A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
כאן, אנו מציגים ומעריכים פרוטוקול ליצירת עמודות כרומטוגרפיה נוזלית ננו-זרימה הפוכה בעלות נמוכה לאפיון פפטידים באמצעות זרימות עבודה פרוטאומיות LC-MS/MS.
המורכבות הגבוהה הרווחת בדגימות ביולוגיות דורשת הפרדות כרומטוגרפיות בעלות רגישות ורזולוציה גבוהות כדי לנתח ביעילות. כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק, ניתן לשחזור וזול להכנת עמודות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (RP-HPLC) בשלב הפוך-זרימה ננומטרית להפרדה מקוונת של פפטידים אנליטיים לפני החדרה וזיהוי על ידי ספקטרומטר מסה בתהליכי עבודה מסורתיים של פרוטאומיקה מלמטה למעלה. בהתאם למטרת הניסוי ולתכונות הכימיות של האנליטים המופרדים, פרמטרי העמודה האופטימליים עשויים להיות שונים בקוטר הפנימי או החיצוני שלהם, אורך, גודל חלקיקים, גודל נקבוביות, כימיה של חלקיקי פאזה נייחים ונוכחות או היעדר פולט אלקטרוספריי משולב בקצה. מערכת אריזת עמודים פנימית לא רק מאפשרת ייצור מהיר של עמודים עם המאפיינים הרצויים אלא גם מפחיתה באופן דרמטי את עלות התהליך. הפרוטוקול האופטימלי לאריזת עמודת סיליקה מותכת C18 AQ (מימית) הנדון כאן תואם למגוון רחב של מכשירים כרומטוגרפיים נוזליים להשגת הפרדה יעילה של אנליטים.
עמודות HPLC תרמו רבות לפרודוקטיביות בתחומי המחקר התרופתי, הרפואי והסביבתי 1,2,3,4. גישה לעמודות כרומטוגרפיה איכותיות היא צעד מרכזי בפיצול של אנליטים מורכבים. בפרוטאומיקה של רובה ציד, רגישות אנליטית גבוהה מושגת באופן שגרתי על ידי צימוד ספקטרומטריית מסה (MS) של יינון אלקטרו-ספריי (ESI) לכרומטוגרפיה של ננו-זרימה 5,6,7,8. ההפרדה היעילה של אלפי פפטידים היא בעלת חשיבות עליונה ביישום זה מכיוון שהיא מאפשרת לספקטרומטר המסה לזהות ולכמת אנליטים בעלי רגישות ורזולוציה גבוהים.
תחום אריזת העמודות ליישומים ספקטרומטריים של מסה חווה צמיחה אדירה בשנים האחרונות עם התקדמות בהבנת עקרונות אריזת העמודות הבסיסיים הקשורים למורפולוגיה של פאזה נייחת, אינטראקציות ממס-חלקיקים ותכנון חומרה, מה שמאפשר אפיון מפורט של מגוון רחב של ביומולקולות בסביבות ביולוגיות מורכבות 9,10,11,12,13,14 . מאמצים המדגישים שיקולים מעשיים באריזת עמודות אנליטיות למטרות LC-MS סללו את הדרך למעבדות פרוטאומיות לפתח מערכות אריזה פנימיות כדי לענות על האינטרסים הספציפיים שלהן עם הבטחה לביצועים מקסימליים 15,16,17,18.
עמודות ננו-ספריי בקטרים פנימיים בטווח של 50-150 מיקרומטר וקצוות מחודדים מתאימים היטב למטרת יינון אלקטרו-ספריי. בתחום פרוטאומיקה של רובה ציד, ההפרדות מתבצעות בדרך כלל באמצעות שיפוע ממס הזורם דרך פאזה נייחת לא קוטבית ארוזה, לרוב סיליקה מלוכדת שרשרת פחמן הידרופובית (C8-C30) עם גדלי חלקיקים המשתנים בין 1.7 ל-3.5 מיקרומטר 19,20,21,22. האנליטים הנפלטים נפלטים דרך פולט ESI המשולב בתוך העמודה, מה שמבטיח יינון רך של אנליטי פאזת התמיסה ליונים גזיים. צימוד עמודות LC עם ESI-MS קידם משמעותית את היישום של ספקטרומטריית מסה טנדם לאסטרטגיות פרוטאומיות במדעים ביו-רפואיים.
עמודות LC בקטרים פנימיים צרים מביאות לפסגות כרומטוגרפיות צרות יותר ורגישות גבוהה יותר ביחס לעמודות מיקרו-זרימה גבוהות יותר ולכן הן יתרון במיוחד עם זרימות עבודה פרוטאומיות. למרות שעמודי LC ארוזים מראש זמינים מסחרית הם אפשרויות אטרקטיביות בשל הנוחות וקלות השימוש שלהם, הם יכולים להיות יקרים מאוד ופחות גמישים מאשר אפשרויות פנימיות. מטרת עבודה זו היא לתאר גישת אריזת slurry פשוטה מבחינה טכנית ובעלות נמוכה להכנת עמודי HPLC בשלב הפוך בקוטר פנימי צר באמצעות נימי סיליקה מותכים ומערכת פצצת לחץ מובנית ליישומים פרוטאומיים.
1. הכנת קצה הנימים
2. פילמור/תחריט של הקצה
3. הכנת שלב נייח
4. אריזת העמודה בשלב נייח
5. גימור העמוד והכנת הפריט האחורי
כדי להעריך את ביצועי העמודות, 750 ננוגרם של עיכול פפטיד טריפטי שהוכנו מליזאטים של תאים שלמים של תאי HEK293 חולקו באופן מקוון באמצעות נימי סיליקה מותכים באורך 25 ס"מ ו-75 מיקרומטר ID ארוזים בתוך הבית עם חלקיקי ReproSil-Pur 120 C18-AQ בתפזורת כמתואר בפרוטוקול. לפני טעינת הדגימה, העמודה נשטפה...
אסטרטגיות פרוטאומיות מודרניות מסתמכות על הפרדות כרומטוגרפיות באיכות גבוהה כדי לנתח ביעילות מערכות ביולוגיות מורכבות. לפיכך, עמודות LC ננו-זרימה בעלות ביצועים גבוהים וחסכוניות הן מרכיבים חיוניים במשטר ספקטרומטריית מסה טנדם מוצלח שמטרתו לאפיין אלפי חלבונים בזרימת עבוד?...
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי GM089778 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות ל-J.A.W.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
99.99% Formamide acid | Sigma-Aldrich | for making frit | |
alcohol lamp | Any brand | For providing heat | |
Brechbuehler helium pressure cell | BioSurplus | for packing column | |
Ceramic column cutter | Any brand | for cutting silica capillary | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99% | Sigma-Aldrich | Stored in a flammable cabinet | |
Formamide ≥99.5% | Sigma-Aldrich | for making frit | |
Hydrofluoric acid (HF) (50%) | Fisher Scientific | for opening the emitter after polymerization | |
KASIL (Potassium Silicate Solution) | PQ Corporation | for making frit | |
Orbitrap Fusion Lumos | Thermo Fisher Scientific | for MS data acquisition | |
P2000 Laser Puller | Sutter | for pulling capillary | |
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting | Chromre | 214104 | For bomb setting |
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g | Dr. Masch GmbH | r119.aq.0001 | Batch 5910 |
Soldering | Any brand | For initiating polimerization | |
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT | Swagelok | SS-4-HCG | for bomb setting |
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD | MOLEX/Polymicro | 1068150019 | For column tubing |
Ultimate 3000 UHPLC | Dionex | HPLC type |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved