Détection et analyse automatisées de l’exocytose

Résumé

Nous avons développé un logiciel de vision par ordinateur automatisé pour détecter les événements exocytaires marqués par des sondes fluorescentes sensibles au pH. Ici, nous démontrons l’utilisation d’une interface utilisateur graphique et de RStudio pour détecter les événements de fusion, analyser et afficher les paramètres spatio-temporels de la fusion et classer les événements en modes de fusion distincts.

Résumé

La microscopie TIRF timelapse de la GFP sensible au pH (pHluorin) attachée aux protéines SNARE des vésicules est une méthode efficace pour visualiser les événements exocytaires d’une seule vésicule en culture cellulaire. Pour effectuer une identification et une analyse impartiales et efficaces de ces événements, une approche basée sur la vision par ordinateur a été développée et mise en œuvre dans MATLAB. Le pipeline d’analyse se compose d’un algorithme de segmentation cellulaire et d’identification des événements exocytaires. L’approche de vision par ordinateur comprend des outils pour étudier de multiples paramètres d’événements uniques, y compris la demi-vie de la désintégration de fluorescence et le pic ΔF / F, ainsi que l’analyse des cellules entières de la fréquence de l’exocytose. Ces paramètres et d’autres de la fusion sont utilisés dans une approche de classification pour distinguer les modes de fusion distincts. Ici, une interface graphique nouvellement construite effectue le pipeline d’analyse du début à la fin. Une adaptation supplémentaire de la fonction K de Ripley dans R Studio est utilisée pour distinguer l’occurrence groupée, dispersée ou aléatoire d’événements de fusion dans l’espace et le temps.

Introduction

Les constructions VAMP-pHluorin ou récepteurs de la transferrine (TfR)-pHuji sont d’excellents marqueurs d’événements exocytaires, car ces fluorophores sensibles au pH sont trempés dans la lumière de la vésicule acide et fluorescent immédiatement après l’ouverture des pores de fusion entre la vésicule et la membrane^{plasmique 1}. Après l’ouverture des pores de fusion, la fluorescence se désintègre de manière exponentielle, avec une certaine hétérogénéité qui révèle des informations sur l’événement de fusion. Ici, une application d’interface utilisateur graphique (GUI) est décrite qui détecte et analyse automatiquement les événements exocytaires. Cette application permet à l’utilisateur de détecter automatiquement les événements exocytaires révélés par les marqueurs sensibles au pH² et de générer des caractéristiques de chaque événement qui peuvent être utilisées à des fins de classification³ (Figure 1A). En outre, l’analyse du regroupement d’événements exocytaires à l’aide de la fonction K de Ripley est décrite.

La classification automatisée des événements exocytaires en différents modes exocytaires a récemment été rapportée³. Deux modes d’exocytose, la fusion des vésicules complètes (FVF) et l’exocytose de la fusion kiss-and-run (KNR) ont déjà été décrits^4,5,6,7. Pendant la FVF, le pore de fusion se dilate et la vésicule est incorporée dans la membrane plasmique. Pendant KNR, le pore de fusion s’ouvre transitoirement puis reseale^4,5,8,9,10. Quatre modes d’exocytose ont été identifiés dans le développement des neurones, deux liés à la FVF et deux liés à KNR. Ces travaux démontrent que le FVF et le KNR peuvent être subdivisés en événements de fusion qui procèdent immédiatement à la désintégration de la fluorescence (FVFi et KNRi) après l’ouverture des pores de fusion ou en événements exocytaires qui présentent un délai après l’ouverture des pores de fusion avant le début de la désintégration de la fluorescence (FVFd et KNRd)(Figure 1B). Le classificateur identifie le mode d’exocytose pour chaque événement de fusion. Ici, cette analyse a été incorporée dans une interface graphique qui peut être installée dans MATLAB dans les systèmes d’exploitation Windows et Mac. Tous les fichiers d’analyse peuvent être consultés sur https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing ou
https://github.com/GuptonLab.

Protocole

1. Choisissez les jeux de données et le répertoire

1. Pour sélectionner des jeux de données à analyser, cliquez sur le bouton Rechercher des jeux de données ( Figure2A, encadré rouge 1) pour accéder au dossier dans lequel les données sont déposées (par exemple, le dossier RawData). Les fichiers de données rempliront automatiquement les fichiers de données sous forme de liste. Il peut y avoir plusieurs jeux de données dans le dossier.
2. Cliquez sur le bouton Choisir un répertoire et sélectionnez le répertoire (par exemple, Test) où les fichiers analysés seront déposés (Figure 2A, encadré rouge 2). Un ensemble de dossiers et de fichiers d’analyse terminés ainsi que des images temporaires intermédiaires seront créés dans ce répertoire lorsque vous appuyez sur le bouton Analyse. Des erreurs seront produites si un répertoire n’est pas choisi.

2. Définissez la taille des pixels et la fréquence d’images

1. Renseignez la fréquence d’images et la taille de pixels appropriées des images dans la zone « Framerate » ou « pixel size » appropriée (Figure 2A, boîte verte). Si aucune valeur n’est fournie (elles sont définies sur le « 0 » par défaut), le programme recherchera dans les métadonnées associées au fichier la fréquence d’images et la taille des pixels. Si ces valeurs sont introuvables, le programme utilisera par défaut par pixel pour la mesure et par image pour les points temporels.
   Remarque : Dans l’exemple fourni, la fréquence d’images est de 100 et la taille des pixels est de 0,08.

3. Choisissez ou fabriquez des masques

1. Utilisez le bouton Créateur de masques pour créer automatiquement des masques de cellule pour les données de la liste des jeux de données de fichiers ( Figure2A, zone bleue). Lors de l’utilisation du bouton Mask Maker, un nouveau dossier dans le répertoire choisi sera créé appelé MaskFiles. L’indicateur « Run » jaunira pendant la course et reviendra au vert une fois terminé.
   Remarque : Un masque pour chaque fichier de la liste Fichiers de données sera créé à partir des 10 premières images du fichier image (ou de toutes les images si moins de 10 sont dans le fichier image) et déposé dans le dossier MaskFiles en utilisant le schéma de dénomination approprié (décrit ci-dessous).
2. Assurez-vous que les fichiers de masque remplissent automatiquement la liste Fichiers de masque. L’utilisateur peut procéder directement à l’analyse.
   REMARQUE: Vérifiez toujours visuellement les fichiers de masque et confirmez qu’ils capturent toute la région d’intérêt. La première image du fichier de données et le fichier de masque sont affichés sur l’interface utilisateur lorsque cette option est sélectionnée. (Figure 2B). Le Mask Maker peut produire des erreurs dans le cas d’un faible rapport signal-bruit, il est donc essentiel de valider que les fichiers de masque sont appropriés pour le contrôle qualité.
3. Au lieu d’utiliser Mask Maker, si le signal vers le bruit des images est insuffisant, créez des masques manuellement dans ImageJ.
   1. Tout d’abord, ouvrez le fichier image brut dans ImageJ (Figure 3A).
   2. Cliquez sur le bouton Sélection du polygone et cliquez pour dessiner un masque autour de la cellule. Une fois terminé, double-cliquez sur le dernier point pour terminer le polygone.
   3. Une fois terminé, accédez à Modifier | | de sélection Créer un masque (Figure 3B). Un nouveau masque inversé sera créé en fonction du dessin du polygone. Enregistrez les masques dans un dossier MaskFiles désigné dans le répertoire choisi. Le schéma de dénomination des fichiers de masque doit correspondre aux fichiers de données individuels correspondants, suivis de « _mask_file ». Par exemple, si un fichier de données est nommé « VAMP2_488_WT_1.tif », le fichier de masque correspondant doit être nommé « VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif ».
   4. Utilisez le bouton Rechercher des fichiers de masque pour accéder au dossier choisi des fichiers de masque personnalisés déposés. Les masques rempliront les fichiers de masque sous forme de liste.
      REMARQUE : Il est important d’avoir un masque pour chaque fichier de données avant d’exécuter l’analyse.

4. Analyse et extraction de caractéristiques

1. Une fois le répertoire choisi et la liste Fichiers de données et la liste Fichiers de masque renseignées, cliquez sur le bouton Analyse (Figure 4A). Si la classification des événements exocytaires est requise, passez à l’étape 5.
   REMARQUE: Le bouton Analyse clique sur effectuera une série de tâches automatisées pour analyser les données. Il créera des dossiers individuels dans le répertoire choisi pour déposer les données analysées. Pendant l’exécution, l’indicateur de course passe du vert au jaune(Figure 4A,encadré rouge). Une fois l’analyse terminée, cela redevient vert.
2. Recherchez un dossier DataFiles (Figure 4B) avec l’ensemble complet des fichiers d’analyse (ainsi que des fichiers d’extraction d’entités, à utiliser dans la classification ultérieure) nommés en fonction de chaque fichier de données (Figure 4C).
   REMARQUE : Une description de ces fichiers d’analyse est incluse ci-dessous dans la section Résultats représentatifs.

5. Classification des événements exocytaires

1. Pour effectuer une classification simultanée des événements exocytaires avec détection automatisée, cochez la case Classification avant de cliquer sur le bouton Analyse. Pour chaque événement exocytaire, attribuez un score de probabilité compris entre 0 et 1 pour chaque classe. Un événement exocytaire est considéré comme l’une des quatre classes si le score de probabilité pour cette classe est > 0,5.
   REMARQUE : Une fois l’analyse terminée, un nouveau dossier de fichiers de données apparaîtra dans le répertoire choisi. Le dossier contiendra des fichiers d’analyse correspondant à chaque fichier image.

6. Analyse spatio-temporelle de l’exocytose à l’aide des valeurs K de Ripley

1. Créez un fichier de masque « neurite » et « soma » séparé. Tout d’abord, segmentez le soma de la neurite. Il n’y a pas de méthode impartiale pour segmenter le soma des neurites, de sorte que l’utilisateur doit être aveuglé par l’expérience de conditionnement et utiliser le meilleur jugement; un ellipsoïde sans extensions de neurites évidentes est suggéré.
2. Ouvrez ImageJ/Fidji.
3. Faites glisser et déposez le fichier de masque ou utilisez fichier | Ouvrez, puis sélectionnez le fichier de masque.
4. Utilisez l’outil de sélection de couleur et cliquez sur l’un des pixels noirs en arrière-plan du masque pour définir la couleur sur noir.
5. Utilisez l’outil de sélection de polygones ou à main levée pour dessiner un contour autour du soma, en le séparant des neurites. Cela nécessite une prise de décision manuelle.
6. Cliquez sur Modifier | | de sélection Faire un masque. Une nouvelle image s’ouvrira avec le soma encerclé segmenté du reste de l’image. Cela créera un fichier de masque soma.
7. Sans déplacer la région dessinée, cliquez sur l’en-tête du fichier de masque d’origine.
8. Cliquez sur Modifier | Remplissez pour remplir le soma encerclé afin que seules les neurites restent le masque.
9. Une fois les fichiers de neurite et de masque séparés obtenus, enregistrez les deux fichiers de masque.
10. Ouvrez « neurite_2D_network » dans Matlab.
11. Dans MATLAB, accédez au répertoire avec toutes les données d’analyse.
12. Remplacez le chemin « nom du masque » par le nom du masque de neurite, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif »
13. Remplacez le « csv_file_name » par l’emplacement de fluorescent_traces.csv fichier, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv ».
14. Cliquez sur Exécuter pour squelettiser le fichier de masque de neurite. Cela crée une version squelettée du fichier de masque de neurite et le dépose en tant que fichier CSV dans le dossier maskfiles.
15. Ensuite, générez un fichier CSV pour le soma. Ouvrez « CSV_mask_creator.m » dans Matlab.
16. Mettez dans le chemin d’accès pour le « nom du masque » au nom du masque soma, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. Remplacez le « writematrix » par le nom de fichier csv à créer, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv »
18. Cliquez sur Exécuter. Cela crée le nouveau fichier VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
19. Répétez la section 6.14 pour chaque fichier de masque.

7. Configuration de RStudio

1. Ouvrez Rstudio et ouvrez ripleys_k_analysis. Fichier R.
2. Installez le paquet « spatstat » dans RStudio en allant dans Outils | Installez les packages et tapez « spatstat » puis cliquez sur Installer.
   REMARQUE: Cela ne doit être effectué qu’une seule fois par installation Rstudio.
3. Exécutez le spatstat de la bibliothèque au début de chaque session.
4. Faites attention à deux variables principales dans ce cas: « neuron_mask » et « neuron_datapoints ». Neuron Mask pointe vers l’ensemble des fichiers de masque à exécuter, c’est-à-dire les fichiers de masque soma.
   REMARQUE: Exécutez tous les fichiers de masque soma ensemble, séparément des fichiers de masque Neurite, et vice versa.
5. Lisez dans le .csv des fichiers de masque pour chacun des neurones à analyser.
6. Exécutez plusieurs fichiers à la fois en copiant des neuron_mask_n+1 supplémentaires. Cela permettra d’agréger l’analyse de Ripley ensemble, en utilisant le script décrit dans la section 8.
7. Maintenant, vérifiez la deuxième variable, « neuron_datapoints ».
8. Lisez dans le. » X_fluorescent_traces.csv » généré par le programme d’analyse (par caractéristiques de tous les fichiers extracted_R) avec les positions x,y,t des événements exocytaires, ainsi que le fichier spécifique aux neurites des positions x,y pour le réseau 2D. Cela va dans la position « neuron_datapoints ».
9. Dans RStudio, sélectionnez le code | Exécuter la région | Exécuter tout. Cela génère plusieurs graphiques, y compris les valeurs K de Ripley regroupées ainsi que des diagrammes de densité.
10. Enregistrez les tracés en allant dans Exporter | Enregistrer l’image sous | Sélectionnez le format d’image et le répertoire appropriés, puis entrez le nom de fichier approprié, puis cliquez sur Enregistrer.
    REMARQUE: La fonction de traçage pour les cartes thermiques est appelée dans le script en utilisant « plot(density(soma_data,0.4)) ». Le nombre « 0,4 » représente ici à quel point la fonction de densité doit être lissée. Il peut être modifié pour s’adapter aux données utilisateur de manière significative, mais si des comparaisons doivent être effectuées entre différentes cartes thermiques, le nombre doit être le même entre elles.
11. Exporter ou enregistrer l’image à partir de Rstudio. Si une carte thermique nécessite d’autres modifications, choisissez un type de fichier approprié (SVG ou EPS).

8. Analyse de Ripley

REMARQUE: Le Ripleys_k_analysis. Le fichier R a également généré automatiquement les tracés de valeur k de Ripley. L’exécution du script entier exécutera automatiquement les fonctions mentionnées ci-dessous, mais il est inclus en détail si l’on souhaite exécuter chaque partie du script individuellement ou apporter des modifications à l’analyse.

1. Tout d’abord, exécutez la fonction d’enveloppe pour chaque cellule. Cette fonction a simulé le hasard spatial complet (CSR) pour tester la valeur K de Ripley du modèle de point d’événement exocytaire par rapport à.
   Data_envelope_1 = enveloppe(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
   Data_envelope_2 = enveloppe(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
2. Ensuite, regroupez ces enveloppes et créez une estimation de la RSE pour le groupe :
   Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
   Ensuite, exécutez la fonction K de Ripley pour tous les points de données.
   Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = VRAI)
   Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = VRAI)
3. Une fois terminé, mettez en commun les valeurs K de Ripley et amorcez leurs intervalles de confiance avec la commande suivante :
   Pool de données = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
4. Bootstrap avec la commande suivante :
   Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)
5. Tracez les données.
6. Si une différence statistique dure est requise, le test de permutation studentisée est inclus dans le package spatstat pour tester une différence entre des groupes de modèles de points:
   Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np).

Résultats

Ici, l’interface graphique(Figure 2A)a été utilisée pour analyser les événements exocytaires de trois neurones exprimant la VAMP2-pHluorine à 3 DIV en utilisant la microscopie TIRF (fluorescence par réflexion interne totale). Les neurones corticaux E15.5 ont été isolés, suivis d’une transfection avec VAMP2-pHluorin et d’un placage à l’aide des protocoles décrits dans Winkle et al., 2016 et Viesselmann et al., 2011^11,12<...

Discussion

Lorsque vous utilisez le logiciel de détection et d’analyse exocytaire, veuillez noter que le programme n’accepte que la compression sans perte .tif fichiers en entrée. Les fichiers image .tif peuvent être des images en niveaux de gris (canal unique) 8 bits, 16 bits ou 32 bits. Les autres formats d’image doivent être convertis en l’un de ces types avant la saisie. À titre de référence, les exemples utilisés ici sont des images en niveaux de gris 16 bits.

Inhérents au processus...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R	R Core Team		https://www.r-project.org/
Rstudio	Rstudio, PBC		https://rstudio.com/