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요약

pH 에 민감한 형광 프로브로 표시된 외식 이벤트를 감지하기 위해 자동화된 컴퓨터 비전 소프트웨어를 개발했습니다. 여기서는 그래픽 사용자 인터페이스와 RStudio를 사용하여 융합 이벤트를 감지하고, 융합의 현면 파라미터를 분석하고 표시하며, 이벤트를 고유한 융합 모드로 분류합니다.

초록

소포 SNARE 단백질에 부착된 pH-민감한 GFP(pHluorin)의 타임랩스 TIRF 현미경 검사는 세포 배양에서 단일 소포 외세포 이벤트를 시각화하는 효과적인 방법입니다. 이러한 이벤트에 대한 편견없고 효율적인 식별 및 분석을 수행하기 위해 MATLAB에서 컴퓨터 비전 기반 접근 방식을 개발하고 구현했습니다. 분석 파이프라인은 셀 세분화 및 외식 이벤트 식별 알고리즘으로 구성됩니다. 컴퓨터 비전 접근법에는 형광 부패및 피크 ΔF/F의 반감기를 비롯한 단일 이벤트의 여러 매개 변수를 조사하는 도구뿐만 아니라 외세포증 주파수의 전체 세포 분석을 포함하는 도구가 포함되어 있습니다. 이러한 융합의 매개 변수및 기타 매개 변수는 뚜렷한 융합 모드를 구별하기 위한 분류 접근 방식에 사용됩니다. 여기서 새로 구축된 GUI는 처음부터 끝까지 분석 파이프라인을 수행합니다. R Studio에서 Ripley의 K 기능을 추가로 조정하여 공간과 시간 모두에서 클러스터, 분산 또는 임의의 융합 이벤트를 구별하는 데 사용됩니다.

서문

VAMP-pHluorin 구조 또는 트랜스프레린 수용체(TfR)-pHuji 구조는 이러한 pH 민감형 형광류가 소포와 혈장 멤브레인1사이의 융합 모공 개구 시 즉시 산 소포 루멘 및 형광 내에 담금질되기 때문에 외세포 현상의 우수한 마커이다. 퓨전 모공 개구부에 이어 형광은 기하급수적으로 부패하며 융합 이벤트에 대한 정보를 드러내는 이질성도가 있습니다. 여기서, 그래픽 사용자 인터페이스(GUI) 응용 프로그램은 자동으로 외세포 이벤트를 감지하고 분석하는 설명입니다. 이 응용 프로그램은 사용자가 자동으로 pH 민감한마커에 의해 공개 엑소시틱 이벤트를 감지 할 수 있습니다 2 분류 목적 에 사용할 수있는 각 이벤트에서 기능을 생성(그림 1A). 또한, 리플리의 K 함수를 이용한 외식 이벤트 클러스터링의 분석이 설명된다.

다른 외세포 모드로 외세포 이벤트의 자동화 된 분류는 최근보고되었다3. 엑소시토시스의 두 가지 모드, 풀 소포 융합(FVF) 및 키스 앤런 융합(KNR) 엑소시토시스는 이전에4,5,6,7로설명되었다. FVF 동안, 융합 모공팽창, 및 소포는 플라즈마 멤브레인에 통합된다. KNR 동안 융합 공공은 일시적으로 열리고4,5,8,9,10을다시 밀봉합니다. 4가지 엑소시토시스 는 뉴런 개발에서 확인되었으며, 2개는 FVF와 관련이 있으며 KNR과 관련된 2가지. 이 작품은 FVF와 KNR 모두 형광 붕괴가 시작되기 전에 융합 모공 개구(FVFd 및 KNRd)(도 1B)가시작되기 전에 융합 모공 개구 후 지연을 나타내는 융합 모공 개구 또는 외세포 이벤트 후 즉시 형광 붕괴(FVFi 및 KNRi)로 진행되는 융합 이벤트로 더욱 세분화될 수 있음을 보여준다. 분류자는 각 융합 이벤트에 대한 외세포증 모드를 식별합니다. 이 분석은 Windows 및 Mac 기반 운영 체제의 MATLAB에 설치할 수 있는 GUI에 통합되었습니다. 모든 분석 파일은 https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing 또는
https://github.com/GuptonLab.

프로토콜

1. 데이터 집합 및 디렉터리 선택

  1. 분석을 위해 데이터 집합을 선택하려면 데이터 집합 찾기 버튼(그림2A,빨간색 상자 1)을클릭하여 데이터가 증착된 폴더(예: RawData 폴더)로 이동합니다. 데이터 파일은 데이터 파일을 목록으로 자동으로 채웁니다. 폴더에 두 개 이상의 데이터 집합이 있을 수 있습니다.
  2. 디렉토리 선택 버튼을 클릭하고 분석된 파일이 입금되는 디렉토리(예: 테스트)를 선택합니다(그림2A,빨간색 상자 2). 분석 버튼을 누르면 폴더 및 완성된 분석 파일 세트와 중간 임시 이미지가 이 디렉토리에서 만들어집니다. 디렉터리를 선택하지 않으면 오류가 생성됩니다.

2. 픽셀 크기와 프레임 레이트 설정

  1. 적절한 "프레임 레이트" 또는 "픽셀 크기"상자(그림 2A,그린 박스)에서 이미지의 적절한 프레임 속도와 픽셀 크기를입력합니다. 값이 제공되지 않는 경우(기본 "0"으로 설정됨) 프로그램은 프레임 레이트 및 픽셀 크기에 대한 파일과 연결된 메타데이터를 검색합니다. 이러한 값을 찾을 수 없는 경우 프로그램은 시간 점에 대한 측정을 위해 픽셀당 및 프레임당 기본값으로 기본값입니다.
    참고: 제공된 예제에서는 프레임 레이트가 100이고 픽셀 크기는 0.08입니다.

3. 마스크 선택 또는 만들기

  1. 마스크 메이커 버튼을 사용하여 파일 데이터 집합 목록(그림2A,파란색 상자)의데이터에 대한 셀 마스크를 자동으로 만듭니다. 마스크 메이커 버튼을 사용하면 선택한 디렉터리에서 새 폴더를 MaskFiles라고 합니다. 실행 표시기"는 실행 중 노란색으로 바뀌고 완료되면 녹색으로 돌아갑니다.
    참고: 데이터 파일 목록의 각 파일에 대한 마스크는 이미지 파일의 첫 10프레임(또는 이미지 파일에 있는 경우 모든 프레임에서)에서 생성되고 적절한 명명 체계(아래에 설명된 설명)를 사용하여 MaskFiles 폴더에 증착됩니다.
  2. 마스크 파일이 마스크 파일 목록을 자동으로 채웁니다. 사용자는 분석으로 직접 진행할 수 있습니다.
    참고: 항상 시각적으로 마스크 파일을 확인하고 관심 영역 전체를 캡처하는지 확인합니다. 선택한 경우 데이터 파일과 마스크 파일의 첫 번째 프레임이 UI에 표시됩니다. (그림2B). 마스크 메이커는 신호 대 노이즈가 낮은 경우 오류를 생성할 수 있으므로 마스크 파일이 적절한지 확인하는 것은 품질 관리에 매우 중요합니다.
  3. 마스크 메이커를 사용하는 대신 이미지 의 노이즈에 대한 신호가 충분하지 않은 경우 ImageJ에서 수동으로 마스크를 만듭니다.
    1. 먼저 ImageJ(그림3A)에서원시 이미지 파일을 엽니다.
    2. 다각형 선택 버튼을 클릭하고 클릭하여 셀 주위에 마스크를 그립니다. 완료되면 마지막 지점을 두 번 클릭하여 다각형을 완성합니다.
    3. 작업이 완료되면 편집| 선택 | 마스크 만들기(그림 3B). 다각형 도면에 따라 새로운 반전 마스크가 만들어집니다. 선택한 디렉터리에서 지정된 MaskFiles 폴더에 마스크를 저장합니다. 마스크 파일 명명 방식은 "_mask_file"이 뒤따르는 해당 개별 데이터 파일과 일치해야 합니다. 예를 들어 데이터 파일의 이름이 "VAMP2_488_WT_1.tif"인 경우 해당 마스크 파일의 이름을 "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif"로 지정해야 합니다.
    4. 마스크 파일 찾기 버튼을 사용하여 입금된 사용자 지정 마스크 파일의 선택한 폴더로 이동합니다. 마스크는 마스크 파일을 목록으로 채웁니다.
      참고: 분석을 실행하기 전에 모든 데이터 파일에 대해 마스크를 두는 것이 중요합니다.

4. 분석 및 기능 추출

  1. 디렉터리를 선택하고 데이터 파일 목록과 마스크 파일 목록이 채워진 후 분석 단추(그림4A)를클릭합니다. 외세포 이벤트의 분류가 필요한 경우 5단계로 이동합니다.
    참고: 분석 단추 클릭은 데이터를 분석하기 위해 일련의 자동화된 작업을 수행합니다. 선택한 디렉토리에 개별 폴더를 만들어 분석된 데이터를 예치합니다. 실행 하는 동안, "실행 표시기" 녹색에서 노란색으로 변경 됩니다(그림 4A,빨간색 상자). 분석이 완료되면 다시 녹색으로 변경됩니다.
  2. 각 데이터 파일(그림 4C)에 따라 명명된 전체 분석 파일 세트(기능 추출 파일뿐만 아니라 나중에 분류에 사용할 기능 추출 파일)를 가진 DataFiles폴더(그림 4B)를찾습니다.
    참고: 이러한 분석 파일에 대한 설명은 아래의 대표 결과 섹션에 포함되어 있습니다.

5. 외세포 이벤트의 분류

  1. 자동 감지를 사용하여 외세포 이벤트의 동시 분류를 수행하려면 분석 버튼을 클릭하기 전에 분류 확인란을 선택합니다. 각 외식 이벤트에 대해 각 클래스에 대해 0-1 사이의 확률 점수를 할당합니다. 엑소시틱 이벤트는 해당 클래스의 확률 점수가 0.5> 인 경우 4개 클래스 중 하나로 분류됩니다.
    참고: 분석이 완료되면 선택한 디렉터리 내에 새 데이터 파일 폴더가 나타납니다. 폴더에는 각 이미지 파일에 해당하는 분석 파일이 포함됩니다.

6. 리플리의 K 값을 사용하여 외세포증의 현면 분석

  1. 별도의 "neurite" 및 "소마" 마스크 파일을 만듭니다. 첫째, 중성염으로부터 소마를 분할한다. 중성염에서 소마를 분할하는 편견없는 방법이 없으므로 사용자는 컨디셔닝 실험에 눈을 멀게하고 최상의 판단을 사용해야합니다. 명백한 neurite 확장이없는 타원은 제안됩니다.
  2. 이미지J/피지 오픈.
  3. 마스크 파일을 드래그 앤 드롭하거나 파일 | 사용 마스크 파일을 열고 선택합니다.
  4. 색상 선택 도구를 사용하고 마스크 배경의 검은 색 픽셀을 클릭하여 색상을 검은색으로 설정합니다.
  5. 다각형 선택 도구 또는 프리핸드를 사용하여 소마 주위에 윤곽선을 그려 중성염에서 분리합니다. 이를 위해서는 수동 적인 의사 결정이 필요합니다.
  6. | 편집을 클릭합니다. 선택 | 마스크를 만듭니다. 이미지의 나머지 부분에서 분할된 동그라미 된 소마로 새 이미지가 열립니다. 이렇게 하면 소마 마스크 파일이 생성됩니다.
  7. 그려진 영역을 이동하지 않고 원래 마스크 파일의 헤더를 클릭합니다.
  8. | 편집을 클릭합니다. 중성염만 마스크로 유지되도록 동그라미된 소마를 채우기 위해 채웁니다.
  9. 별도의 neurite 및 마스크 파일을 가져오면 두 마스크 파일을 모두 저장합니다.
  10. Matlab에서 "neurite_2D_network"을 엽니다.
  11. MATLAB에서는 모든 분석 데이터를 사용하여 디렉터리로 이동합니다.
  12. "마스크 파일/ VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"와 같은 노이라이트 마스크의 이름으로 경로 "마스크 이름"을 변경합니다.
  13. "csv_file_name"을 fluorescent_traces.csv 파일이 있는 위치(예: "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv"로 변경합니다.
  14. 실행을 클릭하여 neurite 마스크 파일을 골격화합니다. 이렇게 하면 neurite 마스크 파일의 골격화된 버전이 생성되어 마스크 파일 폴더 아래에 CSV 파일로 기록합니다.
  15. 다음으로 소마에 대한 CSV 파일을 생성합니다. Matlab에서 "CSV_mask_creator.m"를 엽니다.
  16. "마스크 이름"의 경로에 "마스크 이름"을 soma 마스크의 이름으로 넣습니다(예: "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
  17. "쓰기 매트릭스"를 생성할 csv 파일 이름으로 변경합니다(예: "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
  18. 실행 실행을클릭합니다. 이렇게 하면 새 VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv 파일이 만들어집니다.
  19. 모든 마스크 파일에 대해 6.14를 반복합니다.

7. RStudio 설정

  1. Rstudio를 열고 ripleys_k_analysis 열립니다. R 파일.
  2. 도구 | 패키지를 설치하고 "스패츠스타트"에 입력한 다음 설치를클릭합니다.
    참고: Rstudio 설치당 한 번만 수행해야 합니다.
  3. 각 세션의 시작 부분에서 라이브러리 스패츠스타트를 실행합니다.
  4. 이 경우 "neuron_mask"과 "neuron_datapoints"의 두 가지 주요 변수에주의를 기울이세요. 뉴런 마스크는 실행마스크 파일 세트, 즉 소마 마스크 파일을 가리킵니다."
    참고: 모든 소마 마스크 파일을 Neurite 마스크 파일과 별도로 함께 실행하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
  5. 분석할 각 뉴런에 대한 마스크 파일의 .csv 읽습니다.
  6. 추가 neuron_mask_n+1을 복사하여 한 번에 여러 파일을 실행합니다. 이렇게 하면 섹션 8에 설명된 스크립트를 사용하여 Ripley의 분석을 함께 집계할 수 있습니다.
  7. 이제 두 번째 변수인 "neuron_datapoints"을 확인합니다.
  8. 읽어보십시오." X_fluorescent_traces.csv"파일은 외식 이벤트의 x, y, t 위치뿐만 아니라 2D 네트워크에 대한 x,y 위치의 neurite 특정 파일과 함께 분석 프로그램 (모든 extracted_R 파일)에 의해 생성됩니다. 이것은 "neuron_datapoints" 위치에 간다.
  9. RStudio에서 코드 | 선택 실행 지역 | 모든 실행. 이렇게 하면 그룹화된 Ripley의 K 값과 밀도 플롯을 비롯한 여러 플롯이 생성됩니다.
  10. | 내보내서 플롯 저장 이미지 저장 | 적절한 이미지 형식과 디렉토리를 선택하고 적절한 파일 이름을 입력한 다음 저장을 클릭합니다.
    참고: 히트맵의 플로팅 함수는 "플롯(밀도(soma_data,0.4)"을 사용하여 스크립트에서 호출됩니다. 여기서 "0.4"는 밀도 함수가 얼마나 부드럽게 되어야 하는지 나타냅니다. 사용자 데이터에 의미 있는 방식으로 맞게 변경할 수 있지만 다른 히트맵 간에 비교를 수행해야 하는 경우 그 사이에 숫자가 같아야 합니다.
  11. Rstudio에서 이미지를 내보내거나 저장합니다. 히트맵에 추가 편집이 필요한 경우 적절한 파일 유형(SVG 또는 EPS)을 선택합니다.

8. 리플리의 분석

참고: Ripleys_k_analysis. R 파일은 또한 자동으로 리플리의 k 값 플롯을 생성. 전체 스크립트를 실행하면 아래에 언급된 함수가 자동으로 실행되지만 스크립트의 각 부분을 개별적으로 실행하거나 분석을 변경하려는 경우 자세히 포함됩니다.

  1. 먼저 각 셀에 대한 봉투 함수를 실행합니다. 이 함수는 완전한 공간 임의성(CSR)을 시뮬레이션하여 리플리의 K 값에 대한 외식 이벤트 포인트 패턴을 테스트했습니다.
    Data_envelope_1 = 봉투(soma_data_1, 키스, nsim = 19, 세이브펀 = TRUE)
    Data_envelope_2 = 봉투(soma_data_2, 키스, nsim = 19, 세이브펀 = TRUE)
  2. 다음으로 이러한 봉투를 함께 풀을 짜고 그룹에 대한 CSR 추정치하나를 만듭니다.
    Pool_csr = 풀(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
    그런 다음 모든 데이터 포인트에 대해 Ripley의 K 함수를 실행합니다.
    Data_ripleys_k_1 = 키스 (soma_data_1, 비율 = TRUE)
    Data_ripleys_k_2 = 키스 (soma_data_2, 비율 = TRUE)
  3. 완료되면 리플리의 K 값을 함께 풀링하고 다음 명령으로 자신감 간격을 부트스트랩합니다.
    데이터 풀 = 풀(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
  4. 다음 명령이 있는 부트스트랩:
    Final_Ripleys_K = varblock (재미 = 키스, Data_pool)
  5. 데이터를 플롯합니다.
  6. 통계적 차이가 어려운 경우 학생 순열 테스트가 스패츠스타트 패키지에 포함되어 포인트 패턴 그룹 간의 차이를 테스트합니다.
    Test_difference = studpermu.test (all_points_to_test, exocytic_events ~ 그룹, nperm = np).

결과

여기서GUI(그림 2A)는TIRF(총 내부 반사 형광) 현미경을 사용하여 3DIV에서 뉴런을 발현하는 3개의 VAMP2-pHluorin으로부터 의 외세포 이벤트를 분석하는 데 활용되었다. E15.5 피질 뉴런은 격리되었고, 그 다음으로 VAMP2-pHluorin과 함께 트랜스페팅및 윙클 등에서 설명된 프로토콜을 이용한 도금 및 도금에 의해 2016년 및 비셀만 외, 20111년11,12. ...

토론

외식 감지 및 분석 소프트웨어를 사용하는 경우 프로그램은 무손실 압축 .tif 파일만 입력으로 수락한다는 점을 고려하십시오. .tif 이미지 파일은 8비트, 16비트 또는 32비트 그레이스케일(단일 채널) 이미지일 수 있습니다. 다른 이미지 형식은 입력하기 전에 이러한 유형 중 하나로 변환해야 합니다. 참고로 여기에서 사용되는 예제는 16비트 회색 크기 이미지입니다.

자동 감지 ?...

공개

저자는 공개 할 것을 선언하지 않습니다.

감사의 말

우리는 코드와 GUI를 테스트 더스틴 Revell 및 레지널드 에드워즈 감사합니다. 자금은 이 연구를 지원하는 국립 보건원에 의해 제공되었습니다: R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG), F31NS103586 (독감)을 포함.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
RR Core Teamhttps://www.r-project.org/
RstudioRstudio, PBChttps://rstudio.com/

참고문헌

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