JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתחנו תוכנת ראייה ממוחשבת אוטומטית לזיהוי אירועים אקסוציאטיים המסומנים על ידי בדיקות פלואורסצנטיות רגישות ל- pH. כאן, אנו מדגימים את השימוש בממשק משתמש גרפי ו- RStudio כדי לזהות אירועי היתוך, לנתח ולהציג פרמטרים spatiotemporal של היתוך, ולסווג אירועים למצבי היתוך נפרדים.

Abstract

מיקרוסקופיית Timelapse TIRF של GFP רגיש ל-pH (pHluorin) המצורפת לחלבוני SNARE ארסיים היא שיטה יעילה לדמיין אירועים אקסוציאטיים ארסיים בודדים בתרבית התאים. כדי לבצע זיהוי וניתוח יעילים ובלתי משוחדים של אירועים כאלה, פותחה ויושמה גישה מבוססת ראייה ממוחשבת ב- MATLAB. צינור הניתוח מורכב מפילוח תאים ומאלגוריתם זיהוי אירועים אקסוציאטיים. גישת הראייה הממוחשבת כוללת כלים לחקירת פרמטרים מרובים של אירועים בודדים, כולל מחצית החיים של דעיכה פלואורסצנטית ושיא ΔF/F, כמו גם ניתוח תאים שלמים של תדירות האקסוציאטוזיס. פרמטרים אלה ואחרים של היתוך משמשים בגישה סיווג להבחין מצבי היתוך נפרדים. כאן GUI שנבנה לאחרונה מבצע את צינור הניתוח מתחילתו ועד סופו. עיבוד נוסף של פונקציית K של ריפלי ב- R Studio משמש להבחנה בין מופע מקובץ באשכולות, מפוזרים או אקראיים של אירועי היתוך הן במרחב והן בזמן.

Introduction

מבנים VAMP-pHluorin או קולטן העברה (TfR)-pHuji מבנים הם סמנים מצוינים של אירועים אקסוציאטיים, כמו אלה פלואורופורים רגישים pH מרווים בתוך לומן ארסית חומצה פלואורסצ'ה מיד עם פתיחת נקבובית היתוך בין קרום הלסת ופלזמה1. לאחר פתיחת נקבוביות היתוך, פלואורסצנטיות מתפורר באופן אקספוננציאלי, עם קצת הטרוגניות החושפת מידע על אירוע ההיתוך. כאן, מתואר יישום ממשק משתמש גרפי (GUI) המזהה ומנתח באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים. יישום זה מאפשר למשתמש לזהות באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים שנחשפו על ידי סמנים רגישים ל- pH2 וליצור תכונות מכל אירוע שניתן להשתמש בה למטרות סיווג3 (איור 1A). בנוסף, מתואר ניתוח של קיבוץ אירועים אקסוציאטיים באמצעות הפונקציה K של ריפלי.

הסיווג האוטומטי של אירועים אקסוציאטיים למצבים אקסוציאטיים שונים דווח לאחרונה3. שני מצבים של אקסוציאטוזיס, היתוך ארסיה מלאה (FVF) ואקוציאציה של נשיקה וריצה (KNR) תוארו בעבר4,5,6,7. במהלך FVF, נקבובית ההיתוך מתרחבת, ואת ההדבקה משולבת לתוך קרום הפלזמה. במהלך KNR, נקבובית ההיתוך נפתחת באופן ארעי ולאחר מכן חותם מחדש4,5,8,9,10. ארבעה מצבים של אקסוציאטוזיס זוהו בפיתוח נוירונים, שניים הקשורים FVF ושניים הקשורים KNR. עבודה זו מדגימה כי הן FVF והן KNR ניתן לחלק עוד לאירועי היתוך הממשיכים מיד לריקבון פלואורסצנטיות (FVFi ו- KNRi) לאחר פתיחת נקבוביות היתוך או אירועים אקסוציטיים המציגים עיכוב לאחר פתיחת נקבובית היתוך לפני תחילת דעיכה פלואורסצנטית (FVFd ו- KNRd) (איור 1B). המסווג מזהה את מצב האקסוציאטוזיס עבור כל אירוע היתוך. כאן ניתוח זה שולב ב- GUI שניתן להתקין ב- MATLAB במערכות הפעלה מבוססות Windows ו- Mac. ניתן למצוא את כל קבצי הניתוח https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing או
https://github.com/GuptonLab.

Protocol

1. בחירת ערכות נתונים וספריות

  1. כדי לבחור ערכות נתונים לניתוח, לחץ על לחצן חפש ערכות נתונים (איור 2A, תיבה אדומה 1) כדי לנווט לתיקיה שבה נתונים מופקדים (לדוגמה, התיקיה RawData). קבצי נתונים יאוכלסו באופן אוטומטי את קבצי הנתונים כרשימה. יכולה להיות יותר מעריפת נתונים אחת בתיקיה.
  2. לחץ על לחצן בחר ספריה ובחר את הספריה (למשל, בדיקה) שבה יופקדו קבצים שנותחו (איור 2A, תיבה אדומה 2). קבוצה של תיקיות וקבצי ניתוח מוגמרים וכן תמונות זמניות ביניים ייווצרו בספריה זו בעת לחיצה על לחצן ניתוח. שגיאות יופקו אם לא נבחרה ספריה.

2. הגדר את גודל הפיקסלים ואת קצב המסגרות

  1. מלאו את קצב הפריימים והפיקסל המתאימים של התמונות בתיבה המתאימה "Framerate" או "גודל פיקסל"(איור 2A, תיבה ירוקה). אם לא סופקו ערכים (הם מוגדרים לברירת המחדל "0"), התוכנית תחפש במטה-נתונים המשויכים לקובץ אחר קצב המסגרות וגודל הפיקסלים. אם לא ניתן למצוא ערכים אלה, התוכנית תהיה ברירת המחדל לפיקסל למדידה ולמסגרת עבור נקודות זמן.
    הערה: בדוגמה שסופקה, קצב המסגרות הוא 100 וגודל הפיקסלים הוא 0.08.

3. לבחור או להכין מסכות

  1. השתמש בלחצן יוצר מסיכות כדי ליצור באופן אוטומטי מסיכות תאים עבור הנתונים ברשימת ערכות הנתונים של הקבצים(איור 2A, תיבה כחולה). בעת השימוש בלחצן יוצר מסיכות, תיקיה חדשה בספריה שנבחרה תיווצר בשם MaskFiles. "מחוון ההפעלה" יהפוך לצהוב בעת ריצה ויחזור לירוק עם השלמתו.
    הערה: מסיכה עבור כל קובץ ברשימה קבצי נתונים תיווצר מתוך 10 המסגרות הראשונות של קובץ התמונה (או מכל המסגרות אם פחות מ- 10 נמצאות בקובץ התמונה) ותופקד בתיקיה MaskFiles באמצעות ערכת מתן השמות המתאימה (המתוארת להלן).
  2. ודא שקבצי המסיכה מאכלסים באופן אוטומטי את הרשימה 'קבצי מסיכה'. המשתמש רשאי להמשיך ישירות לניתוח.
    הערה: בדוק תמיד באופן חזותי קבצי מסיכה ואשר שהם לוכדים את כל אזור העניין. המסגרת הראשונה של קובץ הנתונים וקובץ המסיכה מוצגים בממשק המשתמש כאשר אפשרות זו נבחרת. (איור 2B). יוצר המסכות עשוי ליצור שגיאות במקרה של אות לרעש נמוך, כך שאימות שקבצי מסיכה מתאימים הוא קריטי לבקרת איכות.
  3. כחלופה לשימוש ב-Mask Maker, אם האות לרעש של תמונות אינו מספיק, צור מסיכות באופן ידני ב-ImageJ.
    1. תחילה, פתחו את קובץ התמונה הגולמי ב- ImageJ (איור 3A).
    2. לחץ על לחצן בחירת מצולע ולחץ כדי לצייר מסיכה סביב התא. לאחר סיום, לחץ פעמיים על הנקודה האחרונה כדי להשלים את המצולע.
    3. לאחר סיום, נווט אל ערוך | בחירת | צור מסיכה (איור 3B). מסיכה הפוכה חדשה תיווצר בהתבסס על ציור המצולע. שמור מסיכות בתיקיה ייעודית של קבצי מסיכה בספריה שנבחרה. ערכת מתן השמות של קובץ המסיכה חייבת להתאים לקבצי הנתונים הבודדים המתאימים ואחריה "_mask_file". לדוגמה, אם קובץ נתונים נקרא "VAMP2_488_WT_1.tif", יש להיקרא קובץ המסיכה המתאים "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".
    4. השתמש בלחצן חפש קבצי מסיכה כדי לנווט לתיקיה שנבחרה של קבצי מסיכה מותאמים אישית שהופקדו. המסכות יאכלסו את קבצי המסכה כרשימה.
      הערה: חשוב שתהיה מסיכה עבור כל קובץ נתונים לפני הפעלת הניתוח.

4. ניתוח ומיצוי תכונות

  1. לאחר בחירת הספריה והרשימה קבצי נתונים וקבצי מסיכה יאוכלסו, לחץ על לחצן ניתוח (איור 4A). אם נדרש סיווג של אירועים אקסוציאטיים, עבור לשלב 5.
    הערה: לחיצת לחצן ניתוח תבצע סדרה של משימות אוטומטיות כדי לנתח את הנתונים. הוא ייצור תיקיות בודדות בספריה שנבחרה להפקדת נתונים מנותחים. במהלך הריצה, "מחוון הריצה" ישתנה מירוק לצהוב(איור 4A,תיבה אדומה). לאחר סיום הניתוח, זה ישתנה בחזרה לירוק.
  2. מצא תיקיית DataFiles(איור 4B) עם ערכה מלאה של קבצי ניתוח (כמו גם קבצי חילוץ תכונות, שישמשו בסיווג מאוחר יותר) הנקראים על פי כל קובץ נתונים (איור 4C).
    הערה: תיאור של קבצי ניתוח אלה נכלל להלן בסעיף תוצאות מייצגות.

5. סיווג אירועים אקסוציאטיים

  1. כדי לבצע סיווג סימולטני של אירועים אקסוציאטיים עם זיהוי אוטומטי, סמן את תיבת הסימון סיווג לפני לחיצה על לחצן ניתוח. עבור כל אירוע אקסוציאטי, הקצה ציון הסתברות בין 0-1 עבור כל מחלקה. אירוע אקסוציאטי נחשב מסווג כאחת מארבע הכיתות אם ציון ההסתברות עבור כיתה זו הוא > 0.5.
    הערה: לאחר השלמת הניתוח, תופיע תיקיית קובץ נתונים חדשה בתוך הספריה שנבחרה. התיקיה תכיל קבצי ניתוח המתאימים לכל קובץ תמונה.

6. ניתוח Spatiotemporal של אקסוציטוזיס באמצעות ערכי K של ריפלי

  1. צור קובץ מסיכה נפרד "נויריט" ו"סומה". ראשית, קטע את הסומה מהנויריט. אין שיטה משוחדת לפולח הסומה מהנוריטים, ולכן המשתמש צריך להיות עיוור לניסוי ההתניה ולהשתמש בשיקול הדעת הטוב ביותר; אליפסואיד ללא הרחבות נויריט ברורות מוצע.
  2. פתח את ImageJ/פיג'י.
  3. גרור ושחרר את קובץ המסיכה או השתמש | קובץ פתח ולאחר מכן בחר את קובץ המסיכה.
  4. השתמשו בכלי דוקרן הצבעים ולחצו על כל אחד מהפיקסלים השחורים ברקע המסיכה כדי להגדיר את הצבע לשחור.
  5. השתמש בכלי בחירת המצולעים או ביד חופשית כדי לצייר קו מתאר סביב הסומה, להפריד אותו מהנוריטים. זה דורש קבלת החלטות ידנית.
  6. לחץ על ערוך | בחירת | הפוך מסכה. תמונה חדשה תיפתח כאשר הסומה המקיפה מפולחת משאר התמונה. פעולה זו תיצור קובץ מסיכת סומה.
  7. מבלי להזיז את האזור המצויר, לחץ על הכותרת של קובץ המסיכה המקורי.
  8. לחץ על ערוך | מלאו כדי למלא את הסומה המקיפה כך שרק הנוריטים יישארו המסכה.
  9. לאחר קבלת קבצי נוריט ומסיכות נפרדים, שמור את שני קבצי המסיכה.
  10. פתח את "neurite_2D_network" במטלב.
  11. ב- MATLAB, נווט לספריה עם כל נתוני הניתוח.
  12. שנה את הנתיב "שם מסיכה" לשם מסיכת הנויריט, כלומר , "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
  13. שנה את ה"csv_file_name" למקום שבו נמצא קובץ fluorescent_traces.csv, כלומר "קבצי מסיכה/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
  14. לחץ על הפעל כדי לשלד את קובץ מסיכת הנוריט. פעולה זו יוצרת גרסה שלד של קובץ מסיכת הנויריט ומפקידה אותו כקובץ CSV מתחת לתיקיה maskes.
  15. לאחר מכן, צור קובץ CSV עבור הסומה. פתח את "CSV_mask_creator.m" במטלב.
  16. שים את הנתיב עבור "שם המסכה" לשם מסכת סומה, כלומר, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
  17. שינוי "writematrix" לשם הקובץ csv שיש ליצור, כלומר, "קבצי מסיכה/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
  18. לחץ על הפעל. פעולה זו יוצרת את קובץ VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv החדש.
  19. חזור על 6.14 עבור כל קובץ מסכה.

7. הגדרת RStudio

  1. פתח את Rstudio ופתח ripleys_k_analysis. קובץ R.
  2. התקן את החבילה "spatstat" ב- RStudio על-ידי כך שהיכנס אל כלים | התקן חבילות והקלדה ב- "spatstat" ולאחר מכן לחיצה על התקן.
    הערה: יש לבצע זאת רק פעם אחת לכל התקנת Rstudio.
  3. הפעל את יריית הספריה בתחילת כל הפעלה.
  4. שים לב לשני משתנים עיקריים במקרה זה: "neuron_mask" ו "neuron_datapoints". מסיכת נוירון מצביעה על ערכת קבצי המסכה להפעלה, כלומר קבצי מסכת סומה."
    הערה: הפעל את כל קבצי מסכת סומה יחד, בנפרד מקבצי מסיכת Neurite, ולהיפך.
  5. קרא .csv של קבצי המסכה עבור כל אחד הנוירונים להיות מנותח.
  6. הפעל קבצים מרובים בו-זמנית על-ידי העתקת neuron_mask_n+1 נוספים. זה יאפשר לצבור את הניתוח של ריפלי יחד, באמצעות התסריט המתואר בסעיף 8.
  7. עכשיו לבדוק את המשתנה השני, "neuron_datapoints".
  8. קרא ב." קובץ X_fluorescent_traces.csv" שנוצר על ידי תוכנית הניתוח (על ידי תכונות כל extracted_R קובץ) עם x, y,t מיקומים של האירועים האקסוציאטיים, כמו גם את הקובץ הספציפי neurite של מיקומי x,y עבור רשת 2D. זה הולך בתנוחת "neuron_datapoints".
  9. ב- RStudio בחר | קוד הפעל | אזור הפעל את כל. זה יוצר מספר חלקות, כולל ערכי K המקובצים של ריפלי, כמו גם חלקות צפיפות.
  10. שמור חלקות על-ידי כך שתלך אל ייצוא | שמירת תמונה | בחר תבנית תמונה לספריה מתאימה וקלט את שם הקובץ המתאים ולאחר מכן לחץ על שמור.
    הערה: פונקציית התוויית התוויות עבור מפת החום נקראת בתסריט באמצעות "התוויה(צפיפות(soma_data,0.4)". המספר "0.4" כאן מייצג עד כמה פונקציית הצפיפות צריכה להיות חלקה. ניתן לשנות אותו כך שיתאים לנתוני משתמשים בצורה משמעותית, אך אם יש לבצע השוואות בין מפת חום שונות, המספר חייב להיות זהה ביניהן.
  11. יצא או שמור תמונה מ- Rstudio. אם מפת חום דורשת עריכה נוספת, בחרו סוג קובץ מתאים (SVG או EPS).

8. הניתוח של ריפלי

הערה: Ripleys_k_analysis. קובץ R גם יצר באופן אוטומטי את התוויות ערך k של ריפלי. הפעלת קובץ ה- Script כולו תריץ באופן אוטומטי את הפונקציות המוזכרות להלן, אך הוא ייכלל בפירוט אם ברצונך להפעיל כל חלק של קובץ ה- Script בנפרד או לבצע שינויים בניתוח.

  1. ראשית, הפעל את פונקציית המעטפה עבור כל תא. פונקציה זו דימתה אקראיות מרחבית מלאה (CSR) כדי לבדוק את ערך ה- K של ריפלי של תבנית נקודת האירוע האקסוציאטית נגד.
    Data_envelope_1 = מעטפות(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
    Data_envelope_2 = מעטפות(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
  2. לאחר מכן, איחד מעטפות אלה וצור הערכה אחת של CSR עבור הקבוצה:
    Pool_csr = בריכה (Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
    לאחר מכן, הפעל את הפונקציה K של ריפלי עבור כל נקודות הנתונים.
    Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, יחס = TRUE)
    Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, יחס = TRUE)
  3. לאחר השלמת הפעולה, חברו יחד את ערכי ה-K של ריפלי ואפטרו את מרווחי הביטחון שלהם באמצעות הפקודה הבאה:
    מאגר נתונים = מאגר (Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)
  4. אתחול באמצעות הפקודה הבאה:
    Final_Ripleys_K = varblock(כיף = Kest, Data_pool)
  5. התווה את הנתונים.
  6. אם נדרש הבדל סטטיסטי קשיח, מבחן התמורות לתלמידים נכלל בחבילת spatstat כדי לבדוק הבדל בין קבוצות של דפוסי נקודות:
    Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ קבוצה, nperm = np).

תוצאות

כאן נעשה שימוש ב- GUI(איור 2A)כדי לנתח אירועים אקסוציאטיים משלושה VAMP2-pHluorin המביעים נוירונים ב- 3 DIV באמצעות TIRF (פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת). E15.5 נוירונים קליפת המוח היו מבודדים, ואחריו transfection עם VAMP2-pHluorin ו ציפוי באמצעות הפרוטוקולים כפי שמתואר Winkle ואח ', 2016 ו Viesselmann ואח ', 2011<...

Discussion

בעת שימוש בתוכנת הזיהוי והניתוח האקסוציאטית, שקול שהתוכנית מקבלת דחיסה ללא אובדן נתונים בלבד .tif קבצים כקלט. קבצי התמונה .tif עשויים להיות תמונות בגווני אפור של 8 סיביות, 16 סיביות או 32 סיביות (ערוץ יחיד). יש להמיר תבניות תמונה אחרות לאחד מסוגים אלה לפני הקלט. לעיון, דוגמאות המשמשות כאן הן תמונו?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לדסטין רבל ורג'ינלד אדוארדס על בדיקת הקוד וה-GUI. המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות נתמך מחקר זה: כולל R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) ו F31NS103586 (שפעת).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
RR Core Teamhttps://www.r-project.org/
RstudioRstudio, PBChttps://rstudio.com/

References

  1. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  2. Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
  3. Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
  4. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
  5. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  6. He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
  7. Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
  8. Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
  9. Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
  10. Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
  11. Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
  12. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
  13. Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
  14. Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
  15. Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
  16. Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved