一种用于填充高分辨率 C18 RP-nano-HPLC 色谱柱的稳定方法

摘要

在这里，我们提出并评估了一种使用 LC-MS/MS 蛋白质组学工作流程制备用于肽表征的低成本反相纳流液相色谱柱的方案。

摘要

生物样品中普遍存在高度复杂性，因此需要具有高灵敏度和分离度的色谱分离才能进行有效分析。在这里，我们介绍了一种稳定、可重现且廉价的方案，用于制备纳流反相高效液相色谱 （RP-HPLC） 色谱柱，用于在传统的自下而上的蛋白质组学工作流程中引入质谱仪并由质谱仪检测之前在线分离分析肽。根据实验目标和被分离分析物的化学性质，最佳色谱柱参数可能在内径或外径、长度、粒径、孔径、固定相颗粒的化学性质以及尖端有无集成电喷雾发射器方面有所不同。内部塔填充系统不仅可以快速制造具有所需特性的塔，还可以显著降低工艺成本。本文讨论的 C18 AQ（水性）熔融石英色谱柱填充优化方案与多种液相色谱仪器兼容，可实现分析物的有效分离。

引言

HPLC 色谱柱为制药、医学和环境研究领域的生产力做出了巨大贡献 1,2,3,4。获得高质量的色谱柱是复杂分析物分离的关键步骤。在鸟枪法蛋白质组学中，通常通过将电喷雾电离 （ESI） 质谱 （MS） 与纳流色谱法相结合来实现高分析灵敏度 5,6,7,8。在此应用中，数千种肽的高效分离至关重要，因为它使质谱仪能够以高灵敏度和分辨率识别和定量分析物。

近年来，随着对固定相形态、溶剂-颗粒相互作用和硬件设计相关基本色谱柱填充原理的理解取得进展，质谱应用的色谱柱填充领域取得了长足的发展，使得在复杂生物环境中对各种生物分子进行详细表征成为可能 9,10,11,12,13,14 。蛋白质组学实验室在为 LC-MS 填料分析柱时强调的实际考虑因素，为蛋白质组学实验室开发内部填料系统铺平了道路，以满足其特定利益，并承诺实现最佳性能 15,16,17,18。

内径为 50-150 μm 且末端为锥形的纳喷雾色谱柱非常适合电喷雾电离。在鸟枪法蛋白质组学领域，通常使用流经填充非极性固定相的溶剂梯度进行分离，最常见的是疏水性碳链键合二氧化硅 （C8-C30），粒径在 1.7 至 3.5 μm^之间 19,20,21,22。洗脱分析物通过集成在色谱柱内的 ESI 发射器发射，确保液相分析物软电离为气态离子。液相色谱柱与 ESI-MS 联用显著推动了串联质谱在生物医学科学中蛋白质组学策略中的应用。

与大孔径微流色谱柱相比，内径较窄的液相色谱柱可产生更窄的色谱峰和更高的灵敏度，因此在蛋白质组学工作流程中特别有利。尽管市售的预装液相色谱柱因其便利性和易用性而成为有吸引力的选择，但它们可能非常昂贵且不如内部选项灵活。这项工作的目标是描述一种技术简单且低成本的浆料填充方法，以使用熔融石英毛细管和内部构建的压力炸弹系统制备窄内径反相 HPLC 色谱柱，用于蛋白质组学应用。

研究方案

1. 毛细管尖端的准备

1. 使用陶瓷劈裂石，切割约 60-70 cm 的聚酰亚胺涂层熔融石英毛细管，内径 （ID） 为 75 μm，外径 （OD） 为 360 μm。
2. 用手握住毛细管大约在其长度的中间位置，在手指之间留出 4-5 厘米的间隙，并加热间隙中的区域，同时在酒精灯的火焰上旋转毛细管。使用浸有甲醇的低绒纸巾将烧伤区域擦干净，直到看到玻璃。（图 1）。
   注意：4-5 cm 的聚酰亚胺涂层熔融石英毛细管需要曝光和抛光，然后才能装入激光拉拔器。
3. 为了拉动用于 ESI 的锥形发射器，请使用具有特殊程序设置的激光针尖拉拔器，热值为 300（相当于 2 瓦的激光功率），速度为 10（相当于 0.25 mm/s）和 180 毫秒的延迟，以获得 ~1-5 μm 直径的尖端（图 2 和 图 3A）。将毛细管的抛光部分装入激光拉拔器中，然后按下拉，得到两个空的毛细管柱，即可填充。
   注意：在任何步骤中，都使用显微镜对尖端进行频繁检查。激光拉拔器之间的设置可能会有所不同，需要根据经验确定。

2. 尖端的聚合/蚀刻

1. 为了将固定相颗粒保留在毛细管中，从两种硅酸钾溶液和甲酰胺的混合物中制备多孔筛板。在 2 mL 试管中使用前立即制备溶液，并使用涡旋混合。
   1. 将两种硅酸钾溶液以 SiO₂/K₂O 比率为 2.50 （w/w） 和 1.65 （w/w） 和甲酰胺分别以 1：3：1 （v/v/v） 的比例混合。例如，将 100 μL 硅酸钾与 SiO₂/K₂O 比率为 2.50 （w/w） 混合，将 300 μL 硅酸钾与 SiO₂/K₂O 比率为 1.65 （w/w）） 混合，与 100 μL 甲酰胺混合，然后涡旋混合。该溶液在加热时会聚合并产生多孔熔块。
2. 将激光拉动的毛细管尖端浸入筛板悬浮液的透明母液（不是沉淀物）中约 10-20 秒，使其通过毛细管作用渗透到尖端中约 5 mm。根据吸头的宽度，可能需要使吸头在筛板溶液中浸入更长时间。通常，如果吸头较宽，则浸渍时间会更短，因为溶液可以更快地进入吸头。
3. 沿尖端放置热烙铁（设置为 350 °F），以启动熔块溶液的聚合，同时在显微镜下检查毛细管。请参阅 图 3 以查看聚合之前（图 3A）和之后（图 3B）的拉头。
4. 为防止熔块聚合后喷针堵塞，将色谱柱尖端浸入 50% 氢氟酸 （HF） 溶液中 5 分钟（设置如图 4 所示）。HF 蚀刻还赋予色谱柱平坦的锥形几何形状，延长其使用寿命。HF 蚀刻后，确保彻底清洗色谱柱的尖端，先用 HF 中和剂清洗，然后用水清洗，以防止与酸接触。
   注意：HF 是一种高度危险和腐蚀性的化学品。建议在处理时格外小心，以防止暴露。确保在通风橱内始终处理 HF，并采取适当的保护措施，通风橱上标有“危险！急性毒素”。
   1. 为了安全起见，在处理 HF 时，除了双层丁腈和氯丁橡胶手套外，还应使用普通和易燃的实验室外套。
      注意：筛板毛细管尖端是可选的;然而，它使色谱柱的抗堵塞能力显著提高，并延长了其使用寿命。带有集成电喷雾发射器的空熔融石英毛细管柱现已上市，如果需要，可用于替代步骤 1 和 2。

3. 固定相的制备

1. 在 300 μL 甲醇中悬浮 25-50 mg 粒径为 1.9 μm 、孔径为 120 Å 的全多孔 ReproSil-Pur 120 C18-AQ 二氧化硅颗粒。上下吹打约 20 次，以确保浆料颗粒在甲醇中的均匀混合。
2. 将含有浆液悬浮液的试管放入内部构建的柱式填料弹系统的压力池室中，该系统又安装在磁力搅拌器顶部，使浆液颗粒保持悬浮状态。将炸弹连接到氦气罐 （<1500 psi），氦气罐在恒定压力下运行，以避免在填充过程中破坏 HPLC 浆液。（示意图如图 5 所示）。
3. 用螺栓将压力传感器的盖子拧紧到位，以固定压力传感器的盖子，如图 6A 所示。
   注：了解 HPLC 泵和 HPLC 填料炸弹的作差异非常重要。前者设计为在恒定流速下运行，而与色谱柱中固定相施加的背压无关，而 HPLC 填料压力系统在恒定压力下运行，以确保固定相颗粒在整个毛细管柱长度上不间断和密集地填充。

4. 用固定相填充色谱柱

1. 首先将色谱柱底部（未熔块的开口端）穿过压力弹顶部的手紧接头，使色谱柱的尖端朝上。将色谱柱推入，直到它接触到含有浆液的小瓶的底部，然后将其缩回底部上方 1-2 mm。拧紧手拧接头以将色谱柱固定到位。
2. 将包装弹连接到氦气罐（建议压力< 1500 psi）并将其打开至 ~ 1300 psi 的压力。氦气通过三通阀进入装有浆料的小瓶的压力单元。顺时针缓慢旋转 180° 打开阀门。
   注意：一旦氦气开始在腔室内流动，它就会将浆料从管中推入毛细管。当浆液通过色谱柱时，颗粒保留在毛细管中，而溶剂在色谱柱尖端形成液滴（图 6B）。
   1. 如果色谱柱吸头上液滴的形成延迟，请快速点燃吸头以确保其打开。在此阶段，放置在色谱柱后面的光源可以帮助观察填充过程的进度（图 7）。对于内径为 75 μm 的色谱柱，通常需要 ~30-60 分钟才能填充约 30 cm 的长度。
   2. 如果浆液流经塔的流动停止或减慢，请将毛细管紧紧地压在填料弹的手紧接头上方，然后转动约四分之一圈将其稍微松开（可能会听到减压的嘶嘶声）。
      注意：这允许重新定位柱子，而无需完全给炸弹减压。
   3. 现在，通过上下移动色谱柱轻轻地重新定位色谱柱，然后重新拧紧手拧接头，确保色谱柱没有接触样品瓶的底部。这确保了浆料始终均匀地流过毛细管。
   4. 如果上述措施无法恢复填充，请关闭阀门，放空填充弹，拧开盖子并检查浆料以确保没有沉淀物。色谱柱末端也可能被固体固定相颗粒堵塞，在这种情况下，从毛细管背面切一小段可能有助于恢复流动。
3. 在塔的末端填充比所需长度长几厘米的填充物，以确保固定颗粒的完全填充，并最大限度地减少氦气气泡进入填充柱的可能性。

5. 完成塔子并制作背板

1. 达到所需的填充长度后，关闭氦气罐的主阀，并等待至少 15 分钟，以确保色谱柱的均匀填充并让系统自行减压。
   注：为避免因色谱柱末端的熔融石英为空而引入 He 气泡，建议使用更长的填料长度。即使在肉眼可见的色谱柱部分填充完毕后，也必须继续填充过程，以考虑压力室内毛细管的长度。此外，在需要反复重新定位色谱柱的情况下，建议使用更长的填充长度，因为这样可以减少气泡并提高填充效率。
2. 通过将阀门逆时针旋转 180 度至其原始位置，轻轻地为腔室减压。紧紧握住色谱柱，拧下手拧接头，然后逐渐取下色谱柱。此步骤需要非常轻柔地进行，以避免引入气泡。
3. 将柱子的末端剪成 25.5 cm 的长度。在显微镜下检查时，使用 350 °F 的热烙铁从色谱柱后端去除 0.5 cm 长的浆料。
   1. 将色谱柱后端浸入步骤 2.1 中剩余的筛板溶液中约 10 秒钟，然后在显微镜下检查时沿色谱柱背面放置热烙铁使其聚合。背筛板可确保 ReproSil-Pur 120 C18-AQ 颗粒保留在色谱柱中，并防止色谱清洗过程中回流。
      注：塔后部的筛板也是可选的，但会使塔更加坚固，正如步骤 2 中的前部筛板所指出的那样。

结果

为了评估色谱柱的性能，使用内部填充有散装 ReproSil-Pur 120 C18-AQ 颗粒的 25 cm 长、内径为 75 μm 的熔融石英毛细管，在线分离从 HEK293 细胞的全细胞裂解物制备的 750 ng 胰蛋白酶肽消化物，如实验方案中所述。上样前，使用 6 μL 乙腈、异丙醇和 H₂O 混合物以 6：2：2 的比例洗涤色谱柱，并用缓冲液 A（缓冲液 A：含 3% DMSO 的水）预平衡。使用 70 分钟反相梯度分析胰蛋?...

讨论

现代蛋白质组学策略依赖于高质量的色谱分离来有效分析复杂的生物系统。因此，高性能且经济高效的纳流液相色谱柱是成功的串联质谱体系的关键组成部分，旨在在单个工作流程中表征数千种蛋白质。

在本研究中，我们评估了使用上述方案制备的一系列用于 LC-MS/MS 的液相色谱柱的性能和可靠性。通过使用这些色谱柱对 HEK293 细胞胰蛋白酶消化物进?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
99.99% Formamide acid	Sigma-Aldrich		for making frit
alcohol lamp	Any brand		For providing heat
Brechbuehler helium pressure cell	BioSurplus		for packing column
Ceramic column cutter	Any brand		for cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		Stored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		for making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)	Fisher Scientific		for opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)	PQ Corporation		for making frit
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		for MS data acquisition
P2000 Laser Puller	Sutter		for pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting	Chromre	214104	For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
Soldering	Any brand		For initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT	Swagelok	SS-4-HCG	for bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD	MOLEX/Polymicro	1068150019	For column tubing
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC type