外分泌物的自动检测和分析

摘要

我们开发了自动计算机视觉软件，以检测以pH敏感荧光探头为标志的外细胞事件。在这里，我们演示了使用图形用户界面和 RStudio 来检测聚变事件、分析和显示聚变空间参数，并将事件分类为不同的聚变模式。

摘要

附着在囊泡SNARE蛋白上的pH敏GFP（普鲁鲁林）的延时TIRF显微镜是可视化细胞培养中单囊外事件的有效方法。为了对此类事件进行公正、高效的识别和分析，MATLAB 开发并实施了基于计算机视觉的方法。分析管道由细胞分割和外阴事件识别算法组成。计算机视觉方法包括用于调查单个事件的多个参数的工具，包括荧光衰变和峰值 +F/F 的半衰期，以及外细胞病频率的全细胞分析。这些和其他聚变参数用于分类方法，以区分不同的聚变模式。在这里，新建的 GUI 从头到尾执行分析管道。进一步适应Ripley在R工作室的K功能用于区分在空间和时间的聚类，分散或随机发生的融合事件。

引言

VAMP-普鲁林构造或转移素受体（TfR）-pHuji构造是外延事件的优秀标志，因为这些pH敏感荧光在囊泡和等离子膜¹之间的融合孔隙打开后立即在酸囊性流明和荧光中淬火。聚变孔打开后，荧光呈指数级衰变，具有一些异质性，揭示了有关聚变事件的信息。在此处，描述了一个图形用户界面 （GUI） 应用程序，该应用程序可自动检测和分析外显事件。此应用程序允许用户自动检测 pH 敏感标记² 显示的外阴事件，并从可用于分类目的^3（ 图1A）的每个事件生成功能。此外，还描述了使用Ripley的K函数分析外阴事件聚类。

最近有报道说，将外阴事件自动分类为不同的外阴模式^。两种外分泌模式，全囊融合（FVF）和吻跑融合（KNR）外血症（KNR）以前曾被描述为^{4，5，6，7。}在 FVF 期间，聚变孔扩张，囊泡被整合到等离子体膜中。在KNR期间，融合孔短暂打开，然后重新密封4，5，8，9，10。在发育中的神经元中发现了四种外血病模式，其中两种与FVF有关，两种与KNR有关。这项工作表明，FVF和KNR可以进一步细分为融合事件，在聚变孔打开后立即进入荧光衰变（FVFi和KNRi），或在荧光衰变开始前发生融合孔打开后出现延迟的外阴事件（FVFd和KNRd）（图1B）。分类器识别每个融合事件的外血病模式。在此处，此分析已整合到可安装在基于 Windows 和 Mac 的操作系统中的 MATLAB 中的 GUI 中。所有分析文件都可以在 https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing 或
https://github.com/GuptonLab

研究方案

1. 选择数据集和目录

1. 要选择数据集进行分析，请单击 "查找数据集 "按钮（图 2A，红色框 1），以导航到存放数据的文件夹（例如 RawData 文件夹）。数据文件将自动将数据文件填充为列表。文件夹中可以有多个数据集。
2. 单击 "选择目录 "按钮并选择将分析文件存入的目录（例如测试）（图 2A，红色框 2）。当按下分析按钮时，将在该目录中创建一组文件夹和完成的分析文件以及中间临时图像。如果不选择目录，将产生错误。

2. 设置像素大小和帧速率

1. 在适当的"帧速率"或"像素大小"框（图 2A，绿色框）中填写图像的适当帧速率和像素大小。如果没有提供值（它们被设置为默认的"0"），则程序将搜索与文件相关的元数据，以查找帧速率和像素大小。如果找不到这些值，程序将默认为每像素用于测量，并且按帧默认用于时间点。
   注:在提供的示例中，帧速率为 100，像素大小为 0.08。

3. 选择或制作口罩

1. 使用 "掩码器制造者 "按钮自动创建文件数据集列表中数据的单元格掩码（图 2A，蓝色框）。使用 "面具制造商 "按钮后，将创建选定目录中的新文件夹，称为"面具文件"。"运行指示器"在运行时会变黄，完成后返回绿色。
   注:数据文件列表中每个文件的掩码将从图像文件的前 10 帧（如果图像文件中少于 10 帧，则从所有帧创建），并使用正确的命名方案（如下所述）沉积在掩码文件夹中。
2. 确保掩码文件自动填充掩码文件列表。用户可以直接进行分析。
   注:始终目视检查掩码文件，并确认它们捕获了整个感兴趣区域。数据文件的第一帧和掩码文件在选择时显示在 UI 上。（图2B）。在信号到噪声低的情况下，掩码制造商可能会产生错误，因此验证掩码文件是否合适对于质量控制至关重要。
3. 作为使用掩码制造商的替代方案，如果图像噪声信号不足，则在 ImageJ 中手动创建掩码。
   1. 首先，打开图像J中的原始图像文件（图3A）。
   2. 单击 Polygon 选择 按钮，然后单击以在单元格周围绘制一个面罩。完成后，双击最后一点完成多边形。
   3. 完成后，导航到 编辑|选择|创建掩码 （图3B）。将根据多边形绘图创建新的倒置面罩。在选定的目录中将掩码保存在指定的掩码文件夹中。掩码文件命名方案必须匹配相应的个人数据文件，然后是"_mask_file"。例如，如果数据文件被命名为"VAMP2_488_WT_1.tif"，则相应的掩码文件必须命名为"VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif"。
   4. 使用 "查找掩码文件" 按钮导航到已存入的自定义掩码文件夹。面具将填充面具文件作为列表。
      注:在运行分析之前，为每个数据文件提供一个掩码非常重要。

4. 分析和功能提取

1. 选择目录和数据文件列表和掩码文件列表填充后，单击 分析 按钮（图 4A）。如果需要对外阴事件进行分类，则移到第 5 步。
   注: 分析 按钮单击将执行一系列自动任务来分析数据。它将创建选定目录中的单个文件夹以沉积分析的数据。运行时，"运行指示器"将从绿色变为黄色（图4A，红色框）。分析完成后，这将变回绿色。
2. 查找一个数据文件夹 （图 4B）， 其中包含一套完整的分析文件 （以及功能提取文件， 稍后将用于分类）， 根据每个数据文件 （图 4C）命名。
   注:以下部分包括这些分析文件的描述。

5. 外阴事件分类

1. 要通过自动检测同时对外阴事件进行分类，请在单击分析按钮之前检查分类复选框。对于每个外阴事件，为每个类分配 0-1 之间的概率分数。如果该类的概率分数为 0.5 >，则外阴事件被视为四个类之一。
   注:分析完成后，选定目录内将出现新的数据文件夹。文件夹将包含与每个图像文件对应的分析文件。

6. 使用里普利的 K 值对外分泌体的痉挛性分析

1. 创建单独的"神经质"和"索玛"面罩文件。首先，将索马从神经质中分割。没有公正的方法将索马从神经中分割，因此用户应该对调理实验视而不见，并使用最佳判断:建议一种没有明显神经延长的椭圆形。
2. 打开图像J/斐济。
3. 拖放掩码文件或使用 文件|打开 然后选择掩码文件。
4. 使用选色工具，单击面膜背景中的任何黑色像素，将颜色设置为黑色。
5. 使用多边形选择工具或徒手在索马周围绘制轮廓，将其与神经分离。这需要人工决策。
6. 单击 "编辑|选择|制作面具。新图像将打开，从图像的其余部分分割成圆形的索马。这将创建一个索马面具文件。
7. 无需移动绘制区域，请单击原始掩码文件的头。
8. 单击 "编辑|填充 填充圆索玛，以便只有神经保持面罩。
9. 获得单独的神经和掩码文件后， 保存 两个掩码文件。
10. 在马特拉布打开"neurite_2D_network"。
11. 在 MATLAB 中，使用所有分析数据导航到目录。
12. 将路径"面具名称"更改为新面具的名称，即"面具文件/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
13. 将"csv_file_name"更改为文件fluorescent_traces.csv位置，即"掩码文件/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv"。
14. 单击 "运行 "以将神经质掩码文件骨干化。这将创建一个骨架化版本的神经面膜文件，并将其作为 CSV 文件在掩蔽文件夹下沉积。
15. 接下来，生成一个CSV文件为索马。在马特拉布打开"CSV_mask_creator.m"。
16. 将"面具名称"放在索马面具名称的路径中，即"面具文件/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. 将"写字矩阵"更改为 csv 文件名以创建，即"掩码文件/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
18. 单击 "运行"。这将创建新的VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv文件。
19. 每个掩码文件重复 6.14。

7. 斯图迪奥设置

1. 打开 Rstudio 并打开ripleys_k_analysis。R 文件。
2. 通过转到工具|，在 RStudio 中安装包 "spatstat"安装包 和键入"spatstat"，然后单击 安装。
   注:此仅需要执行一次每个 Rstudio 安装。
3. 在每个会话开始时运行库吐口水。
4. 注意本例中的两个主要变量:"neuron_mask"和"neuron_datapoints"。神经元掩码指向要运行的一组掩码文件，即索马掩码文件。
   注:运行所有索马面具文件在一起，分开从Neurite面具文件，反之亦然。
5. 阅读要分析的每个神经元的掩码文件.csv。
6. 通过复制附加的 neuron_mask_n+1 同时运行多个文件。这将允许使用第 8 节中描述的脚本将 Ripley 的分析聚合在一起。
7. 现在检查第二个变量"neuron_datapoints"。
8. 阅读中。分析程序生成的X_fluorescent_traces.csv"文件（按所有extracted_R文件）与外阴事件的 x、y、t 位置以及 x、y 位置的神经特异性文件一起生成。这属于"neuron_datapoints"位置。
9. 在 RStudio 中选择代码|运行区域|全部运行。这将生成多个绘图，包括分组 Ripley 的 K 值以及密度图。
10. 通过出口|保存地块 将图像保存为|选择 适当的图像格式和目录，并输入适当的文件名称，然后单击 保存。
    注:热图的绘图功能在脚本中使用"绘图（密度（soma_data，0.4）"来调用。此处的数字"0.4"表示密度函数应如何平滑。它可以更改以以有意义的方式适合用户数据，但如果要在不同的热图之间进行比较，则它们之间的数字必须相同。
11. 从 Rstudio导出或保存图像。如果热图需要进一步编辑，请选择合适的文件类型 （SVG 或 EPS）。

8. 里普利的分析

注:Ripleys_k_analysis。R 文件还自动生成 Ripley 的 k 值图。运行整个脚本将自动运行下面提到的功能，但如果一个人希望单独运行脚本的每个部分或对分析进行更改，则详细包含该功能。

1. 首先，为每个单元格运行信封功能。此功能模拟完整的空间随机性 （CSR），以测试 Ripley 的外延事件点模式的 K 值。
   Data_envelope_1 = 信封 （soma_data_1， 凯斯特， 尼西姆 = 19， 保存芬斯 = 真实）
   Data_envelope_2 = 信封 （soma_data_2， 凯斯特， 尼西姆 = 19， 保存funs = 真实）
2. 接下来，将这些信封集中在一起，为团队创建一个 CSR 估计值:
   Pool_csr = 游泳池（Data_envelope_1，Data_envelop_2,...）
   接下来，运行所有数据点的 Ripley K 功能。
   Data_ripleys_k_1 = 凯斯特 （soma_data_1， 比率 = 真实）
   Data_ripleys_k_2 = 凯斯特 （soma_data_2， 比率 = 真实）
3. 完成后，将 Ripley 的 K 值汇集在一起，并根据以下命令引导其置信区间:
   数据池 + 池（Data_ripleys_k_1，Data_ripleys_k_2,...）
4. 具有以下命令的引导:
   Final_Ripleys_K = 瓦布洛克 （有趣 = 凯斯特， Data_pool）
5. 绘制数据。
6. 如果需要硬统计差异，则将学生化排列测试包含在口水统计包中，以测试点模式组之间的差异:
   Test_difference = 螺柱测试 （all_points_to_test， exocytic_events = 组， nperm = np） 。

结果

在这里，利用TIRF（总内部反射荧光）显微镜分析三个VAMP2-pHluorin在3DIV下表达神经元的外细胞事件。E15.5皮质神经元被分离，随后与VAMP2-普鲁林和电镀使用温克尔等人概述的协议，2016年和维塞尔曼等人，2011^{年11月，12}日。成像参数的方法如乌尔比纳等人所概述的，2018^年2月2日。简言之，TIRF显微镜用于每100ms对神经?...

讨论

使用外细胞检测和分析软件时，请考虑程序只接受无损压缩.tif文件作为输入。.tif图像文件可能是 8 位、16 位或 32 位灰度（单通道）图像。在输入之前，必须将其他图像格式转换为其中一种类型。供参考，此处使用的例子是 16 位灰度图像。

在自动检测过程中固有的，将处理减时图像集以进行自动背景减法和光模糊校正。对于背景减法，掩蔽文件的掩蔽区域外的像素在整个图?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R	R Core Team		https://www.r-project.org/
Rstudio	Rstudio, PBC		https://rstudio.com/