si sono depositati, pipettare il surnatante contenente la prima raccolta di cellule dissociate, in nuovi tubi microcentrifuga da 1,5 mL rivestiti con FBS corrispondenti al genotipo. Elaborare ulteriormente i restanti pezzi di tessuto come descritto al punto 2.3. sotto.
   1. Ruotare il surnatante per 5 minuti a 370 x g e 4 °C in celle a pellet.
   2. Rimuovere il surnatante risultante e risospese il pellet cellulare in Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Buffer (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) e 1% FBS in Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS (50 μL per CVP)). Conservare sul ghiaccio.
3. Durante l'esecuzione delle fasi 2.2.1 e 2.2.2, dissociare i restanti pezzi di tessuto dal passaggio 2.2 aggiungendo tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25% (200 μL per CVP) ai tubi microcentrifuga originali da 2 mL e incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 min. Vortice brevemente ogni 10 min.
4. Dopo l'incubazione, vortice il tubo contenente pezzi di tessuto (tre impulsi) quindi triturare con una pipetta Pasteur di vetro per 1 minuto. Dopo che i pezzi di tessuto si sono depositati, pipettare il surnatante nei tubi microcentrifuga da 1,5 ml contenenti cellule dal punto 2.2.2. Scartare i tubi contenenti i restanti pezzi di tessuto.
   1. Ruotare i tubi con celle dissociate per 5 minuti a 370 x g e 4 °C in celle a pellet.
   2. Rimuovere i pellet di cellule surnatante e riconsossenti in FACS Buffer (100 μL per CVP). Conservare sul ghiaccio.
5. Passare le celle attraverso un filtro a rete di nylon da 30 μm e aggiungere DAPI_(emissione λ = 450 nm) alle miscele cellulari prima del FACS. Isolare le cellule Lgr5-GFP⁺ tramite FACS utilizzando il canale proteico_fluorescente verde (eccitazione λ = 488 nm;_emissione λ = 530 nm). Ordinare le celle utilizzando un ugello da 100 μm in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL rivestito fbS contenente 300 μL di Ca²⁺/ Mg²⁺ dPBS libero. Posizionare le cellule sul ghiaccio fino alla placcatura.

3. Placcatura di celle Lgr5-EGFP

1. Determinare il volume di sospensione cellulare LGR5⁺ ricevuto dal citometro a flusso.
2. In base al numero di celle ottenute dal sorter, calcolare il numero di celle per μL. Quindi, determinare il volume necessario per ottenere il numero desiderato di celle per la placcatura (usiamo 200 celle per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti) e trasferire quel volume totale di celle sospese in un nuovo tubo microcentrifuga.
3. Ruotare il tubo per 5 minuti a 370 x g e 4 °C in celle a pellet (il pellet potrebbe non essere visibile). Rimuovere il surnatante e posizionare il tubo sul ghiaccio.
4. Risuscisere delicatamente il pellet cellulare nella quantità appropriata di gel della matrice (15 μL per pozzo per piastre a 48 pozzi); pipettare su e giù delicatamente per distribuire accuratamente le cellule in gel di matrice. Posizionare 15 μL di miscela di gel/cellule della matrice al centro di ciascun pozzo. Mantenere il tubo microcentrifuga sul ghiaccio in un tubo conico da 50 ml durante la placcatura per evitare che il gel della matrice si gelifichi. Continuare a miscelare la miscela di gel / cellule della matrice durante la placcatura tubando su e giù ogni tre pozzi per garantire una distribuzione uniforme delle cellule attraverso i pozzi.
5. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO_2,~95% di umidità) per 10 minuti per consentire la gelificazione della matrice. Quindi, aggiungere 300 μL di media WENRAS + Y27632 a temperatura ambiente a ciascun pozzo e restituire la piastra all'incubatore.

4. Manutenzione degli organoidi

NOTA: gli organoidi sono coltivati in mezzi organoidi convenzionali (WENR) comprendenti EGF ricombinante e mezzi condizionati al 50% contenenti Wnt3a, Noggin e R-spondin²³. I farmaci A8301 e SB202190 vengono aggiunti per i primi 6 giorni del periodo di coltura per ottimizzare la crescita (wenras media) (Figura 5), quindi rimossi per promuovere la differenziazione (wenr media)²⁰. Y27632 viene aggiunto per i primi 2 giorni di cultura per promuovere la sopravvivenza. Le condizioni dei supporti relative alla sequenza temporale della cultura sono presentate nella Figura 4.

1. Due giorni dopo la placcatura, rimuovere i supporti WENRAS + Y27632 da ciascun pozzo utilizzando una pipetta da 1 mL, assicurando che non vi siano contaminazioni incrociate. Aggiungere 300 μL di media WENRAS lungo il lato del pozzo per non interrompere il gel della matrice. Restituire la piastra all'incubatrice.
2. Cambiare i media ogni 2 giorni, utilizzando il supporto appropriato per la fase di coltura (Figura 4). Mantenere gli organoidi fino al giorno 12, quando gli organoidi sono pronti per la raccolta.

5. Elaborazione dell'RNA

1. Raccolta di organoidi per RNA
   1. Posizionare la piastra a 48 pozzi sul ghiaccio per 30 minuti per depolimerizzare il gel della matrice.
   2. Utilizzando una pipetta da 1 mL, tirare su il mezzo organoide; quindi, quando il supporto viene restituito al pozzo, utilizzare la punta della pipetta per graffiare e rompere ulteriormente il gel della matrice. Trasferire il contenuto in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml, combinando il contenuto di tre pozzetto in un tubo. Centrifugare i tubi per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
   3. Rimuovere il maggior numero possibile di surnatante media senza rimuovere alcun organoide; quindi, girare nuovamente i tubi per 5 minuti a 300 x g a temperatura ambiente.
   4. Rimuovere il mezzo rimanente e risuscimere gli organoidi in un tampone di lisi da 350 μL + β-mercaptoetanolo (βME) (10 μL βME per tampone di lisi da 1 mL). Posizionare i campioni su ghiaccio per l'estrazione immediata dell'RNA o conservare a -80 °C.
2. Analisi quantitativa RT-PCR
   1. Misurare la quantità di RNA tramite spettrofotometro. Trascrivere inversamente l'RNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA.
   2. Miscelare cDNA equivalente a 5 ng RNA con primer pre-convalidati in avanti e in retromarcia da 200 nM (Tabella 1) e pcr master mix fluorescente. Eseguire la reazione qRT-PCR per 40 cicli a: 95 °C per 15 s, quindi 60 °C per 60 s.

6. Immunoistochimica

1. Raccolta e fissaggio degli organoidi
   1. Posizionare la piastra a 48 fori sul ghiaccio per 30 minuti per allentare il gel della matrice.
   2. Rimuovere il mezzo organoide e aggiungere 400 μL di PBS ghiacciato a ciascun pozzo. Quindi, rimuovere PBS e aggiungere 400 μL di soluzione di recupero cellulare ghiacciata a ciascun pozzo. Oscillare dolcemente a 4 °C per 30 min.
   3. Rivestire una punta di pipetta da 1 mL con l'1% di BSA in PBS e pipettare delicatamente il contenuto del pozzo su e giù per rompere il gel della matrice. Trasferire gli organoidi in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml posto sul ghiaccio.
   4. Risciacquare ogni bene con 300 μL PBS + 1% BSA e trasferire eventuali organoidi rimanenti nei tubi corrispondenti. Rimuovere Cell Recovery Solution/PBS + BSA da ogni tubo. Aggiungere 400 μL di PBS ghiacciato, quindi ripetere con un altro risciacquo PBS ghiacciato.
   5. Rimuovere PBS e fissare gli organoidi con 300 μL di PFA al 4% ghiacciato (in 0,1 M PB) per 20 minuti, incubando a temperatura ambiente. Rimuovere il PFA e risciacquare gli organoidi con PBS ghiacciato da 400 μL.
   6. Rimuovere PBS; quindi, aggiungere 400 μL PBS + 1% BSA. Conservare a 4 °C.
2. Colorazione immunofluorescenza
   1. Risciacquare gli organoidi in 500 μL PBS + 1% BSA. Quindi, incubare gli organoidi in soluzione bloccante (5% normale siero di capra o asino, 1% albumina sierica bovina, 0,3% Triton X 100 in 1x PBS pH 7,3) per 2 ore, oscillando delicatamente a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere la soluzione anticorpale primaria (anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante) e dondolare delicatamente per 3 notti a 4 °C.
   3. Lavare gli organoidi 4x per 1 ora con 500 μL PBS + 0,2% Tritone, oscillando delicatamente a temperatura ambiente. Aggiungere una soluzione anticorpale secondaria (anticorpi secondari diluiti in soluzione bloccante) e organoidi di roccia durante la notte, al riparo dalla luce, a 4 °C.
   4. Lavare gli organoidi 3x per 1 ora con 500 μL PBS + 0,2% Tritone, al riparo dalla luce e oscillando delicatamente a temperatura ambiente. Incubare con DAPI diluito 1:10.000 in 0,1 M PB per 20 min, oscillando e coperto a temperatura ambiente.
   5. Lavare gli organoidi 3x per 20 min con 0,1 M PB, dondolando delicatamente e coperti a temperatura ambiente.
3. Montaggio a slitta di organoidi per microscopia confocale invertita.
   NOTA: le immagini dettagliate del processo di montaggio delle diapositive sono mostrate nella Figura 7.
   1. Creare un perimetro quadrato di circa 1 mm di spessore 22 x 22 mm di argilla modellante non tossica su un vetrino per microscopio.
   2. Rimuovere 0,1 M PB dal tubo di microcentrifuga e risospendare delicatamente gli organoidi in un mezzo di montaggio da 100 μL a scelta; quindi, trasferire al centro del quadrato di argilla.
   3. Riempire il quadrato di argilla fino a quando il mezzo di montaggio è quasi in cima. Quindi, posizionare 22 x 22 mm di copertura quadrata su argilla e premere saldamente sui lati del coperchio per sigillare. Lasciare polimerizzare secondo le istruzioni del produttore (qui, temperatura ambiente per 1-2 giorni) e conservare a 4 °C.

Risultati

I topi hanno un CVP, situato posteriormente sulla lingua, da cui possono essere isolate le cellule staminali LGR5⁺ (Figura 1A, scatola nera). L'iniezione di una soluzione enzimatica sotto e intorno al CVP (Figura 1B) provoca un leggero gonfiore dell'epitelio e la digestione del tessuto connettivo. Una digestione sufficiente si ottiene dopo un'incubazione di 33 minuti, che consente una facile separazione dell'epitelio CVP dal tessuto s...

Discussione

Riportato qui è un metodo efficiente e facilmente ripetibile per la coltivazione, il mantenimento e l'elaborazione di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto di topo adulto. È stato scoperto che l'utilizzo di tre CVP da 8 a 20 settimane di topi Lgr5-EGFP è sufficiente per ottenere ~ 10.000 cellule GFP⁺ per uso sperimentale, con il risultato di 50 pozzetti placcati ad una densità di 200 cellule per pozzo in piastre a 48 pozzetti. La rimozione degli epiteli della trincea CVP è ot...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG	Molecular Probes	A11056, RRID: AB_142628	1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A11010, RRID:AB_2534077	1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG	Invitrogen	A11075, RRID:AB_2534119	1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A31573, RRID:AB_2536183	1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG	Molecular Probes	A21247, RRID:AB_141778	1:2000
DAPI (for FACS)	Thermo Fischer	62247
DAPI (for immunohistochemistry)	Invitrogen	D3571, RRID:AB_2307445	1:10000
Goat anti-CAR4	R&D Systems	AF2414, RRID:AB_2070332	1:50
Guinea pig anti-KRT13	Acris Antibodies	BP5076, RRID:AB_979608	1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-395, RRID:AB_673678	1:250
Rabbit anti-NTPDASE2	CHUQ	mN2-36LI6, RRID:AB_2800455	1:300
Rat anti-KRT8	DSHB	TROMA-IS, RRID: AB_531826	1:100
Equipment
2D rocker	Benchmark Scientific Inc.	BR2000
3D Rotator	Lab-Line Instruments	4630
Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	S407992
Centrifuge	Eppendorf	5415D
CO2 tank	Airgas	CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4110	184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte	Sartorius	Model: S3	Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100	Cytomation Inc	Model: S13211997	Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E1
Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5417R
Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Thermal Cycler	Bio-Rad	580BR
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Water bath	Precision	51220073
Media
A83 01	Sigma	SML0788-5MG	Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 Supplement	Gibco	17504044	Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin	Gibco	15750-060	Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax	Gibco	35050061	Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES	Gibco	15630080	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF	Peprotech	315-09-1MG	Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin	Peprotech	250-38	Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100g	Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190	R&D Systems	1264	Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media			Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug	APExBIO	A3008-10	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%	Sigma	M3148-25ML	β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1420-2700
48-well plates	Thermo Scientific	150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets	Fisherbrand	12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Life Science	A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer	QIAGEN	1015750
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I	Sigma Life Science	C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear	R&D Systems	3533-005-02	Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001
Disposable Filters	Sysmex	04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)	Gibco	10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)	Promega	V4231
Elastase Lyophilized	Worthington Biochemical	LS002292
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
HEPES Solution	Sigma Life Science	H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA	Thermo Scientific	25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1706691
Modeling Clay, Gray	Sargent Art	22-4084
Needle	BD Syringe	305106
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
RNeasy Micro Kit	QIAGEN	74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	022363204
Sodium Chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher Chemical	7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous	Fisher Bioreagents	7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Triton X-100	Sigma Life Science	T8787-100ML
VWR micro cover glass	VWR	48366067	22x22mm