JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم ونقيم بروتوكولا لإنشاء أعمدة كروماتوغرافيا سائلة ذات تدفق نانوي منخفض التكلفة لتوصيف الببتيد باستخدام تدفقات عمل البروتينات LC-MS / MS.

Abstract

يتطلب التعقيد العالي السائد في العينات البيولوجية فصلا كروماتوجرافيا بحساسية ودقة عالية ليتم تحليلها بشكل فعال. نقدم هنا بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار وغير مكلف لإعداد أعمدة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ذات التدفق العكسي للنانو (RP-HPLC) لفصل الببتيدات التحليلية عبر الإنترنت قبل إدخالها واكتشافها بواسطة مطياف الكتلة في سير عمل البروتينات التقليدية من أسفل إلى أعلى. اعتمادا على هدف التجربة والخصائص الكيميائية للتحليلات التي يتم فصلها ، قد تختلف معلمات العمود المثلى في أقطارها الداخلية أو الخارجية ، والطول ، وحجم الجسيمات ، وحجم المسام ، وكيمياء جزيئات الطور الثابتة ، ووجود أو عدم وجود باعث رش كهربائي متكامل عند الحافة. لا يتيح نظام تعبئة الأعمدة الداخلي التصنيع السريع للأعمدة ذات الخصائص المرغوبة فحسب ، بل يقلل أيضا بشكل كبير من تكلفة العملية. يتوافق البروتوكول الأمثل لتعبئة عمود السيليكا المنصهر C18 AQ (المائي) الذي تمت مناقشته هنا مع مجموعة واسعة من الأدوات الكروماتوغرافية السائلة لتحقيق الفصل الفعال للتحليلات.

Introduction

ساهمت أعمدة HPLC بشكل كبير في الإنتاجية في مجالات البحوث الصيدلانية والطبية والبيئية1،2،3،4. يعد الوصول إلى أعمدة الكروماتوغرافيا عالية الجودة خطوة محورية في تجزئة التحليلات المعقدة. في بروتينات البندقية ، يتم تحقيق حساسية تحليلية عالية بشكل روتيني عن طريق اقتران قياس الطيف الكتلي بالتأين بالرش الكهربائي (ESI) بكروماتوغرافيا التدفق النانوي5،6،7،8. يعد الفصل الفعال لآلاف الببتيدات أمرا بالغ الأهمية في هذا التطبيق لأنه يسمح لمطياف الكتلة بتحديد وتحديد التحليلات ذات الحساسية والدقة العالية.

شهد مجال تعبئة الأعمدة لتطبيقات القياس الطيفي الكتلي نموا هائلا في السنوات الأخيرة مع التقدم في فهم مبادئ تعبئة الأعمدة الأساسية المتعلقة بمورفولوجيا الطور الثابت وتفاعلات المذيبات والجسيمات وتصميم الأجهزة ، مما يجعل التوصيف التفصيلي لمجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية في البيئات البيولوجية المعقدة9،10،11،12،13،14. مهدت الجهود التي تسلط الضوء على الاعتبارات العملية في تعبئة الأعمدة التحليلية لأغراض LC-MS الطريق أمام مختبرات البروتينات لتطوير أنظمة تعبئة داخلية لتلبية اهتماماتها الخاصة مع وعد بأقصى أداء15،16،17،18.

أعمدة الرش النانوي بأقطار داخلية في حدود 50-150 ميكرومتر ونهايات مدببة مناسبة تماما لغرض تأين الرش الكهربائي. في مجال بروتينات البندقية ، يتم إجراء عمليات الفصل عادة باستخدام تدرج مذيب يتدفق عبر مرحلة ثابتة غير قطبية معبأة ، والأكثر شيوعا السيليكا المرتبطة بسلسلة الكربون الكارهة للماء (C8-C30) بأحجام جسيمات تتراوح بين 1.7 إلى 3.5 ميكرومتر19،20،21،22. تنبعث التحليلات المملوءة من خلال باعث ESI مدمج داخل العمود ، مما يضمن التأين الناعم لتحليلات طور المحلول إلى الأيونات الغازية. أدى اقتران أعمدة LC مع ESI-MS إلى تطوير تطبيق قياس الطيف الكتلي الترادفي بشكل كبير على استراتيجيات البروتين في العلوم الطبية الحيوية.

تؤدي أعمدة LC ذات الأقطار الداخلية الضيقة إلى قمم كروماتوغرافية أضيق وحساسية أعلى بالنسبة للتجويف الأعلى وأعمدة التدفق الصغير ، وبالتالي فهي مفيدة بشكل خاص مع تدفقات العمل البروتينية. على الرغم من أن أعمدة LC المعبأة مسبقا المتوفرة تجاريا هي خيارات جذابة نظرا لراحتها وسهولة استخدامها ، إلا أنها يمكن أن تكون باهظة الثمن وأقل مرونة من الخيارات الداخلية. الهدف من هذا العمل هو وصف نهج تعبئة الملاط البسيط تقنيا ومنخفض التكلفة لإعداد أعمدة HPLC ذات الطور المعكوس ذات القطر الداخلي الضيق باستخدام الشعيرات الدموية المصنوعة من السيليكا المنصهرة ونظام قنبلة ضغط مدمج داخليا للتطبيقات البروتينية.

Protocol

1. تحضير الطرف الشعري

  1. باستخدام حجر شق من السيراميك ، قم بقص حوالي 60-70 سم من الشعيرات الدموية المدمجة من السيليكا المطلية بالبوليميد بقطر داخلي (ID) يبلغ 75 ميكرومتر وقطر خارجي (OD) يبلغ 360 ميكرومتر.
  2. أمسك الشعيرات الدموية بيديك في منتصف طولها تقريبا ، مع ترك فجوة 4-5 سم بين الأصابع وقم بتسخين المنطقة الموجودة في الفجوة أثناء تدويرها فوق لهب مصباح الكحول. قم بتلميع المنطقة المحترقة ونظفها باستخدام منديل منخفض الوبر مبلل بالميثانول حتى يصبح الزجاج مرئيا. (الشكل 1).
    ملاحظة: يجب الكشف عن 4-5 سم من الشعيرات الدموية المنصهرة المصنوعة من السيليكا المطلية بالبوليميد وصقلها قبل تحميلها في مجتذب الليزر.
  3. من أجل سحب باعث على شكل مخروطي ل ESI ، استخدم مجتذب طرف ليزر مع إعدادات برنامج خاصة بقيمة حرارية تبلغ 300 (ما يعادل 2 واط من طاقة الليزر) ، وسرعة 10 (ما يعادل 0.25 مم / ثانية) وتأخير 180 مللي ثانية من أجل الحصول على طرف قطره ~ 1-5 ميكرومتر (الشكل 2 والشكل 3 أ). قم بتحميل الجزء المصقول من الشعيرات الدموية في مجتذب الليزر واضغط على السحب ، مما ينتج عنه عمودان شعريان فارغان جاهزان للتعبئة.
    ملاحظة: يتم إجراء الفحص المتكرر للطرف في أي خطوة باستخدام المجهر. من المحتمل أن تختلف الإعدادات بين ساحبات الليزر وستحتاج إلى تحديدها تجريبيا.

2. بلمرة / نقش الحافة

  1. من أجل الاحتفاظ بجزيئات الطور الثابتة في الأنبوب الشعري ، قم بإعداد فريت مسامي من خليط من محلولي سيليكات البوتاسيوم والفورماميد. اصنع المحلول مباشرة قبل الاستخدام في أنبوب سعة 2 مل واخلطه باستخدام دوامة.
    1. امزج محلولي سيليكات البوتاسيوم مع SiO2 / K2O بنسبة 2.50 (وزن / وزن) و 1.65 (وزن / وزن) وفورماميد بنسبة 1: 3: 1 (v / v / v) ، على التوالي. على سبيل المثال ، امزج 100 ميكرولتر من سيليكات البوتاسيوم مع نسبة SiO2 / K2O 2.50 (وزن / وزن) ، و 300 ميكرولتر من سيليكات البوتاسيوم مع نسبة SiO2 / K2O 1.65 (وزن / وزن)) ، و 100 ميكرولتر من الفورماميد متبوعا بالدوامة. سوف يتبلمر هذا المحلول عند تسخينه وينتج فريت مسامي.
  2. اغمر الطرف الشعري المسحوب بالليزر في الخمور الأم الصافية لتعليق الفريت (وليس الرواسب) لمدة 10-20 ثانية ، مما يسمح لها باختراق حوالي 5 مم في الطرف عن طريق العمل الشعري. اعتمادا على عرض الطرف ، قد تكون هناك حاجة إلى إبقاء الطرف مغمورا لفترة أطول في محلول فريت. بشكل عام ، يكون وقت الغمس أقصر إذا كان الطرف أوسع لأن المحلول يمكن أن يدخل الطرف بشكل أسرع.
  3. ضع مكواة لحام ساخنة (مثبتة على 350 درجة فهرنهايت) على طول الطرف لبدء بلمرة محلول فريت أثناء فحص الشعيرات الدموية تحت المجهر. يرجى الرجوع إلى الشكل 3 لرؤية الطرف المسحوب قبل (الشكل 3 أ) وبعد البلمرة (الشكل 3 ب).
  4. لمنع انسداد الباعث بعد بلمرة الفريت ، اغمر طرف العمود في محلول حمض الهيدروفلوريك (HF) بنسبة 50٪ لمدة 5 دقائق (الإعداد موضح في الشكل 4). يضفي النقش HF أيضا هندسة مسطحة على شكل مخروطي للعمود مما يزيد من طول عمره. بعد النقش بالتردد العالي ، تأكد من غسل طرف العمود جيدا ، أولا باستخدام محايد HF ثم بسخاء بالماء للحماية من ملامسة الحمض.
    تنبيه: HF مادة كيميائية شديدة الخطورة ومسببة للتآكل. ينصح بتوخي الحذر الشديد أثناء المناولة لمنع التعرض. تأكد من التعامل مع HF في جميع الأوقات مع الحماية المناسبة داخل غطاء الدخان المحدد بعلامة تقول "خطر! السموم الحادة".
    1. من أجل السلامة ، استخدم معاطف المختبر العادية والمضادة للاشتعال ، بالإضافة إلى طبقات مزدوجة من قفازات النتريل والنيوبرين ، أثناء التعامل مع HF.
      ملاحظة: إنه اختياري لفريت نصائح الشعيرات الدموية. ومع ذلك ، فإنه يجعل العمود أكثر مقاومة للانسداد ويزيد من طول عمره. تتوفر الأعمدة الشعرية الفارغة المصنوعة من السيليكا المنصهرة مع باعث الرش الكهربائي المدمج تجاريا ويمكن استخدامها لاستبدال الخطوتين 1 و 2 إذا لزم الأمر.

3. إعداد المرحلة الثابتة

  1. قم بتعليق 25-50 مجم من جزيئات السيليكا ReproSil-Pur 120 C18-AQ المسامية بالكامل بحجم جسيمات 1.9 ميكرومتر وحجم مسام 120 Å في 300 ميكرولتر من الميثانول. Pipet لأعلى ولأسفل لمدة 20 مرة لضمان خليط متجانس من جزيئات الملاط في الميثانول.
  2. ضع الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الملاط داخل حجرة خلية الضغط لنظام قنابل تعبئة الأعمدة المبني داخليا ، والذي بدوره يتم إعداده فوق محرك مغناطيسي يسمح لجزيئات الملاط بالبقاء في حالة تعليق. قم بتوصيل القنبلة بخزان الهيليوم (<1500 رطل لكل بوصة مربعة) الذي يعمل بضغط مستمر لتجنب تعطيل ملاط HPLC أثناء التعبئة. (ممثلة في الشكل 5).
  3. قم بتأمين غطاء خلية الضغط عن طريق إحكام ربطه في مكانه بالبراغي كما هو موضح في الشكل 6 أ.
    ملاحظة: من المهم تقدير الاختلاف في تشغيل مضخة HPLC وقنبلة التعبئة HPLC. في حين أن الأول مصمم للعمل بمعدل تدفق ثابت بغض النظر عن الضغط الخلفي الذي تمارسه المرحلة الثابتة في العمود ، تعمل أنظمة ضغط التعبئة HPLC بضغط ثابت لضمان تعبئة غير منقطعة وكثيفة لجزيئات الطور الثابتة على طول العمود الشعري.

4. تعبئة العمود بمرحلة ثابتة

  1. قم بربط الجزء السفلي من العمود أولا (الطرف المفتوح غير الممزق) من خلال التركيب المحكم بإصبع أعلى قنبلة الضغط بحيث يشير طرف العمود إلى الأعلى. ادفع العمود من خلال حتى يلامس قاعدة القارورة التي تحتوي على ملاط وسحبها 1-2 مم فوق القاعدة. شد التركيب المحكم لتثبيت العمود في موضعه.
  2. قم بتوصيل قنبلة التعبئة بخزان غاز الهيليوم (الضغط الموصى به < 1500 رطل لكل بوصة مربعة) وقم بتشغيله إلى ضغط ~ 1300 رطل لكل بوصة مربعة. يدخل غاز الهيليوم إلى خلية الضغط التي تحتوي على القارورة المحتوية على الملاط من خلال صمام ثلاثي الاتجاهات. افتح الصمام عن طريق تدويره ببطء 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة.
    ملاحظة: بمجرد أن يبدأ غاز الهيليوم في التدفق داخل الغرفة ، فإنه يدفع الملاط من الأنبوب إلى الشعيرات الدموية. عندما يمر الملاط عبر العمود ، يتم الاحتفاظ بالجسيمات في الشعيرات الدموية بينما يشكل المذيب قطرة سائلة عند طرف العمود (الشكل 6 ب).
    1. إذا تأخر تكوين قطرة سائلة على طرف العمود ، فقم بإشعال الطرف بسرعة للتأكد من فتحه. في هذه المرحلة ، يمكن أن يساعد مصدر الضوء الموجود خلف العمود في مراقبة تقدم عملية التعبئة (الشكل 7). بالنسبة للعمود الذي يبلغ معرفه 75 ميكرومتر ، يستغرق الأمر عادة ~ 30-60 دقيقة لحزم طوله حوالي 30 سم.
    2. إذا توقف تدفق الملاط عبر العمود أو تباطأ ، فأمسك الشعيرات الدموية بإحكام فوق التركيب المحكم لقنبلة التعبئة وقم بفكها قليلا عن طريق الدوران حوالي ربع دورة (قد يسمع صوت هسهسة لخفض الضغط).
      ملاحظة: يسمح هذا بإعادة وضع العمود دون الحاجة إلى خفض ضغط القنبلة تماما.
    3. الآن أعد وضع العمود برفق عن طريق تحريكه لأعلى ولأسفل ثم أعد شد التركيب المحكم مع التأكد من أن العمود لا يلمس قاعدة القارورة. هذا يضمن تدفقا موحدا للطين عبر الشعيرات الدموية في جميع الأوقات.
    4. إذا فشل الإجراء المذكور أعلاه في استئناف التعبئة ، فأغلق الصمام ، وقم بتنفيس قنبلة التعبئة ، وفك الغطاء وافحص الملاط للتأكد من عدم وجود رواسب. من الممكن أيضا أن تكون نهاية العمود مسدودة بجزيئات الطور الثابتة الصلبة وفي هذه الحالة ، قد يساعد قطع طول صغير من الجزء الخلفي من الشعيرات الدموية في استئناف التدفق.
  3. قم بتعبئة بضعة سنتيمترات أطول من الطول المطلوب في نهاية العمود لضمان التعبئة الكاملة للجزيئات الثابتة وتقليل إمكانية إدخال فقاعات الهيليوم في العمود المعبأ.

5. الانتهاء من العمود وجعل الفريت الخلفي

  1. بمجرد تحقيق طول التعبئة المطلوب ، أغلق الصمام الرئيسي لخزان غاز الهيليوم ، وانتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل لضمان التعبئة الموحدة للعمود وللسماح للنظام بإزالة الضغط الذاتي.
    ملاحظة: من أجل تجنب إدخال فقاعات He نتيجة للسيليكا المنصهرة الفارغة في نهاية العمود ، يوصى بطول تعبئة أطول. من الأهمية بمكان أن تستمر عملية التعبئة حتى بعد تعبئة جزء العمود المرئي للعين لحساب طول الشعيرات الدموية داخل غرفة الضغط. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بطول تعبئة أطول في الحالات التي تتطلب إعادة وضع العمود بشكل متكرر لأن هذا ينتج عنه فقاعات هواء أقل وكفاءة تعبئة أعلى.
  2. قم بإزالة ضغط الغرفة برفق عن طريق تدوير الصمام 180 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة إلى موضعه الأصلي. أمسك العمود بإحكام ، وفك التركيب المحكم وقم بإزالة العمود تدريجيا. يجب القيام بهذه الخطوة برفق شديد لتجنب إدخال فقاعات الهواء.
  3. قطع نهاية العمود بطول 25.5 سم. أثناء الفحص تحت المجهر ، استخدم مكواة لحام ساخنة عند 350 درجة فهرنهايت لإزالة طول 0.5 سم من الملاط من الطرف الخلفي للعمود.
    1. اغمس الطرف الخلفي للعمود في محلول الفريت المتبقي من الخطوة 2.1 لمدة 10 ثوان تقريبا وقم ببلمرته عن طريق وضع مكواة لحام ساخنة على طول الجزء الخلفي من العمود أثناء فحصه تحت المجهر. يضمن الفريت الخلفي بقاء جزيئات ReproSil-Pur 120 C18-AQ في العمود ويمنع التدفق العكسي أثناء الغسيل الكروماتوجرافي.
      ملاحظة: الفريت الموجود في الجزء الخلفي من العمود اختياري أيضا ولكنه يجعل العمود أكثر قوة كما لوحظ أيضا بالنسبة للفريت الأمامي في الخطوة 2.

النتائج

لتقييم أداء الأعمدة ، تم تجزئة 750 نانوغرام من هضم الببتيد التربتيك المحضر من محللات الخلية الكاملة لخلايا HEK293 عبر الإنترنت باستخدام شعرية من السيليكا المنصهرة بطول 25 سم و 75 ميكرومتر معبأة في المنزل مع جزيئات ReproSil-Pur 120 C18-AQ السائبة كما هو موضح في البروتوكول. قبل تحميل العي?...

Discussion

تعتمد الاستراتيجيات البروتينية الحديثة على الفواصل الكروماتوغرافية عالية الجودة لتحليل الأنظمة البيولوجية المعقدة بشكل فعال. ومن ثم ، فإن أعمدة LC ذات التدفق النانوي عالية الأداء والفعالة من حيث التكلفة هي مكونات حاسمة لنظام قياس الطيف الكتلي الترادفي الناجح الذي يهد?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM089778 منح ل J.A.W.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
99.99% Formamide acidSigma-Aldrichfor making frit
alcohol lampAny brandFor providing heat
Brechbuehler helium pressure cellBioSurplusfor packing column
Ceramic column cutterAny brandfor cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%Sigma-AldrichStored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%Sigma-Aldrichfor making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)Fisher Scientificfor opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)PQ Corporationfor making frit
Orbitrap Fusion LumosThermo Fisher Scientificfor MS data acquisition
P2000 Laser PullerSutterfor pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube FittingChromre214104For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1gDr. Masch GmbHr119.aq.0001Batch 5910
SolderingAny brandFor initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPTSwagelokSS-4-HCGfor bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µODMOLEX/Polymicro1068150019For column tubing
Ultimate 3000 UHPLCDionexHPLC type

References

  1. Richards, A. L., et al. One-hour proteome analysis in yeast. Nature Protocols. 10 (5), 701-714 (2015).
  2. Shishkova, E., Hebert, A. S., Coon, J. J. Now, More Than Ever, Proteomics Needs Better Chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
  3. D'Atri, V., Fekete, S., Clarke, A., Veuthey, J. L., Guillarme, D. Recent Advances in Chromatography for Pharmaceutical Analysis. Analytical. Chemistry. 91 (1), 210-239 (2019).
  4. Gama, M. R., Collins, C. H., Bottoli, C. B. G. Nano-Liquid Chromatography in Pharmaceutical and Biomedical Research. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 694-703 (2013).
  5. Wilson, S. R., Vehus, T., Berg, H. S., Lundanes, E. Nano-LC in proteomics: recent advances and approaches. Bioanalysis. 7 (14), 1799-1815 (2015).
  6. Wilson, S. R., Olsen, C., Lundanes, E. Nano liquid chromatography columns. Analyst. 144 (24), 7090-7104 (2019).
  7. Cutillas, P. R. Principles of Nanoflow Liquid Chromatography and Applications to Proteomics. Current Nanoscience. 1 (1), 65-71 (2005).
  8. Dams, M., Dores-Sousa, J. L., Lamers, R. J., Treumann, A., Eeltink, S. High-Resolution Nano-Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometric Detection for the Bottom-Up Analysis of Complex Proteomic Samples. Chromatographia. 82 (1), 101-110 (2019).
  9. Stehling, O., et al. MMS19 Assembles Iron-Sulfur Proteins Required for DNA Metabolism and Genomic Integrity. Science. 337 (6091), 195-199 (2012).
  10. Mayank, A. K., et al. An Oxygen-Dependent Interaction between FBXL5 and the CIA-Targeting Complex Regulates Iron Homeostasis. Molecular cell. 75 (2), 282 (2019).
  11. Nie, M., Oravcová, M., Jami-Alahmadi, Y., Wohlschlegel, J. W., Lazzerini-Denchi, E., Boddy, M. N. FAM111A induces nuclear dysfunction in disease and viral restriction. European Molecular Biology Organization. 22 (2), 50803 (2021).
  12. Wahab, M. F., Patel, D. C., Wimalasinghe, R. M., Armstrong, D. W. Fundamental and Practical Insights on the Packing of Modern HighEfficiency Analytical and Capillary Columns. Analytical Chemistry. 89 (16), 8177-8191 (2017).
  13. Blue, L. E., Jorgenson, J. W. 1.1 µm Superficially porous particles for liquid chromatography: Part II: Column packing and chromatographic performance. Journal of Chromatography A. 1380, 71-80 (2015).
  14. Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-High Pressure (>30,000 psi) Packing of Capillary Columns Enhancing Depth of Shotgun Proteomic Analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
  15. Liu, H., Finch, J. W., Lavallee, M. J., Collamati, R. A., Benevides, C. C., Gebler, J. C. Effects of Column Length, Particle Size, Gradient Length and Flow Rate on Peak Capacity of Nano-Scale Liquid Chromatography for Peptide Separations. Journal of Chromatography A. 1147 (1), 30-36 (2007).
  16. Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A., , FlashPack. Fast and Simple Preparation of Ultrahigh-performance Capillary Columns for LC-MS. Molecular and cellular proteomics. 18 (2), 383-390 (2019).
  17. Capriotti, F., Leonardis, I., Cappiello, A., Famiglini, G., Palma, P. A Fast and Effective Method for Packing Nano-LC Columns with Solid-Core Nano Particles Based on the Synergic Effect of Temperature, Slurry Composition, Sonication and Pressure. Chromatographia. 76, 1079-1086 (2013).
  18. Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of High SlurryConcentration and Sonication to Pack High-Efficiency, Meter-Long Capillary Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography Columns. Journal of Chromatography A. 1462, 165-169 (2016).
  19. Pesek, J. J., Matyska, M. T. Our favorite materials: Silica hydride stationary phases. Journal of Separation Science. 32 (23), 3999-4011 (2009).
  20. Borges, E. M., Volmer, D. A. Silica, Hybrid Silica, hydride Silica and Non-Silica Stationary Phases for Liquid Chromatography. Part II: Chemical and Thermal Stability. Journal of Chromatographic Science. 53 (7), 580-597 (2015).
  21. Vyňuchalová, K., Jandera, P. Comparison of a C30 Bonded Silica Column and Columns with Shorter Bonded Ligands in Reversed-Phase LC. Chromatographia. 78 (13-14), 861-871 (2015).
  22. Novotny, M. V. Development of capillary liquid chromatography: A personal perspective. Journal of Chromatography A. 1523, 3-16 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RP HPLC C18 AQ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved