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Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Ici, nous présentons et évaluons un protocole permettant de fabriquer des colonnes de chromatographie liquide en nano-flux en phase inverse à faible coût pour la caractérisation peptidique à l’aide de flux de travail protéomiques LC-MS/MS.
La grande complexité des échantillons biologiques nécessite des séparations chromatographiques d’une sensibilité et d’une résolution élevées pour être analysées efficacement. Nous présentons ici un protocole robuste, reproductible et peu coûteux pour la préparation d’une colonne de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) nano-flux pour la séparation en ligne de peptides analytiques avant l’introduction et la détection par un spectromètre de masse dans les flux de travail protéomiques ascendants traditionnels. En fonction de l’objectif de l’expérience et des propriétés chimiques des analytes séparés, les paramètres optimaux de la colonne peuvent différer dans leurs diamètres intérieurs ou extérieurs, leur longueur, la taille des particules, la taille des pores, la chimie des particules en phase stationnaire et la présence ou l’absence d’un émetteur d’électrospray intégré à l’extrémité. Un système interne d’emballage de colonnes permet non seulement de fabriquer rapidement des colonnes avec les propriétés souhaitées, mais réduit également considérablement le coût du processus. Le protocole optimisé pour l’emballage d’une colonne de silice fondue C18 AQ (aqueuse) dont il est question ici est compatible avec une large gamme d’instruments de chromatographie en phase liquide pour obtenir une séparation efficace des analytes.
Les colonnes HPLC ont énormément contribué à la productivité dans les domaines de la recherche pharmaceutique, médicale et environnementale 1,2,3,4. L’accès à des colonnes de chromatographie de haute qualité est une étape cruciale dans le fractionnement d’analytes complexes. En protéomique canon, une sensibilité analytique élevée est systématiquement obtenue en couplant la spectrométrie de masse (MS) par ionisation par électronébulisation (ESI) à la chromatographie en nanoflux 5,6,7,8. La séparation efficace de milliers de peptides est primordiale dans cette application, car elle permet au spectromètre de masse d’identifier et de quantifier les analytes avec une sensibilité et une résolution élevées.
Le domaine de l’empilement de colonnes pour les applications de spectrométrie de masse a connu une croissance considérable ces dernières années avec des progrès dans la compréhension des principes fondamentaux de l’empilement de colonnes liés à la morphologie de la phase stationnaire, aux interactions solvant-particule et à la conception matérielle, rendant possible la caractérisation détaillée d’un large éventail de biomolécules dans des contextes biologiques complexes 9,10,11,12,13,14 . Les efforts mis en évidence les considérations pratiques dans l’emballage des colonnes analytiques à des fins LC-MS ont ouvert la voie aux laboratoires de protéomique pour développer des systèmes d’emballage internes répondant à leurs intérêts spécifiques avec la promesse de performances maximales 15,16,17,18.
Les colonnes de nanopulvérisation avec des diamètres intérieurs compris entre 50 et 150 μm et des extrémités coniques sont bien adaptées à l’ionisation par électronébulisation. Dans le domaine de la protéomique canon, les séparations sont généralement effectuées à l’aide d’un gradient de solvant s’écoulant à travers une phase stationnaire non polaire garnie, le plus souvent de la silice hydrophobe liée à la chaîne carbonée (C8-C30) avec des tailles de particules variant entre 1,7 et 3,5 μm 19,20,21,22. Les analytes éluants sont émis par un émetteur ESI intégré à la colonne, ce qui assure l’ionisation douce des analytes en phase solution en ions gazeux. Le couplage des colonnes LC avec l’ESI-MS a considérablement fait progresser l’application de la spectrométrie de masse en tandem aux stratégies protéomiques dans les sciences biomédicales.
Les colonnes LC avec des diamètres intérieurs étroits permettent d’obtenir des pics chromatographiques plus étroits et une sensibilité plus élevée par rapport aux colonnes à microflux à alésage plus élevé, et sont donc particulièrement avantageuses pour les flux de travail protéomiques. Bien que les colonnes LC préemballées disponibles dans le commerce soient des options attrayantes en raison de leur commodité et de leur facilité d’utilisation, elles peuvent être d’un coût prohibitif et moins flexibles que les options internes. L’objectif de ce travail est de décrire une approche techniquement simple et peu coûteuse de l’emballage de boue pour préparer des colonnes HPLC en phase inversée de diamètre intérieur étroit à l’aide de capillaires en silice fondue et d’un système de bombe à pression construit en interne pour les applications protéomiques.
1. Préparation de l’embout capillaire
2. Polymérisation/gravure de la pointe
3. Préparation de la phase stationnaire
4. Emballage de la colonne avec phase stationnaire
5. Finition de la colonne et fabrication du back-frit
Pour évaluer les performances des colonnes, 750 ng de digestats de peptides tryptiques préparés à partir de lysats de cellules entières de cellules HEK293 ont été fractionnés en ligne à l’aide d’un capillaire en silice fondue de 25 cm de long et de 75 μm d’ID emballé en interne avec des particules en vrac de ReproSil-Pur 120 C18-AQ, comme décrit dans le protocole. Avant le chargement de l’échantillon, la colonne a été lavée à l’aide de 6 μL d’un mélange d?...
Les stratégies protéomiques modernes reposent sur des séparations chromatographiques de haute qualité pour analyser efficacement des systèmes biologiques complexes. Par conséquent, les colonnes LC nanoflow hautes performances et rentables sont des composants cruciaux d’un régime de spectrométrie de masse en tandem réussi visant à caractériser des milliers de protéines en un seul flux de travail.
Dans cette étude, nous avons évalué les performa...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par la subvention des National Institutes of Health GM089778 à J.A.W.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
99.99% Formamide acid | Sigma-Aldrich | for making frit | |
alcohol lamp | Any brand | For providing heat | |
Brechbuehler helium pressure cell | BioSurplus | for packing column | |
Ceramic column cutter | Any brand | for cutting silica capillary | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99% | Sigma-Aldrich | Stored in a flammable cabinet | |
Formamide ≥99.5% | Sigma-Aldrich | for making frit | |
Hydrofluoric acid (HF) (50%) | Fisher Scientific | for opening the emitter after polymerization | |
KASIL (Potassium Silicate Solution) | PQ Corporation | for making frit | |
Orbitrap Fusion Lumos | Thermo Fisher Scientific | for MS data acquisition | |
P2000 Laser Puller | Sutter | for pulling capillary | |
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting | Chromre | 214104 | For bomb setting |
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g | Dr. Masch GmbH | r119.aq.0001 | Batch 5910 |
Soldering | Any brand | For initiating polimerization | |
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT | Swagelok | SS-4-HCG | for bomb setting |
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD | MOLEX/Polymicro | 1068150019 | For column tubing |
Ultimate 3000 UHPLC | Dionex | HPLC type |
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