JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

طورنا برامج رؤية الكمبيوتر الآلي للكشف عن الأحداث الإكسوسيتيكية التي تتميز مسابير الفلورسنت الحساسة لhH. هنا، ونحن نثبت استخدام واجهة المستخدم الرسومية وRStudio للكشف عن أحداث الانصهار، وتحليل وعرض المعلمات الصدغية من الانصهار، وتصنيف الأحداث إلى وسائط الانصهار متميزة.

Abstract

الوقت TIRF المجهر من GFP الحساسة لhh (pHluorin) تعلق على البروتينات SNARE الحوييل هو وسيلة فعالة لتصور الأحداث وحيدة في زراعة الخلايا. وللاضطلاع بتحديد وتحليل غير متحيزين وفعالين لهذه الأحداث، تم تطوير وتنفيذ نهج قائم على رؤية الحاسوب في MATLAB. يتكون خط أنابيب التحليل من خوارزمية تعريف تقسيم الخلايا والحدث الإكسوسيتيكي. يتضمن نهج الرؤية الحاسوبية أدوات للتحقيق في معلمات متعددة للأحداث الفردية ، بما في ذلك نصف عمر تسوس الفلورسين وذروة ΔF / F ، بالإضافة إلى تحليل كامل للخلايا لتواتر الإفراز. وتستخدم هذه المعلمات وغيرها من معايير الانصهار في نهج التصنيف للتمييز بين وسائط الانصهار متميزة. هنا واجهة المستخدم الرسومية بنيت حديثا ينفذ خط أنابيب التحليل من البداية إلى النهاية. يتم استخدام المزيد من التكيف مع وظيفة ريبلي K في R Studio للتمييز بين الحدوث المجمع أو المشتت أو العشوائي لأحداث الاندماج في كل من المكان والزمان.

Introduction

يبني VAMP-pHluorin أو مستقبلات نقل (TfR) - pHuji البنى هي علامات ممتازة للأحداث exocytic، كما يتم إخماد هذه الفلوروفورس الحساسة ل درجة الحموضة داخل التجويف الحويكل الحمضي والفلوريس مباشرة عند فتح المسام الانصهار بين الحويكل وغشاء البلازما1. بعد فتح المسام الانصهار، تتحلل الفلورية أضعافا مضاعفة، مع بعض التغاير الذي يكشف عن معلومات حول الحدث الانصهار. هنا، يتم وصف تطبيق واجهة مستخدم رسومية (GUI) الذي يقوم تلقائيا بالكشف عن الأحداث الإكسوسيتيكية وتحليلها. يسمح هذا التطبيق للمستخدم بالكشف تلقائيا عن الأحداث الإكسوسيتيكية التي كشفت عنها علامات حساسة الرقمالحموضة 2 وتوليد ميزات من كل حدث التي يمكن استخدامها لأغراض التصنيف3 (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف تحليل تجمع الأحداث exocytic باستخدام دالة K ريبلي.

التصنيف الآلي للأحداث exocytic في وسائط خارجية مختلفة أفيد مؤخرا3. وقد وصفت من قبل وضعين من exocytosis ، الانصهار الكامل الحويكل (FVF) وقبلة وتشغيل الانصهار (KNR) exocytosis4،5،6،7. خلال FVF ، يتوسع مسام الانصهار ، ويتم دمج الحويكل في غشاء البلازما. خلال KNR ، يفتح المسام الانصهار بشكل عابر ثم يعيد ختم4،5،8،9،10. تم تحديد أربعة أنماط من الإصابة بالخلايا العصبية في تطوير، اثنان تتعلق FVF واثنين تتعلق KNR. هذا العمل يدل على أن كلا من FVF و KNR يمكن تقسيمها إلى مزيد من الأحداث الانصهار التي تنتقل على الفور إلى تسوس مضان (FVFi و KNRi) بعد فتح المسام الانصهار أو الأحداث الخارجية التي تظهر تأخير بعد فتح المسام الانصهار قبل أن يبدأ الاضمحلال الفلوري (FVFd وKNRd) (الشكل 1B). يحدد المصنف وضع التقشير لكل حدث اندماجي. هنا تم دمج هذا التحليل في واجهة المستخدم الرسومية التي يمكن تثبيتها في MATLAB في أنظمة التشغيل ويندوز وماك القائمة. يمكن العثور على جميع ملفات التحليل في https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing أو
https://github.com/GuptonLab

Protocol

1. اختيار مجموعات البيانات والدليل

  1. لتحديد مجموعات البيانات للتحليل، انقر فوق الزر بحث عن مجموعات البيانات ( الشكل2A، المربع الأحمر 1) للانتقال إلى المجلد الذي يتم إيداع البيانات فيه (على سبيل المثال، مجلد RawData). ملفات البيانات تلقائيا بملء ملفات البيانات كقائمة. يمكن أن يكون هناك أكثر من مجموعة بيانات واحدة في المجلد.
  2. انقر على زر اختيار الدليل وحدد الدليل (على سبيل المثال، اختبار) حيث سيتم إيداع الملفات المحللة (الشكل 2A، المربع الأحمر 2) . سيتم إنشاء مجموعة من المجلدات وملفات التحليل النهائية بالإضافة إلى الصور المؤقتة المتوسطة في هذا الدليل عند الضغط على زر التحليل. سيتم إنتاج أخطاء إذا لم يتم اختيار دليل.

2. تعيين حجم بكسل ومعدل الإطارات

  1. ملء معدل الإطار المناسب وحجم بكسل من الصور في المناسبة "Framerate" أو "حجم بكسل" مربع (الشكل 2A، مربع أخضر). إذا لم يتم توفير أية قيم (يتم تعيينها إلى الافتراضي "0")، ثم سيقوم البرنامج بالبحث في بيانات التعريف المقترنة بالملف لحجم معدل الإطارات والبكسل. إذا تعذر العثور على هذه القيم، فسيتخلف البرنامج عن كل بكسل للقياس وفي كل إطار للنقاط الزمنية.
    ملاحظة: في المثال المتوفر، معدل الإطارات هو 100، وحجم بكسل هو 0.08.

3. اختيار أو جعل أقنعة

  1. استخدم الزر Maker قناع لإنشاء أقنعة الخلية تلقائيا للبيانات في قائمة مجموعة بيانات الملف (الشكل 2A، المربع الأزرق). عند استخدام الزر Maker قناع سيتم إنشاء مجلد جديد في الدليل المختار يسمى MaskFiles. يتحول "مؤشر التشغيل" إلى اللون الأصفر أثناء التشغيل ويعود إلى اللون الأخضر عند اكتماله.
    ملاحظة: سيتم إنشاء قناع لكل ملف في قائمة ملفات البيانات من الإطارات 10 الأولى من ملف الصورة (أو من كافة الإطارات إذا كان أقل من 10 في ملف الصورة) وإيداعها في المجلد MaskFiles باستخدام نظام التسمية المناسبة (الموضحة أدناه).
  2. تأكد من أن ملفات القناع تلقائيا بملء قائمة "ملفات قناع". يمكن للمستخدم المتابعة مباشرة إلى التحليل.
    ملاحظة: تحقق من ملفات القناع بشكل مرئي دائما وتأكد من التقاطها لمنطقة الاهتمام بأكملها. يتم عرض الإطار الأول من ملف البيانات وملف القناع على واجهة المستخدم عند تحديدها. (الشكل2ب). قد ينتج "صانع القناع" أخطاء في حالة انخفاض الإشارة إلى الضوضاء، لذا فإن التحقق من صحة أن ملفات القناع مناسبة أمر بالغ الأهمية لمراقبة الجودة.
  3. كبديل لاستخدام Mask Maker، إذا كانت الإشارة إلى ضجيج الصور غير كافية، قم بإنشاء أقنعة يدويا في ImageJ.
    1. أولا، افتح ملف الصورة الخام في ImageJ (الشكل 3A).
    2. انقر فوق الزر تحديد المضلع وانقر فوق لرسم قناع حول الخلية. بمجرد الانتهاء، انقر نقرا مزدوجا فوق النقطة الأخيرة لإكمال المضلع.
    3. بمجرد الانتهاء، انتقل إلى تحرير | | التحديد إنشاء قناع (الشكل 3B). سيتم إنشاء قناع مقلوب جديد استنادا إلى الرسم المضلع. حفظ أقنعة في مجلد MaskFiles المعينة في الدليل المختار. يجب أن يطابق نظام تسمية ملف القناع ملفات البيانات الفردية المطابقة متبوعا ب "_mask_file". على سبيل المثال، إذا كان ملف بيانات يسمى "VAMP2_488_WT_1.tif"، يجب أن يكون اسم ملف القناع المطابق "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
    4. استخدم الزر بحث عن Maskfiles للانتقال إلى المجلد المختار من ملفات القناع المخصص المودعة. سوف الأقنعة ملء "ملفات قناع" كقائمة.
      ملاحظة: من المهم أن يكون قناع لكل ملف بيانات قبل تشغيل التحليل.

4. تحليل واستخراج ميزة

  1. بعد اختيار الدليل وملء قائمة ملفات البيانات وقائمة ملفات القناع، انقر فوق الزر تحليل (الشكل 4A). إذا كان تصنيف الأحداث exocytic مطلوبا، انتقل إلى الخطوة 5.
    ملاحظة: سيؤدي النقر فوق الزر تحليل سلسلة من المهام التلقائية لتحليل البيانات. فإنه سيتم إنشاء مجلدات فردية في الدليل المختار لإيداع البيانات التي تم تحليلها. أثناء التشغيل، سيتغير "مؤشر التشغيل" من الأخضر إلى الأصفر (الشكل 4A، المربع الأحمر). بعد الانتهاء من التحليل، سيتغير هذا مرة أخرى إلى اللون الأخضر.
  2. العثور على مجلد DataFiles (الشكل 4B) مع مجموعة كاملة من ملفات التحليل (وكذلك ملفات استخراج ميزة، لاستخدامها في التصنيف لاحقا) اسمه وفقا لكل ملف البيانات (الشكل 4C).
    ملاحظة: يتم تضمين وصف ملفات التحليل هذه أدناه في المقطع نتائج الممثل.

5. تصنيف الأحداث الإكستية

  1. لإجراء تصنيف متزامن للأحداث الإكسوسيتيكية مع الكشف التلقائي، تحقق من خانة الاختيار تصنيف قبل النقر على زر التحليل. لكل حدث exocytic تعيين درجة احتمال بين 0-1 لكل فئة. يعتبر الحدث exocytic مصنفا كواحد من الفئات الأربع إذا كانت درجة الاحتمال لتلك الفئة > 0.5.
    ملاحظة: بمجرد اكتمال التحليل، سيظهر مجلد ملف بيانات جديد ضمن الدليل المختار. سيحتوي المجلد على ملفات تحليل مطابقة لكل ملف صورة.

6. تحليل سباتيوتمبورالي للنصرة باستخدام قيم ريبلي K

  1. إنشاء ملف قناع "neurite" و "soma" منفصل. أولا، قطع سوما من النيوريت. لا توجد طريقة غير متحيزة لتقسيم سوما من neurites ، لذلك يجب أن يكون المستخدم أعمى عن تجربة التكييف واستخدام أفضل حكم . ويقترح بيضاوي مع عدم وجود ملحقات neurite واضحة.
  2. فتح ImageJ / فيجي.
  3. اسحب ملف القناع وأسقطه أو استخدم ملف | افتح ثم حدد ملف القناع.
  4. استخدام أداة منتقي الألوان وانقر على أي من بكسل أسود في خلفية القناع لتعيين اللون إلى الأسود.
  5. استخدم أداة تحديد المضلع أو حر لرسم مخطط تفصيلي حول سوما، وفصله عن neurites. وهذا يتطلب اتخاذ قرارات يدوية.
  6. انقر على تحرير | | التحديد جعل قناع. سيتم فتح صورة جديدة مع سوما دائرة مجزأة من بقية الصورة. سيؤدي هذا إلى إنشاء ملف قناع سوما.
  7. دون تحريك المنطقة المرسومة، انقر فوق رأس ملف القناع الأصلي.
  8. انقر على تحرير | ملء لملء سوما دائرة بحيث تبقى فقط neurites القناع.
  9. بمجرد الحصول على ملفات neurite وقناع منفصلة حفظ كل من ملفات القناع.
  10. فتح "neurite_2D_network" في ماتلاب.
  11. في MATLAB، انتقل إلى الدليل مع كافة بيانات التحليل.
  12. تغيير المسار "اسم القناع" إلى اسم قناع neurite، أي"MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
  13. تغيير "csv_file_name" إلى حيث يوجد ملف fluorescent_traces.csv، أي"MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
  14. انقر فوق تشغيل لهياكل عظمية ملف قناع neurite. يؤدي هذا إلى إنشاء إصدار skeletonized من ملف قناع neurite و إيداعه كملف CSV ضمن المجلد maskfiles.
  15. بعد ذلك، إنشاء ملف CSV ل soma. فتح "CSV_mask_creator.m" في ماتلاب.
  16. وضع في المسار ل "اسم قناع" إلى اسم قناع سوما، أي، "MaskFiles / VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
  17. تغيير "writematrix" إلى اسم ملف csv ليتم إنشاؤها، أي" MaskFiles / VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv "
  18. انقر فوق تشغيل. يؤدي هذا إلى إنشاء ملف VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv جديد.
  19. كرر 6.14 لكل ملف قناع.

7. إعداد RStudio

  1. فتح Rstudio وفتح ripleys_k_analysis. R ملف.
  2. تثبيت الحزمة "spatstat" في RStudio عن طريق الانتقال إلى أدوات | تثبيت الحزم والكتابة في "spatstat" متبوعا بالنقر فوق تثبيت.
    ملاحظة: هذا يحتاج فقط إلى تنفيذ مرة واحدة لكل تثبيت Rstudio.
  3. تشغيل مكتبة spatstat في بداية كل جلسة عمل.
  4. انتبه إلى متغيرين رئيسيين في هذه الحالة: "neuron_mask" و "neuron_datapoints". قناع الخلايا العصبية يشير إلى مجموعة من ملفات قناع لتشغيل، أي، سوما قناع الملفات.
    ملاحظة: تشغيل كافة ملفات قناع سوما معا، بشكل منفصل عن ملفات قناع Neurite، والعكس بالعكس.
  5. قراءة في .csv من ملفات قناع لكل من الخلايا العصبية ليتم تحليلها.
  6. تشغيل ملفات متعددة في وقت واحد عن طريق نسخ neuron_mask_n+1 إضافية. سيسمح هذا بتجميع تحليل ريبلي معا ، باستخدام السيناريو الموصوف في القسم 8.
  7. الآن تحقق من المتغير الثاني ، "neuron_datapoints".
  8. اقرأ في. X_fluorescent_traces.csv" الملف الذي تم إنشاؤه بواسطة برنامج التحليل (بواسطة ميزات كافة extracted_R ملف) مع المواضع x,y,t الأحداث exocytic، وكذلك ملف neurite الخاصة بمواضع x,y لشبكة الاتصال 2D. هذا يذهب في موقف "neuron_datapoints".
  9. في RStudio حدد رمز | تشغيل | المنطقة تشغيل كافة. وهذا يولد العديد من المؤامرات، بما في ذلك قيم ريبلي K المجمعة وكذلك قطع الكثافة.
  10. حفظ قطع الأراضي عن طريق الذهاب إلى تصدير | حفظ الصورة كما | حدد تنسيق الصورة المناسب والدليل، ثم أدخل اسم الملف المناسب، ثم انقر فوق حفظ.
    ملاحظة: يتم استدعاء دالة رسم خرائط الحرارة في البرنامج النصي باستخدام "plot(density(soma_data,0.4)"." يمثل الرقم "0.4" هنا مدى سلاسة وظيفة الكثافة. يمكن تغييره ليتناسب مع بيانات المستخدم بطريقة ذات معنى، ولكن إذا كان سيتم إجراء المقارنات بين خرائط الحرارة المختلفة، يجب أن يكون الرقم هو نفسه بينهما.
  11. تصدير أو حفظ الصورة من Rstudio. إذا تطلبت خريطة الحرارة المزيد من التحرير، فاختر نوع ملف مناسب (SVG أو EPS).

8. تحليل ريبلي

ملاحظة: Ripleys_k_analysis. R الملف أيضا تلقائيا ولدت ريبلي ك قيمة المؤامرات. تشغيل البرنامج النصي بأكمله سيتم تلقائيا تشغيل الوظائف المذكورة أدناه، ولكن يتم تضمينه بالتفصيل إذا كان أحد يرغب في تشغيل كل جزء من البرنامج النصي بشكل فردي أو إجراء تغييرات على التحليل.

  1. أولا، تشغيل دالة المغلف لكل خلية. هذه الدالة محاكاة عشوائية المكانية كاملة (CSR) لاختبار القيمة K ريبلي من نمط نقطة الحدث exocytic ضد.
    Data_envelope_1 = المغلف (soma_data_1، Kest، nsim = 19، savefuns = TRUE)
    Data_envelope_2 = المغلف (soma_data_2، Kest، nsim = 19، savefuns = TRUE)
  2. بعد ذلك، تجمع هذه المغلفات معا وإنشاء تقدير واحد من المسؤولية الاجتماعية للشركات للمجموعة:
    Pool_csr = تجمع (Data_envelope_1، Data_envelop_2,...)
    بعد ذلك، قم بتشغيل الدالة K ريبلي لكافة نقاط البيانات.
    Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1، نسبة = TRUE)
    Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2، نسبة = TRUE)
  3. بمجرد الانتهاء، تجمع قيم ريبلي K معا وbootstrap فترات الثقة الخاصة بهم مع الأمر التالي:
    تجمع البيانات = تجمع (Data_ripleys_k_1، Data_ripleys_k_2,...)
  4. Bootstrap مع الأمر التالي:
    Final_Ripleys_K = varblock (متعة = Kest ، Data_pool)
  5. رسم البيانات.
  6. إذا كان هناك حاجة إلى اختلاف إحصائي ثابت، يتم تضمين اختبار التباديل Studentised في حزمة spatstat لاختبار الفرق بين مجموعات من أنماط النقاط:
    Test_difference = studpermu.test (all_points_to_test ، exocytic_events ~ المجموعة ، nperm = NP).

النتائج

هنا واجهة المستخدم الرسومية(الشكل 2A)تم استخدامها لتحليل الأحداث exocytic من ثلاثة VAMP2-pHluorin التعبير عن الخلايا العصبية في 3 DIV باستخدام TIRF (الانعكاس الداخلي الكلي مضان) المجهر. تم عزل الخلايا العصبية القشرية E15.5، تليها العدوى مع VAMP2-pHluorin والطلاء باستخدام البروتوكولات على النحو ا?...

Discussion

عند استخدام الكشف عن exocytic وتحليل البرمجيات ، يرجى النظر في أن البرنامج يقبل فقط ضغط فقدان .tif الملفات والمدخلات. قد تكون ملفات الصور .tif 8 بت أو 16 بت أو 32 بت الرمادي (قناة واحدة) الصور. يجب تحويل تنسيقات الصور الأخرى إلى أحد هذه الأنواع قبل الإدخال. كمرجع، الأمثلة المستخدمة هنا هي صور تدرج الرم?...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي شيء يكشفان عنه.

Acknowledgements

نشكر داستن ريفيل وريجنالد إدواردز لاختبار رمز واجهة المستخدم الرسومية. تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة التي دعمت هذا البحث: بما في ذلك R01NS112326 (SLG) وR35GM135160 (SLG) وF31NS103586 (FLU).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
RR Core Teamhttps://www.r-project.org/
RstudioRstudio, PBChttps://rstudio.com/

References

  1. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  2. Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
  3. Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
  4. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
  5. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  6. He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
  7. Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
  8. Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
  9. Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
  10. Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
  11. Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
  12. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
  13. Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
  14. Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
  15. Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
  16. Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved