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Method Article
여기에서는 LC-MS/MS 단백질체학 워크플로우를 사용하여 펩타이드 특성 분석을 위한 저비용 역상 나노 흐름 액체 크로마토그래피 컬럼을 만들기 위한 프로토콜을 제시하고 평가합니다.
생물학적 시료에 널리 퍼져 있는 높은 복잡성으로 인해 효과적인 분석을 위해 높은 감도와 분해능을 가진 크로마토그래피 분리가 필요합니다. 여기에서는 기존의 상향식 단백질체학 워크플로우에서 질량 분광계에 도입 및 검출하기 전에 분석 펩타이드를 온라인 분리하기 위한 나노 흐름 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 컬럼 준비를 위한 강력하고 재현 가능하며 저렴한 프로토콜을 소개합니다. 실험의 목적과 분리되는 분석물질의 화학적 특성에 따라 최적의 컬럼 파라미터는 내부 또는 외부 직경, 길이, 입자 크기, 공극 크기, 고정상 입자의 화학적 성질, 팁에 통합된 전기 분무 이미터의 유무에 따라 달라질 수 있습니다. 자체 컬럼 패킹 시스템을 사용하면 원하는 특성을 가진 컬럼을 신속하게 제작할 수 있을 뿐만 아니라 공정 비용을 크게 절감할 수 있습니다. 여기에서 논의된 C18 AQ(수성) 용융 실리카 컬럼 패킹을 위한 최적화된 프로토콜은 분석물질의 효과적인 분리를 달성하기 위한 다양한 액체 크로마토그래피 기기와 호환됩니다.
HPLC 컬럼은 제약, 의료 및 환경 연구 분야의 생산성에 크게 기여했습니다 1,2,3,4. 고품질 크로마토그래피 컬럼에 접근하는 것은 복잡한 분석물질의 분획에서 중추적인 단계입니다. 샷건 단백질체학에서는 전기분무 이온화(ESI) 질량분석법(MS)을 나노플로우 크로마토그래피 5,6,7,8에 결합하여 높은 분석 감도를 일상적으로 달성합니다. 수천 개의 펩타이드를 효율적으로 분리하는 것은 질량분석기가 높은 감도와 분해능으로 분석물을 식별하고 정량화할 수 있도록 하기 때문에 이 응용 분야에서 가장 중요합니다.
질량 분석 응용 분야를 위한 컬럼 패킹 분야는 고정상 형태학, 용매-입자 상호 작용 및 하드웨어 설계와 관련된 기본 컬럼 패킹 원리에 대한 이해가 발전함에 따라 최근 몇 년 동안 엄청난 성장을 목격하여 복잡한 생물학적 환경에서 광범위한 생체 분자의 상세한 특성화를 가능하게 했습니다 9,10,11,12,13,14 입니다. LC-MS 목적으로 분석 컬럼을 패킹할 때 실질적인 고려 사항을 강조하는 노력은 단백질체학 실험실에서 최대 성능 15,16,17,18을 약속하는 특정 관심사를 충족하는 자체 패킹 시스템을 개발할 수 있는 길을 열었습니다.
내부 직경이 50-150μm 범위이고 끝이 가늘어지는 나노 스프레이 컬럼은 전기 분무 이온화 목적에 매우 적합합니다. 샷건 단백질체학 분야에서 분리는 일반적으로 1.7에서 3.5 μm 사이의 입자 크기를 갖는 가장 일반적으로 소수성 탄소 사슬 결합 실리카 (C8-C30)인 패킹 된 비극성 고정상을 통해 흐르는 용매 구배를 사용하여 수행됩니다 19,20,21,22. 용리 분석물은 컬럼 내에 통합된 ESI 이미터를 통해 방출되며, 이는 용액상 분석물이 기체 이온으로 연질 이온화되도록 보장합니다. LC 컬럼과 ESI-MS의 결합은 탠덤 질량 분석법의 적용을 생물 의학의 단백질체학 전략에 크게 발전시켰습니다.
내부 직경이 좁은 LC 컬럼은 더 높은 보어(bore), 마이크로플로우(microflow) 컬럼에 비해 크로마토그래피 피크가 좁고 감도가 높기 때문에 단백질체학 워크플로우에 특히 유리합니다. 시판되는 사전 패킹 LC 컬럼은 편리함과 사용 편의성으로 인해 매력적인 옵션이지만, 엄청나게 비싸고 사내 옵션보다 유연성이 떨어질 수 있습니다. 이 작업의 목표는 융합 실리카 모세관과 단백질체학 응용 분야를 위한 사내 제작 압력 폭탄 시스템을 사용하여 좁은 내경 역상 HPLC 컬럼을 준비하기 위해 기술적으로 간단하고 저렴한 슬러리 패킹 접근 방식을 설명하는 것입니다.
1. 모세관 팁의 준비
2. 팁의 중합/에칭
3. 고정상의 준비
4. 정지된 단계를 가진 란 패킹
5. 란을 끝내고 back-frit를 만들기
컬럼의 성능을 평가하기 위해 HEK293 세포의 전체 세포 용해물에서 준비한 750ng의 트립틱 펩타이드 분해물을 프로토콜에 설명된 대로 벌크 ReproSil-Pur 120 C18-AQ 입자로 사내에서 충전된 25cm 길이, 75μm ID 용융 실리카 모세관을 사용하여 온라인으로 분획화했습니다. 샘플 로딩 전에, 컬럼을 아세토니트릴, 이소프로판올 및H2O의 혼합물 6μL를 6:2:2의 비율로 세척하고 완충?...
현대의 단백질체학 전략은 복잡한 생물학적 시스템을 효과적으로 분석하기 위해 고품질 크로마토그래피 분리에 의존합니다. 따라서 고성능의 비용 효율적인 나노플로우 LC 컬럼은 단일 워크플로우에서 수천 개의 단백질을 특성화하는 것을 목표로 하는 성공적인 탠덤 질량 분석 체제의 중요한 구성 요소입니다.
이 연구에서는 위에서 설명한 프로토?...
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이 작업은 J.A.W.에 대한 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 GM089778의 지원을 받았습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
99.99% Formamide acid | Sigma-Aldrich | for making frit | |
alcohol lamp | Any brand | For providing heat | |
Brechbuehler helium pressure cell | BioSurplus | for packing column | |
Ceramic column cutter | Any brand | for cutting silica capillary | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99% | Sigma-Aldrich | Stored in a flammable cabinet | |
Formamide ≥99.5% | Sigma-Aldrich | for making frit | |
Hydrofluoric acid (HF) (50%) | Fisher Scientific | for opening the emitter after polymerization | |
KASIL (Potassium Silicate Solution) | PQ Corporation | for making frit | |
Orbitrap Fusion Lumos | Thermo Fisher Scientific | for MS data acquisition | |
P2000 Laser Puller | Sutter | for pulling capillary | |
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting | Chromre | 214104 | For bomb setting |
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g | Dr. Masch GmbH | r119.aq.0001 | Batch 5910 |
Soldering | Any brand | For initiating polimerization | |
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT | Swagelok | SS-4-HCG | for bomb setting |
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD | MOLEX/Polymicro | 1068150019 | For column tubing |
Ultimate 3000 UHPLC | Dionex | HPLC type |
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