Un metodo robusto per l'imballaggio di colonne C18 RP-nano-HPLC ad alta risoluzione

Riepilogo

Qui, presentiamo e valutiamo un protocollo per la realizzazione di colonne per cromatografia liquida a nanoflusso a fase inversa a basso costo per la caratterizzazione dei peptidi utilizzando flussi di lavoro proteomici LC-MS/MS.

Abstract

L'elevata complessità prevalente nei campioni biologici richiede separazioni cromatografiche con elevata sensibilità e risoluzione per essere analizzate in modo efficace. Qui presentiamo un protocollo robusto, riproducibile ed economico per la preparazione di colonne per cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa a nanoflusso (RP-HPLC) per la separazione in linea di peptidi analitici prima dell'introduzione e del rilevamento da parte di uno spettrometro di massa nei tradizionali flussi di lavoro di proteomica bottom-up. A seconda dell'obiettivo dell'esperimento e delle proprietà chimiche degli analiti da separare, i parametri ottimali della colonna possono differire per diametro interno o esterno, lunghezza, dimensione delle particelle, dimensione dei pori, chimica delle particelle in fase stazionaria e presenza o assenza di un emettitore elettrospray integrato sulla punta. Un sistema di impaccamento interno non solo consente la fabbricazione rapida di colonne con le proprietà desiderate, ma riduce anche drasticamente i costi del processo. Il protocollo ottimizzato per il confezionamento di una colonna di silice fusa C18 AQ (acquosa) qui discusso è compatibile con un'ampia gamma di strumenti cromatografici liquidi per ottenere una separazione efficace degli analiti.

Introduzione

Le colonne HPLC hanno contribuito enormemente alla produttività nei settori della ricerca farmaceutica, medica e ambientale 1,2,3,4. L'accesso a colonne cromatografiche di alta qualità è un passaggio fondamentale nel frazionamento di analiti complessi. Nella proteomica shotgun, l'elevata sensibilità analitica viene regolarmente raggiunta accoppiando la spettrometria di massa (MS) a ionizzazione elettrospray (ESI) alla cromatografia a nanoflusso 5,6,7,8. La separazione efficiente di migliaia di peptidi è fondamentale in questa applicazione in quanto consente allo spettrometro di massa di identificare e quantificare gli analiti con elevata sensibilità e risoluzione.

Il campo dell'impacchettamento di colonne per applicazioni di spettrometria di massa ha assistito a un'enorme crescita negli ultimi anni con progressi nella comprensione dei principi fondamentali di impacchettamento delle colonne relativi alla morfologia della fase stazionaria, alle interazioni solvente-particella e alla progettazione hardware, rendendo possibile la caratterizzazione dettagliata di un'ampia gamma di biomolecole in contesti biologici complessi 9,10,11,12,13,14 . Gli sforzi che evidenziano le considerazioni pratiche nell'imballaggio delle colonne analitiche per scopi LC-MS hanno spianato la strada ai laboratori di proteomica per sviluppare sistemi di imballaggio interni per soddisfare i loro interessi specifici con la promessa di massime prestazioni 15,16,17,18.

Le colonne Nanospray con diametri interni nell'intervallo 50-150 μm e estremità coniche sono adatte per la ionizzazione elettrospray. Nel campo della proteomica shotgun, le separazioni vengono tipicamente effettuate utilizzando un gradiente di solvente che scorre attraverso una fase stazionaria non polare impaccata, più comunemente silice legata a catena di carbonio idrofobica (C8-C30) con dimensioni delle particelle variabili tra 1,7 e 3,5 μm 19,20,21,22. Gli analiti a eluizione vengono emessi attraverso un emettitore ESI integrato all'interno della colonna, che garantisce la ionizzazione morbida degli analiti della fase di soluzione in ioni gassosi. L'accoppiamento di colonne LC con ESI-MS ha fatto progredire in modo significativo l'applicazione della spettrometria di massa tandem alle strategie proteomiche nelle scienze biomediche.

Le colonne LC con diametri interni stretti determinano picchi cromatografici più stretti e una maggiore sensibilità rispetto alle colonne a microflusso con foro più elevato e quindi sono particolarmente vantaggiose con i flussi di lavoro proteomici. Sebbene le colonne LC preconfezionate disponibili in commercio siano opzioni interessanti per la loro praticità e facilità d'uso, possono essere proibitive e meno flessibili rispetto alle opzioni interne. L'obiettivo di questo lavoro è quello di descrivere un approccio tecnicamente semplice e a basso costo per preparare colonne HPLC in fase inversa di diametro interno stretto utilizzando capillari in silice fusa e un sistema di bombe a pressione costruito internamente per applicazioni proteomiche.

Protocollo

1. Preparazione della punta capillare

1. Utilizzando una pietra da taglio in ceramica, tagliare circa 60-70 cm di un capillare di silice fusa rivestito di poliimmide con un diametro interno (ID) di 75 μm e un diametro esterno (OD) di 360 μm.
2. Tenere il capillare con le mani all'incirca a metà della sua lunghezza, lasciando uno spazio di 4-5 cm tra le dita e riscaldare l'area nella fessura ruotandola sulla fiamma di una lampada ad alcool. Lucidare l'area bruciata con un panno a basso contenuto di lanugine imbevuto di metanolo fino a quando il vetro non è visibile. (Figura 1).
   NOTA: 4-5 cm del capillare di silice fusa rivestito in poliimmide devono essere esposti e lucidati prima di poter essere caricati nell'estrattore laser.
3. Per estrarre un emettitore a forma di cono per ESI, utilizzare un estrattore di punte laser con impostazioni di programma speciali di un valore di calore di 300 (equivalente a 2 Watt di potenza laser), una velocità di 10 (equivalente a 0,25 mm/s) e un ritardo di 180 millisecondi per ottenere una punta di ~1-5 μm di diametro (Figura 2 e Figura 3A). Caricare la parte lucidata del capillare nell'estrattore laser e premere il pulsante di trazione, ottenendo due colonne capillari vuote pronte per essere imballate.
   NOTA: L'ispezione frequente della punta in qualsiasi fase viene eseguita utilizzando un microscopio. Le impostazioni saranno probabilmente diverse tra gli estrattori laser e dovranno essere determinate empiricamente.

2. Polimerizzazione/mordenzatura della punta

1. Per trattenere le particelle della fase stazionaria nel tubo capillare, preparare una fritta porosa da una miscela di due soluzioni di silicato di potassio e formammide. Preparare la soluzione immediatamente prima dell'uso in una provetta da 2 ml e mescolare con un vortice.
   1. Miscelare due soluzioni di silicato di potassio con un rapporto SiO₂/K₂O di 2,50 (p/p) e 1,65 (p/p) e formammide in un rapporto di 1:3:1 (v/v/v), rispettivamente. Ad esempio, mescolare 100 μL di silicato di potassio con un rapporto SiO₂/K₂O di 2,50 (p/p), 300 μL di silicato di potassio con un rapporto SiO₂/K₂O di 1,65 (p/p)) e 100 μL di formammide seguito da vortex. Questa soluzione polimerizzerà quando riscaldata e produrrà una fritta porosa.
2. Immergere la punta capillare tirata al laser nell'acqua madre trasparente della sospensione fritta (non nel precipitato) per circa 10-20 secondi, lasciandola penetrare per circa 5 mm nella punta per azione capillare. A seconda della larghezza della punta, potrebbe essere necessario mantenere la punta immersa più a lungo nella soluzione di fritta. Generalmente, il tempo di immersione è più breve se la punta è più larga poiché la soluzione può entrare nella punta più velocemente.
3. Posizionare un saldatore caldo (impostato a 350 °F) lungo la punta per avviare la polimerizzazione della soluzione di fritta durante l'ispezione del capillare al microscopio. Fare riferimento alla Figura 3 per vedere la punta tirata prima (Figura 3A) e dopo la polimerizzazione (Figura 3B).
4. Per evitare l'ostruzione dell'emettitore dopo la polimerizzazione della fritta, immergere la punta della colonna in una soluzione di acido fluoridrico (HF) al 50% per 5 minuti (la configurazione è illustrata nella Figura 4). L'incisione HF conferisce anche una geometria piatta a forma di cono alla colonna, aumentandone la longevità. Dopo l'incisione HF, assicurarsi che la punta della colonna sia accuratamente lavata, prima con un neutralizzatore HF e poi generosamente con acqua per evitare il contatto con l'acido.
   ATTENZIONE: L'HF è una sostanza chimica altamente pericolosa e corrosiva. Si consiglia la massima cautela durante la manipolazione per evitare l'esposizione. Assicurarsi che l'HF sia sempre maneggiato con un'adeguata protezione all'interno di una cappa aspirante identificata con un cartello che indica "Pericolo! tossine acute".
   1. Per motivi di sicurezza, utilizzare camici da laboratorio normali e antiinfiammabili, oltre a doppi strati di guanti in nitrile e neoprene, durante la manipolazione dell'HF.
      NOTA: È facoltativo friggere le punte dei capillari; Tuttavia, rende la colonna significativamente più resistente all'intasamento e ne aumenta la longevità. Sono disponibili in commercio colonne capillari vuote in silice fusa con emettitore elettrospray integrato che possono essere utilizzate per sostituire i passaggi 1 e 2, se necessario.

3. Preparazione della fase stazionaria

1. Sospendere 25-50 mg di particelle di silice ReproSil-Pur 120 C18-AQ completamente porose con particelle di 1,9 μm e 120 Å di dimensione dei pori in 300 μL di metanolo. Pipet su e giù per circa 20 volte per garantire una miscela omogenea delle particelle di liquame nel metanolo.
2. Posizionare il tubo contenente la sospensione di liquame all'interno della camera della cella di pressione di un sistema di bombe impacchettamento della colonna costruito internamente, che a sua volta è installato sopra un agitatore magnetico che consente alle particelle di liquame di rimanere in sospensione. Collegare la bomba al serbatoio dell'elio (<1500 psi) che funziona a pressione costante per evitare di interrompere il liquame HPLC durante l'imballaggio. (Schema rappresentato nella Figura 5).
3. Fissare il coperchio della cella di pressione serrandolo in posizione con i bulloni come mostrato nella Figura 6A.
   NOTA: È importante apprezzare la differenza nel funzionamento di una pompa HPLC e di una bomba di imballaggio HPLC. Mentre il primo è progettato per funzionare a portata costante indipendentemente dalla contropressione esercitata dalla fase stazionaria nella colonna, i sistemi di impaccamento HPLC funzionano a una pressione costante per garantire un impacchettamento ininterrotto e denso delle particelle della fase stazionaria per tutta la lunghezza della colonna capillare.

4. Impaccamento della colonna con fase stazionaria

1. Infilare prima la parte inferiore della colonna (estremità aperta non fritta) attraverso il raccordo a dita sulla parte superiore della bomba a pressione in modo che la punta della colonna sia rivolta verso l'alto. Spingere la colonna fino a toccare la base del flaconcino contenente liquame e ritrarla di 1-2 mm sopra la base. Serrare il raccordo a tenuta di mano per fissare la colonna in posizione.
2. Collegare la bomba a un serbatoio di gas elio (pressione consigliata < 1500 psi) e accenderla a una pressione di ~ 1300 psi. Il gas elio entra nella cella di pressione che ospita la fiala contenente il liquame attraverso una valvola a tre vie. Aprire la valvola ruotandola lentamente di 180° in senso orario.
   NOTA: Non appena l'elio gassoso inizia a fluire all'interno della camera, spinge il liquame dal tubo nel capillare. Quando il liquame passa attraverso la colonna, le particelle vengono trattenute nel capillare mentre il solvente forma una gocciolina liquida sulla punta della colonna (Figura 6B).
   1. Se la formazione di goccioline di liquido sulla punta della colonna è ritardata, fiammeggiare rapidamente la punta per assicurarsi che sia aperta. In questa fase, una fonte di luce posta dietro la colonna può aiutare a osservare l'andamento del processo di imballaggio (Figura 7). Per una colonna con un ID di 75 μm, in genere ci vogliono ~30-60 minuti per imballare una lunghezza di circa 30 cm.
   2. Se il flusso del liquame attraverso la colonna si ferma o rallenta, tenere il capillare saldamente verso il basso sopra il raccordo a tenuta di dita della bomba di imballaggio e allentarlo leggermente ruotandolo di circa un quarto di giro (si può sentire un sibilo di depressurizzazione).
      NOTA: Ciò consente di riposizionare la colonna senza la necessità di depressurizzare completamente la bomba.
   3. Ora riposiziona delicatamente la colonna muovendola su e giù e poi stringi nuovamente il raccordo a distanza assicurandoti che la colonna non tocchi la base del flaconcino. Ciò garantisce un flusso uniforme del liquame attraverso il capillare in ogni momento.
   4. Se la misura di cui sopra non riesce a riprendere l'imballaggio, chiudere la valvola, sfiatare la bomba di imballaggio, svitare il coperchio e ispezionare il liquame per assicurarsi che non ci siano precipitati. È anche possibile che l'estremità della colonna sia ostruita da particelle solide di fase stazionaria, nel qual caso, tagliare una piccola lunghezza dalla parte posteriore del capillare può aiutare a riprendere il flusso.
3. Imballare alcuni centimetri in più rispetto alla lunghezza desiderata all'estremità della colonna per garantire l'impacchettamento completo delle particelle stazionarie e ridurre al minimo la possibilità di far entrare bolle di elio nella colonna impaccata.

5. Finitura della colonna e realizzazione della fritta posteriore

1. Una volta raggiunta la lunghezza di imballaggio desiderata, chiudere la valvola principale del serbatoio del gas elio e attendere un minimo di 15 minuti per garantire un imballaggio uniforme della colonna e consentire al sistema di autodepressurizzarsi.
   NOTA: Per evitare l'introduzione di bolle di He a causa della silice fusa vuota all'estremità della colonna, si consiglia una lunghezza di imballaggio maggiore. È fondamentale che il processo di impaccamento continui anche dopo che la parte della colonna visibile all'occhio è stata impacchettata per tenere conto della lunghezza del capillare all'interno della camera di pressione. Inoltre, si consiglia una lunghezza di imballaggio maggiore nei casi in cui è necessario riposizionare ripetutamente la colonna, in quanto ciò si traduce in meno bolle d'aria e una maggiore efficienza di imballaggio.
2. Depressurizzare delicatamente la camera ruotando la valvola di 180 gradi in senso antiorario fino alla posizione originale. Tenere saldamente la colonna, svitare il raccordo a tenuta di mano e rimuovere gradualmente la colonna. Questo passaggio deve essere eseguito molto delicatamente per evitare l'introduzione di bolle d'aria.
3. Tagliare l'estremità della colonna a una lunghezza di 25,5 cm. Durante l'ispezione al microscopio, utilizzare un saldatore caldo a 350 °F per rimuovere una lunghezza di 0,5 cm di liquame dall'estremità posteriore della colonna.
   1. Immergere l'estremità posteriore della colonna nella soluzione di fritta rimanente dal passaggio 2.1 per circa 10 secondi e polimerizzarla posizionando un saldatore caldo lungo la parte posteriore della colonna mentre la si ispeziona al microscopio. La fritta posteriore assicura che le particelle di ReproSil-Pur 120 C18-AQ rimangano nella colonna e impedisce il riflusso durante i lavaggi cromatografici.
      NOTA: Anche la fritta nella parte posteriore della colonna è opzionale, ma rende la colonna più robusta, come è stato notato anche per la fritta anteriore nel passaggio 2.

Risultati

Per valutare le prestazioni delle colonne, 750 ng di digesti di peptidi triptici preparati da lisati di cellule intere di cellule HEK293 sono stati frazionati online utilizzando un capillare di silice fusa ID lungo 25 cm e 75 μm impacchettato internamente con particelle di ReproSil-Pur 120 C18-AQ sfuse, come descritto nel protocollo. Prima del caricamento del campione, la colonna è stata lavata utilizzando 6 μl di una miscela di acetonitrile, isopropanolo e H₂O in un rappor...

Discussione

Le moderne strategie proteomiche si basano su separazioni cromatografiche di alta qualità per analizzare efficacemente sistemi biologici complessi. Pertanto, le colonne LC a nanoflusso ad alte prestazioni ed economiche sono componenti cruciali di un regime di spettrometria di massa tandem di successo volto a caratterizzare migliaia di proteine in un unico flusso di lavoro.

In questo studio abbiamo valutato le prestazioni e l'affidabilità di una gamma di colo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
99.99% Formamide acid	Sigma-Aldrich		for making frit
alcohol lamp	Any brand		For providing heat
Brechbuehler helium pressure cell	BioSurplus		for packing column
Ceramic column cutter	Any brand		for cutting silica capillary
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		Stored in a flammable cabinet
Formamide  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		for making frit
Hydrofluoric acid (HF) (50%)	Fisher Scientific		for opening the emitter after polymerization
KASIL (Potassium Silicate Solution)	PQ Corporation		for making frit
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		for MS data acquisition
P2000 Laser Puller	Sutter		for pulling capillary
PTFE 1/16" Ferrule 0.4 mm ID (long) for Tube Fitting	Chromre	214104	For bomb setting
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
Soldering	Any brand		For initiating polimerization
Stainless Steel Pipe Fitting, Hex Coupling, 1/4 in. Female NPT	Swagelok	SS-4-HCG	for bomb setting
TSP075375 fused silica, 75 µm ID x 360 µOD	MOLEX/Polymicro	1068150019	For column tubing
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC type