Une méthode robuste pour l’emballage de colonnes C18 RP-nano-HPLC haute résolution

Résumé

Ici, nous présentons et évaluons un protocole permettant de fabriquer des colonnes de chromatographie liquide en nano-flux en phase inverse à faible coût pour la caractérisation peptidique à l’aide de flux de travail protéomiques LC-MS/MS.

Résumé

La grande complexité des échantillons biologiques nécessite des séparations chromatographiques d’une sensibilité et d’une résolution élevées pour être analysées efficacement. Nous présentons ici un protocole robuste, reproductible et peu coûteux pour la préparation d’une colonne de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) nano-flux pour la séparation en ligne de peptides analytiques avant l’introduction et la détection par un spectromètre de masse dans les flux de travail protéomiques ascendants traditionnels. En fonction de l’objectif de l’expérience et des propriétés chimiques des analytes séparés, les paramètres optimaux de la colonne peuvent différer dans leurs diamètres intérieurs ou extérieurs, leur longueur, la taille des particules, la taille des pores, la chimie des particules en phase stationnaire et la présence ou l’absence d’un émetteur d’électrospray intégré à l’extrémité. Un système interne d’emballage de colonnes permet non seulement de fabriquer rapidement des colonnes avec les propriétés souhaitées, mais réduit également considérablement le coût du processus. Le protocole optimisé pour l’emballage d’une colonne de silice fondue C18 AQ (aqueuse) dont il est question ici est compatible avec une large gamme d’instruments de chromatographie en phase liquide pour obtenir une séparation efficace des analytes.

Introduction

Les colonnes HPLC ont énormément contribué à la productivité dans les domaines de la recherche pharmaceutique, médicale et environnementale 1,2,3,4. L’accès à des colonnes de chromatographie de haute qualité est une étape cruciale dans le fractionnement d’analytes complexes. En protéomique canon, une sensibilité analytique élevée est systématiquement obtenue en couplant la spectrométrie de masse (MS) par ionisation par électronébulisation (ESI) à la chromatographie en nanoflux 5,6,7,8. La séparation efficace de milliers de peptides est primordiale dans cette application, car elle permet au spectromètre de masse d’identifier et de quantifier les analytes avec une sensibilité et une résolution élevées.

Le domaine de l’empilement de colonnes pour les applications de spectrométrie de masse a connu une croissance considérable ces dernières années avec des progrès dans la compréhension des principes fondamentaux de l’empilement de colonnes liés à la morphologie de la phase stationnaire, aux interactions solvant-particule et à la conception matérielle, rendant possible la caractérisation détaillée d’un large éventail de biomolécules dans des contextes biologiques complexes 9,10,11,12,13,14 . Les efforts mis en évidence les considérations pratiques dans l’emballage des colonnes analytiques à des fins LC-MS ont ouvert la voie aux laboratoires de protéomique pour développer des systèmes d’emballage internes répondant à leurs intérêts spécifiques avec la promesse de performances maximales 15,16,17,18.

Les colonnes de nanopulvérisation avec des diamètres intérieurs compris entre 50 et 150 μm et des extrémités coniques sont bien adaptées à l’ionisation par électronébulisation. Dans le domaine de la protéomique canon, les séparations sont généralement effectuées à l’aide d’un gradient de solvant s’écoulant à travers une phase stationnaire non polaire garnie, le plus souvent de la silice hydrophobe liée à la chaîne carbonée (C8-C30) avec des tailles de particules variant entre 1,7 et 3,5 μm 19,20,21,22. Les analytes éluants sont émis par un émetteur ESI intégré à la colonne, ce qui assure l’ionisation douce des analytes en phase solution en ions gazeux. Le couplage des colonnes LC avec l’ESI-MS a considérablement fait progresser l’application de la spectrométrie de masse en tandem aux stratégies protéomiques dans les sciences biomédicales.

Les colonnes LC avec des diamètres intérieurs étroits permettent d’obtenir des pics chromatographiques plus étroits et une sensibilité plus élevée par rapport aux colonnes à microflux à alésage plus élevé, et sont donc particulièrement avantageuses pour les flux de travail protéomiques. Bien que les colonnes LC préemballées disponibles dans le commerce soient des options attrayantes en raison de leur commodité et de leur facilité d’utilisation, elles peuvent être d’un coût prohibitif et moins flexibles que les options internes. L’objectif de ce travail est de décrire une approche techniquement simple et peu coûteuse de l’emballage de boue pour préparer des colonnes HPLC en phase inversée de diamètre intérieur étroit à l’aide de capillaires en silice fondue et d’un système de bombe à pression construit en interne pour les applications protéomiques.

Protocole

1. Préparation de l’embout capillaire

1. À l’aide d’une pierre de clivage en céramique, coupez environ 60 à 70 cm d’un capillaire en silice fondue recouvert de polyimide d’un diamètre intérieur (DI) de 75 μm et d’un diamètre extérieur (OD) de 360 μm.
2. Tenez le capillaire avec vos mains à peu près au milieu de sa longueur, en laissant un espace de 4 à 5 cm entre les doigts et chauffez la zone dans l’espace tout en le faisant pivoter sur la flamme d’une lampe à alcool. Polissez la zone brûlée à l’aide d’un mouchoir à faible peluche imbibé de méthanol jusqu’à ce que le verre soit visible. (Figure 1).
   REMARQUE : 4 à 5 cm du capillaire de silice fondue revêtu de polyimide doivent être exposés et polis avant de pouvoir être chargés dans l’extracteur laser.
3. Afin de tirer un émetteur en forme de cône pour ESI, utilisez un extracteur de pointe laser avec des réglages de programme spéciaux d’une valeur thermique de 300 (équivalent de 2 watts de puissance laser), d’une vitesse de 10 (équivalent de 0,25 mm/s) et d’un délai de 180 millisecondes afin d’obtenir une pointe de ~1-5 μm de diamètre (Figure 2 et Figure 3A). Chargez la partie polie du capillaire dans l’extracteur laser et appuyez sur le pull, ce qui permet d’obtenir deux colonnes capillaires vides prêtes à être emballées.
   REMARQUE : L’inspection fréquente de la pointe à n’importe quelle étape est effectuée à l’aide d’un microscope. Les paramètres différeront probablement d’un tireur laser à l’autre et devront être déterminés empiriquement.

2. Polymérisation/gravure de la pointe

1. Afin de retenir les particules de phase stationnaire dans le tube capillaire, préparez une fritte poreuse à partir d’un mélange de deux solutions de silicate de potassium et de formamide. Préparez la solution immédiatement avant l’utilisation dans un tube de 2 mL et mélangez à l’aide d’un vortex.
   1. Mélanger deux solutions de silicate de potassium avec un rapport SiO₂/K₂O de 2,50 (p/p) et 1,65 (p/p) et du formamide dans un rapport de 1:3:1 (v/v/v), respectivement. Par exemple, mélangez 100 μL de silicate de potassium avec un rapport SiO₂/K₂O de 2,50 (p/p), 300 μL de silicate de potassium avec un rapport SiO₂/K₂O de 1,65 (p/p)), et 100 μL de formamide suivi d’un vortex. Cette solution polymérise lorsqu’elle est chauffée et produit une fritte poreuse.
2. Plongez l’embout capillaire tiré au laser dans la liqueur mère claire de la suspension de fritte (pas le précipité) pendant environ 10 à 20 secondes, en lui permettant de pénétrer d’environ 5 mm dans l’embout par capillarité. Selon la largeur de la pointe, il peut être nécessaire de garder la pointe immergée plus longtemps dans la solution de fritte. Généralement, le temps de trempage est plus court si la pointe est plus large, car la solution peut pénétrer plus rapidement dans la pointe.
3. Placez un fer à souder chaud (réglé à 350 °F) le long de la pointe pour initier la polymérisation de la solution de fritte tout en inspectant le capillaire au microscope. Veuillez vous référer à la figure 3 pour voir l’extrémité tirée avant (Figure 3A) et après la polymérisation (Figure 3B).
4. Pour éviter le blocage de l’émetteur après la polymérisation par fritte, immergez l’extrémité de la colonne dans une solution d’acide fluorhydrique (HF) à 50 % pendant 5 minutes (la configuration est illustrée à la figure 4). La gravure HF confère également une géométrie plate en forme de cône à la colonne, augmentant ainsi sa longévité. Après la gravure HF, assurez-vous que la pointe de la colonne est soigneusement lavée, d’abord avec un neutralisant HF, puis généreusement avec de l’eau pour éviter tout contact avec l’acide.
   ATTENTION : Le HF est un produit chimique très dangereux et corrosif. Une extrême prudence est recommandée lors de la manipulation pour éviter l’exposition. Assurez-vous que les HF sont manipulés en tout temps avec une protection appropriée à l’intérieur d’une hotte identifiée par un panneau indiquant « Danger ! toxines aiguës".
   1. Pour plus de sécurité, utilisez des blouses de laboratoire ordinaires et ininflammables, en plus des doubles couches de gants en nitrile et en néoprène, lors de la manipulation des HF.
      REMARQUE : Il est facultatif de fritter les pointes capillaires ; Cependant, il rend la colonne nettement plus résistante au colmatage et augmente sa longévité. Des colonnes capillaires vides en silice fondue avec un émetteur par électronébulisation intégré sont disponibles dans le commerce et peuvent être utilisées pour remplacer les étapes 1 et 2 si nécessaire.

3. Préparation de la phase stationnaire

1. Mettre en suspension 25 à 50 mg de particules de silice ReproSil-Pur 120 C18-AQ entièrement poreuses avec une taille de particule de 1,9 μm et une taille de pores de 120 Å dans 300 μL de méthanol. Pipette de haut en bas environ 20 fois pour assurer un mélange homogène des particules de boue dans le méthanol.
2. Placez le tube contenant la suspension de boue à l’intérieur de la chambre de la cellule de pression d’un système de bombe à garnissage de colonne construit en interne, qui à son tour est installé au sommet d’un agitateur magnétique permettant aux particules de boue de rester en suspension. Connectez la bombe au réservoir d’hélium (<1500 psi) qui fonctionne à pression constante pour éviter de perturber la boue HPLC pendant l’emballage. (Schéma représenté à la figure 5).
3. Fixez le couvercle de la cellule de pression en le serrant en place avec les boulons, comme illustré à la Figure 6A.
   REMARQUE : Il est important d’apprécier la différence de fonctionnement d’une pompe HPLC et d’une bombe d’emballage HPLC. Alors que le premier est conçu pour fonctionner à un débit constant quelle que soit la contre-pression exercée par la phase stationnaire dans la colonne, les systèmes de pression d’emballage HPLC fonctionnent à une pression constante pour assurer un tassement ininterrompu et dense des particules de phase stationnaire sur toute la longueur de la colonne capillaire.

4. Emballage de la colonne avec phase stationnaire

1. Enfilez d’abord le bas de la colonne (extrémité ouverte non frittée) à travers le raccord serré à la main sur le dessus de la bombe à pression de sorte que la pointe de la colonne pointe vers le haut. Poussez la colonne jusqu’à ce qu’elle touche la base du flacon contenant du lisier et rétractez-la de 1 à 2 mm au-dessus de la base. Serrez le raccord étanche à la main pour fixer la colonne en position.
2. Connectez la bombe d’emballage à un réservoir d’hélium (pression recommandée < 1500 psi) et allumez-la à une pression de ~ 1300 psi. L’hélium gazeux pénètre dans la cellule de pression abritant le flacon contenant la boue par une vanne à trois voies. Ouvrez la vanne en la tournant lentement de 180° dans le sens des aiguilles d’une montre.
   REMARQUE : Dès que l’hélium gazeux commence à s’écouler à l’intérieur de la chambre, il pousse la boue du tube dans le capillaire. Lorsque la boue traverse la colonne, les particules sont retenues dans le capillaire tandis que le solvant forme une gouttelette de liquide à l’extrémité de la colonne (Figure 6B).
   1. Si la formation de gouttelettes de liquide sur l’extrémité de la colonne est retardée, allumez rapidement la pointe pour vous assurer qu’elle est ouverte. À ce stade, une source lumineuse placée derrière la colonne peut aider à observer la progression du processus d’emballage (Figure 7). Pour une colonne d’un diamètre intérieur de 75 μm, il faut généralement ~30 à 60 minutes pour emballer une longueur d’environ 30 cm.
   2. Si l’écoulement de la boue à travers la colonne s’arrête ou ralentit, tenez fermement le capillaire au-dessus du raccord étanche à la main de la bombe d’emballage et desserrez-le légèrement en le tournant d’environ un quart de tour (un sifflement de dépressurisation peut être entendu).
      REMARQUE : Cela permet de repositionner la colonne sans avoir besoin de dépressuriser complètement la bombe.
   3. Maintenant, repositionnez doucement la colonne en la déplaçant de haut en bas, puis resserrez le raccord étanche à la main en vous assurant que la colonne ne touche pas la base du flacon. Cela garantit à tout moment un écoulement uniforme du lisier à travers le capillaire.
   4. Si la mesure susmentionnée ne permet pas de reprendre l’emballage, fermez la vanne, ventilez la bombe d’emballage, dévissez le couvercle et inspectez le lisier pour vous assurer qu’il n’y a pas de précipités. Il est également possible que l’extrémité de la colonne soit obstruée par des particules solides en phase stationnaire, auquel cas une coupe d’une petite longueur à partir de l’arrière du capillaire peut aider à reprendre l’écoulement.
3. Emballez quelques centimètres de plus que la longueur souhaitée à l’extrémité de la colonne pour assurer un emballage complet des particules stationnaires et minimiser la possibilité de faire entrer des bulles d’hélium dans la colonne garnie.

5. Finition de la colonne et fabrication du back-frit

1. Une fois que la longueur de garniture souhaitée est atteinte, fermez la vanne principale du réservoir d’hélium et attendez au moins 15 minutes pour assurer un remplissage uniforme de la colonne et permettre au système de s’auto-dépressuriser.
   REMARQUE : Afin d’éviter l’introduction de bulles He à la suite de la silice fondue vide à l’extrémité de la colonne, une longueur de garnissage plus longue est recommandée. Il est essentiel que le processus de garnissage se poursuive même après que la partie de la colonne visible à l’œil nu a été remplie pour tenir compte de la longueur du capillaire à l’intérieur de la chambre de pression. De plus, une longueur de garnissage plus longue est recommandée dans les cas où un repositionnement répété de la colonne est nécessaire, car cela entraîne moins de bulles d’air et une efficacité de pliage plus élevée.
2. Dépressurisez doucement la chambre en tournant la vanne de 180 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à sa position d’origine. Tenez fermement la colonne, dévissez le raccord de serrage à la main et retirez la colonne progressivement. Cette étape doit être effectuée très doucement pour éviter d’introduire des bulles d’air.
3. Coupez l’extrémité de la colonne à une longueur de 25,5 cm. Lors de l’inspection au microscope, utilisez un fer à souder chaud à 350 °F pour retirer une longueur de 0,5 cm de la boue de l’extrémité arrière de la colonne.
   1. Trempez l’extrémité arrière de la colonne dans la solution de fritte restante de l’étape 2.1 pendant environ 10 secondes et polymérisez-la en plaçant un fer à souder chaud le long de l’arrière de la colonne tout en l’inspectant au microscope. La fritte arrière garantit que les particules de ReproSil-Pur 120 C18-AQ restent dans la colonne et empêche le reflux lors des lavages chromatographiques.
      REMARQUE : La fritte à l’arrière de la colonne est également facultative, mais rend la colonne plus robuste, comme cela a également été noté pour la fritte avant à l’étape 2.

Résultats

Pour évaluer les performances des colonnes, 750 ng de digestats de peptides tryptiques préparés à partir de lysats de cellules entières de cellules HEK293 ont été fractionnés en ligne à l’aide d’un capillaire en silice fondue de 25 cm de long et de 75 μm d’ID emballé en interne avec des particules en vrac de ReproSil-Pur 120 C18-AQ, comme décrit dans le protocole. Avant le chargement de l’échantillon, la colonne a été lavée à l’aide de 6 μL d’un mélange d?...

Discussion

Les stratégies protéomiques modernes reposent sur des séparations chromatographiques de haute qualité pour analyser efficacement des systèmes biologiques complexes. Par conséquent, les colonnes LC nanoflow hautes performances et rentables sont des composants cruciaux d’un régime de spectrométrie de masse en tandem réussi visant à caractériser des milliers de protéines en un seul flux de travail.

Dans cette étude, nous avons évalué les performa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
99.99% Formamide acid	Sigma-Aldrich		for making frit
alcohol lamp	Any brand		For providing heat
Brechbuehler helium pressure cell	BioSurplus		for packing column
Ceramic column cutter	Any brand		for cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		Stored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		for making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)	Fisher Scientific		for opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)	PQ Corporation		for making frit
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		for MS data acquisition
P2000 Laser Puller	Sutter		for pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting	Chromre	214104	For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
Soldering	Any brand		For initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT	Swagelok	SS-4-HCG	for bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD	MOLEX/Polymicro	1068150019	For column tubing
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC type