JoVE Logo

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים ומעריכים פרוטוקול ליצירת עמודות כרומטוגרפיה נוזלית ננו-זרימה הפוכה בעלות נמוכה לאפיון פפטידים באמצעות זרימות עבודה פרוטאומיות LC-MS/MS.

Abstract

המורכבות הגבוהה הרווחת בדגימות ביולוגיות דורשת הפרדות כרומטוגרפיות בעלות רגישות ורזולוציה גבוהות כדי לנתח ביעילות. כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק, ניתן לשחזור וזול להכנת עמודות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (RP-HPLC) בשלב הפוך-זרימה ננומטרית להפרדה מקוונת של פפטידים אנליטיים לפני החדרה וזיהוי על ידי ספקטרומטר מסה בתהליכי עבודה מסורתיים של פרוטאומיקה מלמטה למעלה. בהתאם למטרת הניסוי ולתכונות הכימיות של האנליטים המופרדים, פרמטרי העמודה האופטימליים עשויים להיות שונים בקוטר הפנימי או החיצוני שלהם, אורך, גודל חלקיקים, גודל נקבוביות, כימיה של חלקיקי פאזה נייחים ונוכחות או היעדר פולט אלקטרוספריי משולב בקצה. מערכת אריזת עמודים פנימית לא רק מאפשרת ייצור מהיר של עמודים עם המאפיינים הרצויים אלא גם מפחיתה באופן דרמטי את עלות התהליך. הפרוטוקול האופטימלי לאריזת עמודת סיליקה מותכת C18 AQ (מימית) הנדון כאן תואם למגוון רחב של מכשירים כרומטוגרפיים נוזליים להשגת הפרדה יעילה של אנליטים.

Introduction

עמודות HPLC תרמו רבות לפרודוקטיביות בתחומי המחקר התרופתי, הרפואי והסביבתי 1,2,3,4. גישה לעמודות כרומטוגרפיה איכותיות היא צעד מרכזי בפיצול של אנליטים מורכבים. בפרוטאומיקה של רובה ציד, רגישות אנליטית גבוהה מושגת באופן שגרתי על ידי צימוד ספקטרומטריית מסה (MS) של יינון אלקטרו-ספריי (ESI) לכרומטוגרפיה של ננו-זרימה 5,6,7,8. ההפרדה היעילה של אלפי פפטידים היא בעלת חשיבות עליונה ביישום זה מכיוון שהיא מאפשרת לספקטרומטר המסה לזהות ולכמת אנליטים בעלי רגישות ורזולוציה גבוהים.

תחום אריזת העמודות ליישומים ספקטרומטריים של מסה חווה צמיחה אדירה בשנים האחרונות עם התקדמות בהבנת עקרונות אריזת העמודות הבסיסיים הקשורים למורפולוגיה של פאזה נייחת, אינטראקציות ממס-חלקיקים ותכנון חומרה, מה שמאפשר אפיון מפורט של מגוון רחב של ביומולקולות בסביבות ביולוגיות מורכבות 9,10,11,12,13,14 . מאמצים המדגישים שיקולים מעשיים באריזת עמודות אנליטיות למטרות LC-MS סללו את הדרך למעבדות פרוטאומיות לפתח מערכות אריזה פנימיות כדי לענות על האינטרסים הספציפיים שלהן עם הבטחה לביצועים מקסימליים 15,16,17,18.

עמודות ננו-ספריי בקטרים פנימיים בטווח של 50-150 מיקרומטר וקצוות מחודדים מתאימים היטב למטרת יינון אלקטרו-ספריי. בתחום פרוטאומיקה של רובה ציד, ההפרדות מתבצעות בדרך כלל באמצעות שיפוע ממס הזורם דרך פאזה נייחת לא קוטבית ארוזה, לרוב סיליקה מלוכדת שרשרת פחמן הידרופובית (C8-C30) עם גדלי חלקיקים המשתנים בין 1.7 ל-3.5 מיקרומטר 19,20,21,22. האנליטים הנפלטים נפלטים דרך פולט ESI המשולב בתוך העמודה, מה שמבטיח יינון רך של אנליטי פאזת התמיסה ליונים גזיים. צימוד עמודות LC עם ESI-MS קידם משמעותית את היישום של ספקטרומטריית מסה טנדם לאסטרטגיות פרוטאומיות במדעים ביו-רפואיים.

עמודות LC בקטרים פנימיים צרים מביאות לפסגות כרומטוגרפיות צרות יותר ורגישות גבוהה יותר ביחס לעמודות מיקרו-זרימה גבוהות יותר ולכן הן יתרון במיוחד עם זרימות עבודה פרוטאומיות. למרות שעמודי LC ארוזים מראש זמינים מסחרית הם אפשרויות אטרקטיביות בשל הנוחות וקלות השימוש שלהם, הם יכולים להיות יקרים מאוד ופחות גמישים מאשר אפשרויות פנימיות. מטרת עבודה זו היא לתאר גישת אריזת slurry פשוטה מבחינה טכנית ובעלות נמוכה להכנת עמודי HPLC בשלב הפוך בקוטר פנימי צר באמצעות נימי סיליקה מותכים ומערכת פצצת לחץ מובנית ליישומים פרוטאומיים.

Protocol

1. הכנת קצה הנימים

  1. בעזרת אבן חיתוך קרמית חותכים כ-60-70 ס"מ של נימי סיליקה התמזגו מצופים פולימיד בקוטר פנימי (ID) של 75 מיקרומטר וקוטר חיצוני (OD) של 360 מיקרומטר.
  2. החזיקו את הנימים בידיים בערך באמצע אורכו, השאירו רווח של 4-5 ס"מ בין האצבעות וחממו את האזור בפער תוך כדי סיבובו מעל להבת מנורת אלכוהול. יש לנקות את האזור השרוף באמצעות רקמת מוך נמוכה ספוגה במתנול עד שהזכוכית נראית לעין. (איור 1).
    הערה: יש לחשוף וללטש 4-5 ס"מ של נימי הסיליקה המצופים בפולימיד לפני שניתן יהיה לטעון אותו לתוך מושך הלייזר.
  3. על מנת למשוך פולט בצורת חרוט עבור ESI, השתמש במושך קצה לייזר עם הגדרות תוכנית מיוחדות של ערך חום של 300 (שווה ערך ל-2 וואט של הספק לייזר), מהירות של 10 (שווה ערך ל-0.25 מ"מ לשנייה) ועיכוב של 180 מילישניות על מנת לקבל קצה בקוטר ~1-5 מיקרומטר (איור 2 ואיור 3A). טען את החלק המלוטש של הנימים לתוך מושך הלייזר ולחץ על משיכה, וכתוצאה מכך שני עמודים נימיים ריקים מוכנים לאריזה.
    הערה: בדיקה תכופה של הקצה בכל שלב נעשית באמצעות מיקרוסקופ. סביר להניח שההגדרות יהיו שונות בין מושכי לייזר ויהיה צורך לקבוע אותן באופן אמפירי.

2. פילמור/תחריט של הקצה

  1. על מנת לשמור על חלקיקי הפאזה הנייחים בצינור הנימים, הכינו פריט נקבובי מתערובת של שתי תמיסות אשלגן סיליקט ופורממיד. מכינים את התמיסה מיד לפני השימוש בשפופרת של 2 מ"ל ומערבבים בעזרת מערבולת.
    1. מערבבים שתי תמיסות אשלגן סיליקט עם יחס SiO2/K2O של 2.50 (w/w), ו-1.65 (w/w) ופורממיד ביחס של 1:3:1 (v/v/v), בהתאמה. לדוגמה, מערבבים 100 מיקרוליטר של אשלגן סיליקט עם יחס SiO2/K2O של 2.50 (w/w), 300 מיקרוליטר אשלגן סיליקט עם יחס SiO2/K2O של 1.65 (w/w)), ו-100 מיקרוליטר של פורממיד ואחריו מערבולת. תמיסה זו תתפלמר בחימום ותייצר פריט נקבובי.
  2. טבלו את קצה הנימים הנמשכים בלייזר במשקה האם השקוף של מתלה הפריט (לא המשקעים) למשך כ-10-20 שניות, מה שמאפשר לו לחדור כ-5 מ"מ לקצה על ידי פעולה נימית. בהתאם לרוחב הקצה, ייתכן שתידרש שמירה על הקצה שקוע זמן רב יותר בתמיסת הפריט. בדרך כלל, זמן הטבילה קצר יותר אם הקצה רחב יותר מכיוון שהתמיסה יכולה להיכנס לקצה מהר יותר.
  3. הנח מלחם חם (מוגדר על 350 מעלות צלזיוס) לאורך הקצה כדי ליזום את הפילמור של תמיסת הפריט תוך בדיקת הנימים תחת המיקרוסקופ. אנא עיין באיור 3 כדי לראות את הקצה הנמשך לפני (איור 3A) ואחרי פילמור (איור 3B).
  4. כדי למנוע חסימה של הפולט לאחר פילמור פריט, טבלו את קצה העמוד בתמיסה של 50% חומצה הידרופלואורית (HF) למשך 5 דקות (ההגדרה מודגמת באיור 4). תחריט HF גם מעניק גיאומטריה שטוחה בצורת חרוט לעמוד ומגדיל את אורך חייו. לאחר תחריט HF, ודא שקצה העמוד נשטף היטב, תחילה עם מנטרל HF ולאחר מכן בנדיבות עם מים כדי להגן מפני מגע עם החומצה.
    זהירות: HF הוא כימיקל מסוכן ומאכל ביותר. מומלץ לנקוט משנה זהירות בזמן הטיפול כדי למנוע חשיפה. ודא ש-HF מטופל בכל עת עם הגנה מתאימה בתוך מכסה אדים המזוהה עם שלט המציין "סכנה! רעלים חריפים".
    1. למען הבטיחות, השתמש במעילי מעבדה רגילים ואנטי דליקים, בנוסף לשכבות כפולות של כפפות ניטריל וניאופרן, תוך כדי טיפול ב-HF.
      הערה: זה אופציונלי לפריט טיפים נימיים; עם זאת, זה הופך את העמוד לעמיד יותר בפני סתימה באופן משמעותי ומגדיל את אורך חייו. עמודי נימי סיליקה מותכים ריקים עם פולט אלקטרוספריי משולב זמינים מסחרית וניתן להשתמש בהם להחלפת שלבים 1 ו-2 במידת הצורך.

3. הכנת שלב נייח

  1. השעו 25-50 מ"ג של חלקיקי סיליקה ReproSil-Pur 120 C18-AQ נקבוביים לחלוטין עם גודל חלקיקים של 1.9 מיקרומטר וגודל נקבוביות של 120 Å ב-300 מיקרוליטר מתנול. צנרת למעלה ולמטה כ-20 פעמים כדי להבטיח תערובת הומוגנית של חלקיקי התרחיץ במתנול.
  2. הנח את הצינור המכיל תרחיף slurry בתוך תא תא הלחץ של מערכת פצצות אריזת עמודים מובנית בבית, אשר בתורה מוגדרת על גבי מערבל מגנטי המאפשר לחלקיקי התרחיץ להישאר בתרחיף. חבר את הפצצה למיכל הליום (<1500 psi) הפועל בלחץ קבוע כדי למנוע הפרעה לתמיסת HPLC במהלך האריזה. (סכמטי מיוצג באיור 5).
  3. אבטח את המכסה של תא הלחץ על ידי הידוקו למקומו עם הברגים כפי שמוצג באיור 6A.
    הערה: חשוב להעריך את ההבדל בפעולה של משאבת HPLC ופצצת אריזה HPLC. בעוד שהראשון נועד לפעול בקצב זרימה קבוע ללא קשר ללחץ האחורי המופעל על ידי הפאזה הנייחת בעמודה, מערכות לחץ האריזה של HPLC פועלות בלחץ קבוע כדי להבטיח אריזה רציפה וצפופה של חלקיקי הפאזה הנייחים לאורך העמוד הנימים.

4. אריזת העמודה בשלב נייח

  1. השחילו תחילה את תחתית העמוד (קצה פתוח לא מקושט) דרך האביזר הצמוד לאצבעות בחלק העליון של פצצת הלחץ כך שקצה העמוד יצביע כלפי מעלה. דחוף את העמוד עד שהוא נוגע בבסיס הבקבוקון המכיל slurry ומשוך אותו 1-2 מ"מ מעל הבסיס. הדק את האביזר האטום לאצבעות כדי לאבטח את העמוד במקומו.
  2. חבר את פצצת האריזה למיכל גז הליום (לחץ מומלץ < 1500 psi) והפעל אותו ללחץ של ~ 1300 psi. גז ההליום נכנס לתא הלחץ המאכלס את הבקבוקון המכיל slurry דרך שסתום תלת כיווני. פתח את השסתום על ידי סיבובו האיטי ב-180 מעלות בכיוון השעון.
    הערה: ברגע שגז ההליום מתחיל לזרום בתוך החדר, הוא דוחף את התרחיץ מהצינור לתוך הנימים. כאשר התרחיץ עובר דרך העמודה, החלקיקים נשמרים בנימים בעוד שהממס יוצר טיפת נוזל בקצה העמוד (איור 6B).
    1. אם היווצרות טיפת הנוזל בקצה העמוד מתעכבת, הבהבו במהירות את הקצה כדי לוודא שהוא פתוח. בשלב זה, מקור אור הממוקם מאחורי העמוד יכול לעזור לצפות בהתקדמות תהליך האריזה (איור 7). עבור עמודה עם מזהה של 75 מיקרומטר, בדרך כלל לוקח ~30-60 דקות לארוז אורך של כ-30 ס"מ.
    2. אם זרימת התרחיץ דרך העמוד נעצרת או מאטה, החזק את הנימים בחוזקה מעל ההתאמה ההדוקה של פצצת האריזה ושחרר אותה מעט על ידי סיבוב כרבע סיבוב (ניתן לשמוע צליל שריקה של דיכאון).
      הערה: זה מאפשר למקם מחדש את העמוד ללא צורך בהורדת לחץ מוחלטת של הפצצה.
    3. כעת מקם מחדש בעדינות את העמוד על ידי הזזתו למעלה ולמטה ולאחר מכן הדק מחדש את ההתאמה ההדוקה לאצבעות וודא שהעמוד אינו נוגע בבסיס הבקבוקון. זה מבטיח זרימה אחידה של התרחיץ דרך הנימים בכל עת.
    4. אם האמצעי הנ"ל לא מצליח לחדש את האריזה, סגור את השסתום, אוורר את פצצת האריזה, פתח את המכסה ובדוק את התרחיץ כדי לוודא שאין משקעים. ייתכן גם שקצה העמוד סתום בחלקיקי פאזה נייחים מוצקים, ובמקרה זה, חיתוך אורך קטן מהחלק האחורי של הנימים עשוי לעזור לחדש את הזרימה.
  3. ארוז כמה סנטימטרים מהאורך הרצוי בסוף העמודה כדי להבטיח אריזה מלאה של החלקיקים הנייחים ולמזער את האפשרות להכניס בועות הליום לעמודה הארוזה.

5. גימור העמוד והכנת הפריט האחורי

  1. לאחר השגת אורך האריזה הרצוי, סגור את השסתום הראשי של מיכל גז ההליום, והמתן מינימום של 15 דקות כדי להבטיח אריזה אחידה של העמוד ולאפשר למערכת להוריד לחץ עצמי.
    הערה: על מנת להימנע מהכנסת בועות He כתוצאה מסיליקה התמזגה ריקה בקצה העמודה, מומלץ אורך אריזה ארוך יותר. זה קריטי שתהליך האריזה יימשך גם לאחר שחלק העמוד הנראה לעין נארז כדי לקחת בחשבון את אורך הנימים בתוך תא הלחץ. בנוסף, מומלץ אורך אריזה ארוך יותר במקרים בהם נדרש מיקום חוזר של העמודה מכיוון שהדבר מביא לפחות בועות אוויר ויעילות אריזה גבוהה יותר.
  2. הורידו בעדינות את לחץ התא על ידי סיבוב השסתום 180 מעלות נגד כיוון השעון למקומו המקורי. החזק את העמוד בחוזקה, פתח את הברג האטום והסר את העמוד בהדרגה. שלב זה צריך להיעשות בעדינות רבה כדי למנוע הכנסת בועות אוויר.
  3. חותכים את קצה העמוד לאורך של 25.5 ס"מ. בזמן בדיקה תחת המיקרוסקופ, השתמש במלחם חם בטמפרטורה של 350 מעלות צלזיוס כדי להסיר אורך של 0.5 ס"מ מהשפלה מהקצה האחורי של העמוד.
    1. טבלו את הקצה האחורי של העמוד בתמיסת הפריט שנותרה משלב 2.1 למשך כ-10 שניות ופלמרו אותו על ידי הנחת מלחם חם לאורך החלק האחורי של העמוד תוך כדי בדיקתו מתחת למיקרוסקופ. הפריט האחורי מבטיח שחלקיקי ReproSil-Pur 120 C18-AQ יישארו בעמודה ומונע זרימה חוזרת במהלך שטיפות כרומטוגרפיות.
      הערה: הפריט בחלק האחורי של העמוד הוא גם אופציונלי אך הופך את העמוד לחזק יותר כפי שצוין גם עבור הפריט הקדמי בשלב 2.

תוצאות

כדי להעריך את ביצועי העמודות, 750 ננוגרם של עיכול פפטיד טריפטי שהוכנו מליזאטים של תאים שלמים של תאי HEK293 חולקו באופן מקוון באמצעות נימי סיליקה מותכים באורך 25 ס"מ ו-75 מיקרומטר ID ארוזים בתוך הבית עם חלקיקי ReproSil-Pur 120 C18-AQ בתפזורת כמתואר בפרוטוקול. לפני טעינת הדגימה, העמודה נשטפה...

Discussion

אסטרטגיות פרוטאומיות מודרניות מסתמכות על הפרדות כרומטוגרפיות באיכות גבוהה כדי לנתח ביעילות מערכות ביולוגיות מורכבות. לפיכך, עמודות LC ננו-זרימה בעלות ביצועים גבוהים וחסכוניות הן מרכיבים חיוניים במשטר ספקטרומטריית מסה טנדם מוצלח שמטרתו לאפיין אלפי חלבונים בזרימת עבוד?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי GM089778 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות ל-J.A.W.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
99.99% Formamide acidSigma-Aldrichfor making frit
alcohol lampAny brandFor providing heat
Brechbuehler helium pressure cellBioSurplusfor packing column
Ceramic column cutterAny brandfor cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%Sigma-AldrichStored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%Sigma-Aldrichfor making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)Fisher Scientificfor opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)PQ Corporationfor making frit
Orbitrap Fusion LumosThermo Fisher Scientificfor MS data acquisition
P2000 Laser PullerSutterfor pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube FittingChromre214104For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1gDr. Masch GmbHr119.aq.0001Batch 5910
SolderingAny brandFor initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPTSwagelokSS-4-HCGfor bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µODMOLEX/Polymicro1068150019For column tubing
Ultimate 3000 UHPLCDionexHPLC type

References

  1. Richards, A. L., et al. One-hour proteome analysis in yeast. Nature Protocols. 10 (5), 701-714 (2015).
  2. Shishkova, E., Hebert, A. S., Coon, J. J. Now, More Than Ever, Proteomics Needs Better Chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
  3. D'Atri, V., Fekete, S., Clarke, A., Veuthey, J. L., Guillarme, D. Recent Advances in Chromatography for Pharmaceutical Analysis. Analytical. Chemistry. 91 (1), 210-239 (2019).
  4. Gama, M. R., Collins, C. H., Bottoli, C. B. G. Nano-Liquid Chromatography in Pharmaceutical and Biomedical Research. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 694-703 (2013).
  5. Wilson, S. R., Vehus, T., Berg, H. S., Lundanes, E. Nano-LC in proteomics: recent advances and approaches. Bioanalysis. 7 (14), 1799-1815 (2015).
  6. Wilson, S. R., Olsen, C., Lundanes, E. Nano liquid chromatography columns. Analyst. 144 (24), 7090-7104 (2019).
  7. Cutillas, P. R. Principles of Nanoflow Liquid Chromatography and Applications to Proteomics. Current Nanoscience. 1 (1), 65-71 (2005).
  8. Dams, M., Dores-Sousa, J. L., Lamers, R. J., Treumann, A., Eeltink, S. High-Resolution Nano-Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometric Detection for the Bottom-Up Analysis of Complex Proteomic Samples. Chromatographia. 82 (1), 101-110 (2019).
  9. Stehling, O., et al. MMS19 Assembles Iron-Sulfur Proteins Required for DNA Metabolism and Genomic Integrity. Science. 337 (6091), 195-199 (2012).
  10. Mayank, A. K., et al. An Oxygen-Dependent Interaction between FBXL5 and the CIA-Targeting Complex Regulates Iron Homeostasis. Molecular cell. 75 (2), 282 (2019).
  11. Nie, M., Oravcová, M., Jami-Alahmadi, Y., Wohlschlegel, J. W., Lazzerini-Denchi, E., Boddy, M. N. FAM111A induces nuclear dysfunction in disease and viral restriction. European Molecular Biology Organization. 22 (2), 50803 (2021).
  12. Wahab, M. F., Patel, D. C., Wimalasinghe, R. M., Armstrong, D. W. Fundamental and Practical Insights on the Packing of Modern HighEfficiency Analytical and Capillary Columns. Analytical Chemistry. 89 (16), 8177-8191 (2017).
  13. Blue, L. E., Jorgenson, J. W. 1.1 µm Superficially porous particles for liquid chromatography: Part II: Column packing and chromatographic performance. Journal of Chromatography A. 1380, 71-80 (2015).
  14. Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-High Pressure (>30,000 psi) Packing of Capillary Columns Enhancing Depth of Shotgun Proteomic Analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
  15. Liu, H., Finch, J. W., Lavallee, M. J., Collamati, R. A., Benevides, C. C., Gebler, J. C. Effects of Column Length, Particle Size, Gradient Length and Flow Rate on Peak Capacity of Nano-Scale Liquid Chromatography for Peptide Separations. Journal of Chromatography A. 1147 (1), 30-36 (2007).
  16. Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A., , FlashPack. Fast and Simple Preparation of Ultrahigh-performance Capillary Columns for LC-MS. Molecular and cellular proteomics. 18 (2), 383-390 (2019).
  17. Capriotti, F., Leonardis, I., Cappiello, A., Famiglini, G., Palma, P. A Fast and Effective Method for Packing Nano-LC Columns with Solid-Core Nano Particles Based on the Synergic Effect of Temperature, Slurry Composition, Sonication and Pressure. Chromatographia. 76, 1079-1086 (2013).
  18. Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of High SlurryConcentration and Sonication to Pack High-Efficiency, Meter-Long Capillary Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography Columns. Journal of Chromatography A. 1462, 165-169 (2016).
  19. Pesek, J. J., Matyska, M. T. Our favorite materials: Silica hydride stationary phases. Journal of Separation Science. 32 (23), 3999-4011 (2009).
  20. Borges, E. M., Volmer, D. A. Silica, Hybrid Silica, hydride Silica and Non-Silica Stationary Phases for Liquid Chromatography. Part II: Chemical and Thermal Stability. Journal of Chromatographic Science. 53 (7), 580-597 (2015).
  21. Vyňuchalová, K., Jandera, P. Comparison of a C30 Bonded Silica Column and Columns with Shorter Bonded Ligands in Reversed-Phase LC. Chromatographia. 78 (13-14), 861-871 (2015).
  22. Novotny, M. V. Development of capillary liquid chromatography: A personal perspective. Journal of Chromatography A. 1523, 3-16 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RP HPLCC18 AQ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved