Автоматизированное обнаружение и анализ экзоцитоза

Резюме

Мы разработали автоматизированное программное обеспечение для компьютерного зрения для обнаружения экзоцитарных событий, отмеченных pH-чувствительными флуоресцентными зондами. Здесь мы демонстрируем использование графического пользовательского интерфейса и RStudio для обнаружения событий слияния, анализа и отображения пространственно-временных параметров слияния и классификации событий в различные режимы слияния.

Аннотация

Замедленная TIRF-микроскопия pH-чувствительного GFP (pHluorin), прикрепленного к белкам SNARE везикул, является эффективным методом визуализации одиночных экзоцитарных событий в клеточной культуре. Для проведения непредвзятой, эффективной идентификации и анализа таких событий в MATLAB был разработан и внедрен подход, основанный на компьютерном зрении. Конвейер анализа состоит из алгоритма сегментации клеток и идентификации экзоцитарных событий. Подход компьютерного зрения включает в себя инструменты для исследования множественных параметров единичных событий, включая период полураспада флуоресценции и пик ΔF/F, а также общеклеточный анализ частоты экзоцитоза. Эти и другие параметры синтеза используются в классификационном подходе для различения различных режимов синтеза. Здесь недавно созданный графический интерфейс выполняет конвейер анализа от начала до конца. Дальнейшая адаптация K-функции Рипли в R Studio используется для различения кластеризованным, рассеянным или случайным возникновением событий слияния как в пространстве, так и во времени.

Введение

Конструкции VAMP-pHluorin или конструкции рецептора трансферрина (TfR)-pHuji являются отличными маркерами экзоцитарных событий, поскольку эти pH-чувствительные флуорофоры гасятся в просвете кислых езикул и флуоресцируют сразу после открытия пор слияния между везикулой и плазматической мембраной^1. После открытия пор синтеза флуоресценция распадается экспоненциально, с некоторой неоднородностью, которая раскрывает информацию о событии синтеза. Здесь описано приложение графического интерфейса пользователя (GUI), которое автоматически обнаруживает и анализирует экзоцитарные события. Это приложение позволяет пользователю автоматически обнаруживать экзоцитарные события, выявленные чувствительными к pH маркерами^2, и генерировать признаки из каждого события, которые могут быть использованы для целей классификации³ (рисунок 1A). Кроме того, описан анализ кластеризации экзоцитарных событий с использованием K-функции Рипли.

Автоматизированная классификация экзоцитарных событий в различные экзоцитарные режимы была недавно сообщена³. Два режима экзоцитоза, полное везикулярное слияние (FVF) и слияние поцелуев (KNR), ранее были описаны^4,5,6,7. Во время FVF пора слияния расширяется, и везикула включается в плазматическую мембрану. Во время KNR пора плавления временно открывается, а затем повторно засовывает^4,5,8,9,10. Четыре режима экзоцитоза были идентифицированы в развивающихся нейронах, два из которых связаны с FVF и два связаны с KNR. Эта работа демонстрирует, что как FVF, так и KNR могут быть дополнительно подразделены на события синтеза, которые немедленно переходят к флуоресцентному распаду (FVFi и KNRi) после открытия пор синтеза или экзоцитарным событиям, которые проявляют задержку после открытия пор синтеза до начала распада флуоресценции (FVFd и KNRd)(рисунок 1B). Классификатор определяет режим экзоцитоза для каждого события слияния. Здесь этот анализ был включен в графический интерфейс, который может быть установлен в MATLAB в операционных системах windows и Mac. Все файлы анализа можно найти по адресу https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing или
https://github.com/GuptonLab.

протокол

1. Выберите наборы данных и каталог

1. Чтобы выбрать наборы данных для анализа, нажмите кнопку Find Datasets (рисунок 2A,красное поле 1),чтобы перейти в папку, в которую депонируются данные (например, папка RawData). Файлы данных автоматически заполняют файлы данных в виде списка. В папке может быть несколько наборов данных.
2. Нажмите кнопку Выбрать каталог и выберите каталог (например, Test), в который будут депонироваться анализируемые файлы(рисунок 2A,красное поле 2). Набор папок и готовых файлов анализа, а также промежуточные временные образы будут созданы в этом каталоге при нажатии кнопки Анализ. Ошибки будут вытекать, если каталог не выбран.

2. Установите размер пикселя и частоту кадров

1. Заполните соответствующую частоту кадров и размер пикселя изображений в соответствующем поле «Частота кадров» или «Размер пикселя»(рисунок 2A,зеленое поле). Если значения не указаны (они установлены на «0» по умолчанию), то программа будет искать метаданные, связанные с файлом, на частоту кадров и размер пикселя. Если эти значения не могут быть найдены, программа по умолчанию будет использовать попиксель для измерения и для кадра для точек времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном примере частота кадров составляет 100, а размер пикселя — 0,08.

3. Выберите или сделайте маски

1. Используйте кнопку Mask Maker для автоматического создания масок ячеек для данных в списке наборов данных файлов(рисунок 2A,синий лист). При использовании кнопки Mask Maker будет создана новая папка в выбранном каталоге с именем MaskFiles. Индикатор «Пробежать» станет желтым во время бега и вернется к зеленому цвету после завершения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Маска для каждого файла в списке Файлы данных будет создана из первых 10 кадров файла изображения (или из всех кадров, если в файле изображения менее 10) и депонирована в папку MaskFiles с использованием правильной схемы именования (описанной ниже).
2. Убедитесь, что маски автоматически заполняют список Файлы масок. Пользователь может перейти непосредственно к анализу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда визуально проверяйте файлы масок и подтверждайте, что они захватывают всю интересуемую область. Первый кадр файла данных и файл маски отображаются в пользовательском интерфейсе при выборе. (Рисунок 2B). Mask Maker может выдавать ошибки в случае низкого уровня шума, поэтому проверка того, что файлы масок соответствуют, имеет решающее значение для контроля качества.
3. В качестве альтернативы использованию Mask Maker, если сигнал к шуму изображений недостаточен, создайте маски вручную в ImageJ.
   1. Сначала откройте файл необработанного изображения в ImageJ(рисунок 3A).
   2. Нажмите кнопку «Выделение полигонов» и нажмите, чтобы нарисовать маску вокруг ячейки. После завершения дважды щелкните последнюю точку, чтобы завершить полигон.
   3. После завершения перейдите в раздел Изменить | | выбора Создать маску (рисунок 3B). Новая перевернутая маска будет создана на основе полигональной чертежи. Сохраняйте маски в указанной папке MaskFiles в выбранном каталоге. Схема именования файлов маски должна соответствовать соответствующим отдельным файлам данных, за которыми следует «_mask_file». Например, если файл данных называется «VAMP2_488_WT_1.tif», соответствующий файл маски должен называться «VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif».
   4. Используйте кнопку Найти файлы масок для перехода к выбранной папке депонированных пользовательских файлов масок. Маски будут заполнять файлы масок в виде списка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно иметь маску для каждого файла данных перед запуском анализа.

4. Анализ и извлечение признаков

1. После того, как каталог выбран и список файлов данных и список файлов mask заполнены, нажмите кнопку Analysis (рисунок 4A). Если требуется классификация экзоцитарных событий, перейдите к шагу 5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нажатие кнопки Анализ выполнит ряд автоматизированных задач по анализу данных. Он создаст отдельные папки в выбранном каталоге для депонирования проанализированных данных. Во время бега индикатор «пробега» изменится с зеленого на желтый(рисунок 4А,красное поле). После завершения анализа он изменится обратно на зеленый.
2. Найдите папку DataFiles(рисунок 4B)с полным набором файлов анализа (а также файлов извлечения объектов, которые будут использоваться в классификации позже), названных в соответствии с каждым файлом данных(рисунок 4C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описание этих аналитических файлов приведено ниже в разделе «Репрезентативные результаты».

5. Классификация экзоцитарных событий

1. Чтобы выполнить одновременную классификацию экзоцитарных событий с автоматическим обнаружением, установите флажок Классификация перед нажатием кнопки Анализ. Для каждого экзоцитического события присвойте оценке вероятности от 0 до 1 для каждого класса. Экзоцитическое событие считается классифицированным как один из четырех классов, если оценка вероятности для этого класса составляет > 0,5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения анализа в выбранном каталоге появится новая папка с файлами данных. Папка будет содержать файлы анализа, соответствующие каждому файлу изображения.

6. Пространственно-временный анализ экзоцитоза с использованием значений K Рипли

1. Создайте отдельный файл маски «нейрит» и «сома». Во-первых, сегментируйте сому от нейрита. Не существует непредвзятого метода сегментации сомы от нейритов, поэтому пользователь должен быть ослеплен экспериментом по обусловливаниям и использовать наилучшее суждение; предлагается эллипсоид без явных расширений нейритов.
2. Открыть ImageJ/Фиджи.
3. Перетащите файл маски или используйте | Откройте и выберите файл маски.
4. Используйте инструмент палитры цветов и нажмите на любой из черных пикселей на фоне маски, чтобы установить черный цвет.
5. Используйте инструмент выделения полигонов или от руки, чтобы нарисовать контур вокруг сомы, отделив ее от нейритов. Это требует ручного принятия решений.
6. Нажмите Изменить | | выбора Сделать маску. Откроется новое изображение с обведенным сомой, сегментированной от остальной части изображения. Это создаст файл маски soma.
7. Не перемещая нарисованную область, щелкните заголовок исходного файла маски.
8. Нажмите Изменить | Заполните, чтобы заполнить обведенные сомы так, чтобы маской оставались только нейриты.
9. После получения отдельных файлов нейритов и масок сохраните оба файла маски.
10. Откройте «neurite_2D_network» в Матлабе.
11. В MATLAB перейдите в каталог со всеми данными анализа.
12. Измените путь "имя маски" на имя нейритной маски, т.е. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
13. Измените "csv_file_name" на "fluorescent_traces.csv файл", т.е. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
14. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы скелетировать файл маски нейрита. При этом создается скелетонизированная версия файла маски нейрита и он депонируется как CSV-файл в папку maskfiles.
15. Затем создайте CSV-файл для soma. Откройте «CSV_mask_creator.m» в Матлабе.
16. Вставьте путь для "имени маски" к имени маски сомы, т.е. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. Измените "writematrix" на csv имя создаваемого файла, т.е. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
18. Нажмите кнопку Выполнить. При этом будет создастся новый файл VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
19. Повторите 6.14 для каждого файла маски.

7. Настройка RStudio

1. Откройте Rstudio и откройте ripleys_k_analysis. R файл.
2. Установите пакет "spatstat" в RStudio, перейдя в Tools | Установите пакеты и введите "spatstat" с последующим нажатием кнопки Установить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо выполнить только один раз для установки Rstudio.
3. Запускаем библиотеку spatstat в начале каждого сеанса.
4. Обратите внимание на две основные переменные в этом случае: «neuron_mask» и «neuron_datapoints». Neuron Mask указывает на набор файлов масок для запуска, то есть файлы масок soma».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите все файлы масок soma вместе, отдельно от файлов маски Neurite, и наоборот.
5. Прочитайте в .csv файлов масок для каждого из анализируемых нейронов.
6. Запускайте несколько файлов одновременно, копируя дополнительные neuron_mask_n+1. Это позволит агрегировать анализ Рипли вместе, используя скрипт, описанный в разделе 8.
7. Теперь проверьте вторую переменную, "neuron_datapoints".
8. Читайте в». X_fluorescent_traces.csv" файл, сгенерированный программой анализа (по функциям всех extracted_R файл) с позициями x,y,t экзоцитических событий, а также нейрит-специфическим файлом позиций x,y для 2D-сети. Это идет в позиции «neuron_datapoints».
9. В RStudio выберите код | | региона запуска Запустите все. Это генерирует несколько графиков, включая сгруппированные значения K Рипли, а также графики плотности.
10. Сохраните участки, перейдя в Экспорт | Сохранить изображение как | Выберите соответствующий формат изображения и каталог, а затем введите соответствующее имя файла, затем нажмите кнопку Сохранить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функция построения тепловых карт вызывается в скрипте с использованием "plot(density(soma_data,0.4))". Число «0,4» здесь показывает, насколько сглаженной должна быть функция плотности. Его можно изменить, чтобы он соответствовал пользовательским данным значимым образом, но если сравнение должно выполняться между различными тепловыми картами, число должно быть одинаковым между ними.
11. Экспорт или сохранение изображения из Rstudio. Если тепловая карта требует дальнейшего редактирования, выберите соответствующий тип файла (SVG или EPS).

8. Анализ Рипли

ПРИМЕЧАНИЕ: Ripleys_k_analysis. Файл R также автоматически генерировал графики k значений Рипли. Запуск всего скрипта автоматически запустит функции, упомянутые ниже, но он включен в детали, если кто-то хочет запустить каждую часть скрипта отдельно или внести изменения в анализ.

1. Сначала запустите функцию оболочки для каждой ячейки. Эта функция имитировала полную пространственную случайность (CSR) для проверки значения K Рипли экзоцитарной точки события.
   Data_envelope_1 = конверт (soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
   Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
2. Затем объедините эти конверты вместе и создайте одну оценку КСО для группы:
   Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
   Затем запустите функцию K Рипли для всех точек данных.
   Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = TRUE)
   Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE)
3. После завершения объедините значения K Рипли вместе и загрузите их доверительные интервалы с помощью следующей команды:
   Data pool = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
4. Начальная загрузка с помощью следующей команды:
   Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)
5. Построение данных.
6. Если требуется жесткая статистическая разница, Studentised Permutation Test включается в пакет spatstat для проверки разницы между группами точечных паттернов:
   Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np).

Результаты

Здесь графический интерфейс(рисунок 2A)использовался для анализа экзоцитарных событий из трех VAMP2-pHluorin,экспрессирующих нейроны при 3 DIV с использованием микроскопии TIRF (полная флуоресценция внутреннего отражения). Корковые нейроны E15.5 были выделены с последующей трансф?...

Обсуждение

При использовании программного обеспечения для обнаружения и анализа экзоцитов, пожалуйста, учитывайте, что программа принимает только сжатие без потерь .tif файлы в качестве входных данных. Файлы изображений .tif могут быть 8-битными, 16-битными или 32-битными изображениями в градациях сер?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R	R Core Team		https://www.r-project.org/
Rstudio	Rstudio, PBC		https://rstudio.com/