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Method Article
* Estes autores contribuíram igualmente
Aqui, apresentamos e avaliamos um protocolo para a confecção de colunas de cromatografia líquida de nanofluxo de fase reversa de baixo custo para caracterização de peptídeos usando fluxos de trabalho proteômicos LC-MS/MS.
A alta complexidade prevalente em amostras biológicas requer separações cromatográficas com alta sensibilidade e resolução para serem efetivamente analisadas. Aqui, apresentamos um protocolo robusto, reprodutível e barato para a preparação de colunas de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa de nanofluxo (RP-HPLC) para separação on-line de peptídeos analíticos antes da introdução e detecção por um espectrômetro de massa em fluxos de trabalho proteômicos tradicionais de baixo para cima. Dependendo do objetivo do experimento e das propriedades químicas dos analitos que estão sendo separados, os parâmetros ideais da coluna podem diferir em seus diâmetros internos ou externos, comprimento, tamanho de partícula, tamanho de poro, química de partículas de fase estacionária e a presença ou ausência de um emissor de eletrospray integrado na ponta. Um sistema interno de empacotamento de colunas não apenas permite a fabricação rápida de colunas com as propriedades desejadas, mas também reduz drasticamente o custo do processo. O protocolo otimizado para empacotar uma coluna de sílica fundida C18 AQ (aquosa) discutido aqui é compatível com uma ampla gama de instrumentos de cromatografia líquida para obter uma separação eficaz de analitos.
As colunas de HPLC contribuíram imensamente para a produtividade nas áreas de pesquisa farmacêutica, médica e ambiental 1,2,3,4. Ter acesso a colunas de cromatografia de alta qualidade é uma etapa fundamental no fracionamento de analitos complexos. Na proteômica shotgun, a alta sensibilidade analítica é rotineiramente realizada pelo acoplamento da espectrometria de massa (MS) de ionização por eletrospray (ESI) à cromatografia de nanofluxo 5,6,7,8. A separação eficiente de milhares de peptídeos é fundamental nesta aplicação, pois permite que o espectrômetro de massa identifique e quantifique analitos com alta sensibilidade e resolução.
O campo de empacotamento de colunas para aplicações de espectrometria de massa testemunhou um tremendo crescimento nos últimos anos com avanços na compreensão dos princípios fundamentais de empacotamento de colunas relacionados à morfologia da fase estacionária, interações solvente-partícula e design de hardware, possibilitando a caracterização detalhada de uma ampla gama de biomoléculas em ambientes biológicos complexos 9,10,11,12,13,14 . Os esforços que destacam as considerações práticas no empacotamento de colunas analíticas para fins de LC-MS abriram caminho para que os laboratórios proteômicos desenvolvessem sistemas internos de empacotamento para atender aos seus interesses específicos com a promessa de desempenho máximo 15,16,17,18.
Colunas de nanospray com diâmetros internos na faixa de 50-150 μm e extremidades cônicas são adequadas para fins de ionização por eletrospray. No campo da proteômica shotgun, as separações são normalmente realizadas usando um gradiente de solvente fluindo através de uma fase estacionária apolar compactada, mais comumente sílica ligada à cadeia de carbono hidrofóbica (C8-C30) com tamanhos de partícula variando entre 1,7 a 3,5 μm 19,20,21,22. Os analitos eluidores são emitidos através de um emissor ESI integrado na coluna, o que garante a ionização suave dos analitos da fase de solução para íons gasosos. O acoplamento de colunas LC com ESI-MS avançou significativamente a aplicação da espectrometria de massa em tandem para estratégias proteômicas em ciências biomédicas.
Colunas LC com diâmetros internos estreitos resultam em picos cromatográficos mais estreitos e maior sensibilidade em relação a colunas de microfluxo de diâmetro mais alto e, portanto, são particularmente vantajosas com fluxos de trabalho proteômicos. Embora as colunas LC pré-embaladas disponíveis comercialmente sejam opções atraentes devido à sua conveniência e facilidade de uso, elas podem ser proibitivamente caras e menos flexíveis do que as opções internas. O objetivo deste trabalho é descrever uma abordagem de empacotamento de pasta tecnicamente simples e de baixo custo para preparar colunas de HPLC de fase reversa de diâmetro interno estreito usando capilares de sílica fundida e um sistema de bomba de pressão construído internamente para aplicações proteômicas.
1. Preparação da ponta capilar
2. Polimerização/condicionamento da ponta
3. Preparação da fase estacionária
4. Embalando a coluna com fase estacionária
5. Acabamento da coluna e confecção da frita
Para avaliar o desempenho das colunas, 750 ng de digestores de peptídeos trípticos preparados a partir de lisados de células inteiras de células HEK293 foram fracionados on-line usando um capilar de sílica fundida de 25 cm de comprimento e 75 μm de diâmetro interno embalado internamente com partículas a granel de ReproSil-Pur 120 C18-AQ, conforme descrito no protocolo. Antes do carregamento da amostra, a coluna foi lavada com 6 μL de uma mistura de acetonitrila, isopropanol e H<...
As estratégias proteômicas modernas dependem de separações cromatográficas de alta qualidade para analisar efetivamente sistemas biológicos complexos. Portanto, as colunas LC de nanofluxo de alto desempenho e custo-benefício são componentes cruciais de um regime de espectrometria de massa em tandem bem-sucedido destinado a caracterizar milhares de proteínas em um único fluxo de trabalho.
Neste estudo, avaliamos o desempenho e a confiabilidade de uma ...
Os autores não têm nada a divulgar.
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health GM089778 a J.A.W.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
99.99% Formamide acid | Sigma-Aldrich | for making frit | |
alcohol lamp | Any brand | For providing heat | |
Brechbuehler helium pressure cell | BioSurplus | for packing column | |
Ceramic column cutter | Any brand | for cutting silica capillary | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99% | Sigma-Aldrich | Stored in a flammable cabinet | |
Formamide ≥99.5% | Sigma-Aldrich | for making frit | |
Hydrofluoric acid (HF) (50%) | Fisher Scientific | for opening the emitter after polymerization | |
KASIL (Potassium Silicate Solution) | PQ Corporation | for making frit | |
Orbitrap Fusion Lumos | Thermo Fisher Scientific | for MS data acquisition | |
P2000 Laser Puller | Sutter | for pulling capillary | |
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting | Chromre | 214104 | For bomb setting |
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g | Dr. Masch GmbH | r119.aq.0001 | Batch 5910 |
Soldering | Any brand | For initiating polimerization | |
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT | Swagelok | SS-4-HCG | for bomb setting |
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD | MOLEX/Polymicro | 1068150019 | For column tubing |
Ultimate 3000 UHPLC | Dionex | HPLC type |
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